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방법 논문

폐쇄 루프 관성 마이크로 사용 하 여 환자 파생 기도 분 비에서 레이블 없는 호 중구 농축

5.9K 조회수

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DOI:

10.3791/57673

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2018년 6월 7일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Laboratory of Electronics, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Medicine, University of Pittsburgh, 4Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 5Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh

이 논문에서

요약

이 연구에서 임상 기도 분 비 물이 나선형 관성 마이크로의 폐쇄 루프 작업에서 레이블 없는 호 중구 분리 방법을 설명 합니다. 제안된 된 방법 분석 실험 임상 생체 외에서 다양 한 호흡기 질환에 대 한 확장 이라고 합니다.

초록

기도 분 비의 면역 관련 세포, 예, 호 중구, 대 식 세포, 림프 톨, 폐 질환, 연구 및 임상 목적을 위해 둘 다의 다양 한 평가를 주요 자원으로 사용 될 수 있는 큰 숫자를 포함. 그러나, 이기종 및 점성의 특성상 환자 점액, 거기 현재 없습니다 신뢰할 수 있는 분리 방법이입니다 환자 기도 분 비에서 호스트 면역 세포를 손상 하지 않는다. 이 연구에서 우리는 환자의 면역 평가 대 한 관성 마이크로 사용 하는 샘플 준비 방법 소개. 임상 샘플의 이종 유체 속성에 제안된 된 방법 1,000-fold 희석 하는 기도 분 비 샘플에서 호 중구의 95% 이상 복구와 깨끗 한 식 염 수의 밀리 리터. 초기 샘플 저수지에 집중된 출력 스트림에 재순환 하 여 높은 농도, 복구, 및 면역 세포의 순도 제공 됩니다; 재순환 관성 마이크로의 단일 실행 주사기 기반 작업에 교환으로 간주 됩니다. 나선형 마이크로의 폐쇄 루프 작업 제공 물리적 또는 화학적 방해 없이 백혈구 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)에 의해 증명-정렬 된 호 중구 elastase 출시를 유도.

서론

이후 셀 기도 분 비 물에 점액의 다량에 캡슐화, 생체 외에서 시험에 의해 백혈구의 기능 평가 방해 되었습니다 있다. Dithiothreitol (DTT)는 해리 cytological 분석 및 격리 된 셀1,2의 쾌활 생존을 제공 하면서 중재자의 검출에 대 한가 래를 균질 하 가장 일반적인 세포의 용 해 버퍼. 그러나, DTT 방해할 수 있습니다 기도 중 성구의 표면 바인딩된 항 같은 elastase myeloperoxidase (MPO) 릴리스2,3호 중구 기능 장애의 결과로. 따라서, 인간의 기도 호 중구 기능 몇 가지 연구와 말 초 혈액 호 중구, 폐4의 생리 적 특성을 드러내지 수 있습니다 실시 되었습니다. 한편, 관성 마이크로 다양 한 환자 biomatrices5,6에서 세포를 분리 하는에서 발전을 했다. 딘 끌어서 관성 리프트 힘 사이 평형 입자/셀 라벨 무료 입자 분리7를 수 있는 그들의 크기에 따라 정렬 합니다. 우리의 그룹은 이전 순환 종양 세포8,9, 혈액8병원 체, 세포는 현 탁 액 문화10,11, 를 위한 샘플 준비 방법 소개 12, 및 polymorphonuclear 백혈구 (PMNs) 혈액13,14에서.

여기, 다운스트림 시험관에서 분석 결과, 같은 호 중구 elastase (NE) 분석 결과 대 한 폐쇄 루프 관성 마이크로 사용 하 여 환자의 기도 분 비 물에서 면역 세포를 준비 하는 프로토콜을 소개 합니다. 셀/입자의 있는 셀/입자-의-관심은 제거 되어야 하는 임상 견본에서 일반적으로 관찰 되는 측면 방향에 상당한 중복 하는 경우에 특히 높은 농도 및 복구,이 메서드를 제공 합니다. 내부 벽 (IW)를 재순환 하 여-작은 mucin 집계 배경 액체 폐기물 저수지를 통과 하는 동안 큰 입자 또는 셀 입력된 샘플 튜브, 입자 또는 원래 저수지에서 셀의 관심 집중에 다시 집중. 임상 샘플의 이종 유체 속성에도 불구 하 고 제안된 된 방법 1,000-fold 희석 하는 기도 분 비 샘플에서 호 중구의 95% 이상 일관 되 게 복구 솔루션과 깨끗 한 식 염 수 (~ 1 mL). 대조적으로, 세포의 용 해 방법 샘플 조건에 따라 회수율 PMNs의 넓은 범위를 제공합니다. 제안 된 프로토콜 임상 도전 최소한 침략 적 절차와 생체 인식에서 섬세 한 세포 수확에 물리적 또는 화학적 중단 없이 레이블 없는 방식으로 백혈구를 캡처합니다.

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프로토콜

샘플 컬렉션은 피츠버그 대학 기관 검토 위원회 (IRB # PRO16060443, PRO10110387)에 의해 승인 되었다. 모든 실험은 적절 한 개인 보호 장비와 캐비닛 biosafety 아래 수행 됩니다.

1. 장치 제조 및 소프트 리소 그래피

참고: 표준 소프트 리소 그래피 기술을15,16 입니다 (PDMS) 아닌을 만드는 데 사용 했다.

  1. PDMS 전조를 기본 및 경화 에이전트의 10:1 비율로 섞는다.
  2. PDMS 전조 혼합물의 30 g 마이크로 가공 알루미늄 몰드에 부 어 (치수는 그림 1 참조) 및 100 mm 페 트리 접시에 PDMS 전조 혼합물의 20 g.
    참고: 페 트리 접시 지원 계층에 대 한 PDMS (3 m m)의 박막을 만드는 데 사용 됩니다. PDMS의 지원 레이어는 마이크로 걸쳐 균일 한 표면 물성을 제공합니다. 또한, PDMS 박막 유리 슬라이드에 사용할 수 있습니다. 특정 채널 치수와 마스터 몰드 설계와 마이크로 밀링 알루미늄 시트에 의해 조작. 이 연구에 사용 된 나선형 채널 한 입구와 두 개의 콘센트, 효율적인 크기 기반 분리에 대 한 24 m m 8mm에서 증가 하는 반경 8 루프 나선형 아닌 했다.
  3. 아니 거품 표면에, 일반적으로 5-10 분 사용 집 진공은 desiccator 표시 됩니다 때까지 드를 진공 desiccator로 형과 페 트리 접시를 놓습니다.
  4. 진공 놓고 1 시간 동안 90 ° C 오븐에서 형과 페 트리 접시를 놓습니다.
    참고: 열판 또는 다른 난방 도구는 오븐 대신 사용할 수 있습니다.
  5. 오븐에서 형과 페 트리 접시를 제거 하 고 10 분 동안 실내 온도에 냉각 수 있습니다.
  6. 신중 하 게 개요를 잘라 하 고 2mm 구멍을 뚫는 사용 하 여 장치에 액체 접근 구멍을 펀치.
    참고: 펀치의 크기는 배관 또는 유체 가이드의 크기에 따라 달라질 수 있습니다.
  7. 준수는 소자의 채널 쪽을, PDMS의 두꺼운 필름 테이프와 먼지를 제거 하는 집게와 신중 하 게 껍질.
  8. 장치 및 공기 플라즈마와 일반 PDMS와 채권 일반 PDMS (그림 1A)의 준비 지원 계층에 두 채널 측면을 취급.
  9. 50 m m x 70 m m 유리 슬라이드에 칩을 놓고 접합 강도 향상 시키기 위해 적어도 30 분 동안 70 ° C 오븐에 배치 합니다.

2. 기계적으로 통풍된 환자에서 tracheal 분 비 컬렉션

참고: Tracheal 분 비 물은 얻을 수 있습니다 기계적으로 통풍된 환자에서 정상적인 일상적인 기도 관리 중 표준, 성인 통풍된 환자를 수용 하기 위해 기존의 방법에서 변경 하는 프로토콜을 사용 하 여. 샘플 드 식별 하 고 즉시 처리를 위해 전송 했다.

  1. Tracheal 포부를 표시 하는 경우 카 테 터를 사용 하 여 기도 분 비 물을 추출.
  2. Endotracheal 튜브로 테 신중 하 게 반 방법은 사전 및 미리 채워진된 10 mL 주사기에서 0.9% 메 마른 정상적인 염 분의 5 mL 주입.
  3. 카 테 터를 완벽 하 게, 고급 또는 저항을 만났다, 분 비 물 발음 고 메 마른가 래 수집 용기에 수집.
  4. 메 마른가 래 컨테이너 tracheal 비의 10 mL를 수집 하 고 얼음에 그것을 배치. 즉시 처리를 위해 샘플을 보냅니다.

3. tracheal 분 비 샘플 준비

참고: 모든 실험 biosafety 적절 한 개인 보호 장비와 캐비닛에서 수행 되어야 합니다.

  1. 1 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (10 배 희석)에 대 한 플라스틱 10 mL 주사기를 사용 하 여 9 mL에 기도 분 비 샘플의 분산. 무딘 피 펫을 사용 하 여 균질 점액 샘플.
  2. 큰 덩어리 또는 마이크로 접근 구멍 또는 채널을 차단할 수 있는 혈전을 제거 하려면 40 µ m 나일론 셀 스 트레이너와 희석제를 변형. 처리 후 얼음에 샘플을 놓습니다.
  3. 100 x 양의 희석된 정지 x 1000 결과 PBS 버퍼를 사용 하 여 각 샘플의 희석 액을 분산. 전체 분리 작업 중 얼음에 샘플을 놓습니다.

4. 실험 설정

참고: 모든 실험 biosafety 적절 한 개인 보호 장비와 캐비닛에서 수행 되어야 합니다.

  1. 각 4 개의 나선형 microchannels (그림 1B)의 일정 한 흐름을 적용 유체 가이드와 함께 PDMS 칩을 조립.
    참고: 4 채널 처리량 증가를 병렬화, 결과 서 스 펜 션의 볼륨 및 셀 밀도의 최적화에 의해 사용 되었다. 유체 가이드 설계 및 명확한 수 지와 스테레오 리소 그래피 형식 3D 프린터와 함께 했다. 입구와 출구 포트 유체 가이드의 연결 및 작업 중 안정적인 씰링의 용이성에 대 한 여성 Luer 커넥터를 사용합니다.
  2. 입구, 안 벽 (IW) 콘센트와 유체 가이드의 외벽 (아야) 출구 포트 1/16 인치 남성 Luer 커넥터를 연결 하 고 샘플 정지에 실리콘 튜브를 연결.
  3. 무딘 도움말 샘플 저수지의 바닥에 도달 하는 출구 및 입구의 양쪽 끝을 삽입 합니다.
  4. 연동 펌프 유입 배관으로 연결 합니다.
  5. 샘플 저수지에 유입 튜브와 IW 콘센트 튜브의 끝을 놓고 폐기물 저수지 (그림 1 c, D)에 아야 콘센트 배관의 끝을 놓습니다.
  6. 샘플 저수지에 칼슘과 마그네슘 없이 필터링 된 PBS의 50 mL 튜브를 배치 합니다.
  7. 장치를 낮은 흐름 속도 (~ 1 mL/min)에서 펌핑 시작 합니다.
    참고: 때 거품에에서 캡처됩니다 채널, 기포를 불안정 하 게 트위터와 채널의 상단을 밀어. 장치는 완전히 버퍼 솔루션 때, PBS 튜브 준비 기도 분 비 샘플 튜브를 변경 합니다.
  8. 샘플 샘플 저수지에 놓으면 연동 펌프에 전환 하 고 4 mL/min (그림 1 c, D)에 흐름 속도 설정 합니다.
  9. 샘플 볼륨에 지정 된 볼륨 (~ 1 mL)에 도달 하면, 작업을 중지 하 고 실리콘 튜브를 분리.
    참고: 제안 된 메서드는 희석제의 큰 볼륨을 감소에 더 효율적입니다 (> 50 mL)를 마이크로 원심 튜브 볼륨 (~ 1 mL) (그림 2).

5. 교류 Cytometry 분석

참고: 분리 방법 (마이크로 및 세포)를 비교, cytometry 면역 형광 검사와 함께 사용 되었다.

  1. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-활용된 마우스 반대로 인간 CD66b 단일 클론 항 체 및 allophycocyanin (APC)-마우스 안티 인간 CD45 단일 클론 항 체는 초기 정지 (단계 3.3) 및 결과 정지 (단계 4.9)를 (200 µ L 활용 추가 각 항 체)의 1시 25분의 비율에서 v/v.
  2. 30 분 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 샘플을 품 어.
  3. 교류 cytometer는 PMNs 척도 두 샘플을 분석 합니다.
    참고: FITC APC 이중 긍정, CD45 긍정적인, CD66b 긍정 이며 인구 neutrophils 것 여겨졌다. 복구는 입력 및 결과 서 스 펜 션의 총 세포 수의 비율에 의해 계산 되었다.

6. 네브라스카 릴리스 분석

참고:는 격리의 기능을 비교 메서드에서 마이크로 및 세포, 호 중구는 NE 분석 결과 키트 사용 되었다.

  1. PMA (분석 결과 키트에 제공 된) 각 결과 정지 (단계 4.9에서 얻은) 50의 최종 농도를 추가 nM.
  2. 2 h 37 ° C에서 샘플을 품 어.
  3. 10 분에 대 한 300 x g에서 정지 원심
  4. (분석 결과 키트에 제공 된) 96 잘 접시에 각 상쾌한의 10 µ L를 전송 합니다.
    참고: 플랫 바닥와 검은 폴리스 티 렌 96 잘 microplate 뿐만 사용할 수 있습니다.
  5. 각 우물에 희석된 분석 결과 버퍼 (분석 결과 키트에 제공 된)의 90 µ L를 추가 합니다.
  6. Elastase 기판 (Z 날개 날개 날개 날개 2Rh110, 분석 결과 키트에 제공 된)의 10 µ L를 추가 합니다.
  7. 1.5 h 37 ° c.에 대 한 품 어
  8. 96 잘 접시 485의 여기 파장에는 fluorometer를 사용 하 여 읽기 및 525의 방출 파장 nm.
    참고: 네브라스카의 수준 흐름 cytometry 분석에서 PMN 수로 분할 되었다.

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결과

우리 모두 DTT mucolysis 및 마이크로 분리 (그림 3A)와 투명 한 면역 세포 정지 달성. 마이크로 분리 수집 105 PMNs x 4.40 평균 (2.1 x 10 x 105 PMNs 5.604 n = 6) 기도 분 비 샘플에서 1,000-fold 희석 (50 mL 전체 볼륨) 깨끗 한 서 스 펜 션의 1 mL. 94.0 %PMNs 초기 희석제에 비해 (CD66b+/CD45+) 6 임상 샘플 작은 볼륨에서 지속적으로 복구 했다. 그러나, DTT mucolysis 메서드 보여 53.5% 복구 평균 중요 한 샘플--예제 유사 (30.8 96.0%) (그림 3B)입니다.

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토론

관성 마이크로 입자 및 셀의 크기5,18,,1920에 따라 마이크로 채널에서 특정 측면 위치에 지역화 합니다. 학장의 결합된 효과의 한 힘 및 곡선된 아닌, 큰 입자 또는 호 중구에 관성 리프트 힘을 끌어 (> 10 µ m) 있는 내부 채널 및 작은 입자, 점액 집계, 및 파편 6 보다 작은 µ m 위치 특정 흐름 속도에서 채널 밖에10,11,,1314조건.

그러나, 특히 때 입자의 분리 크기 범위 또는 관심의 셀 다른 셀/입...

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공개 사항

저자는 여기에 설명 된 기술에 특허 출원을 제기 했습니다.

감사의 글

이 작품은 NIH U24 샘플 살려주는 분석 결과 프로그램 (U24-AI118656) 뿐만 아니라 NIH/NIAID (R21AI119042)에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PDMS 전구체Dow corning184 SIL ELAST KIT 3.9KG10:1 비율 염기와 경화제
VWR 중력 대류 오븐VWR414005-128PDMS 전구체 90°C에서 경화
100mm 페트리 접시VWR89000-324PDMS 제작 지지층
Harris Uni-core 펀처Sigma-aldrichWHAWB1000762mm 직경 또는 튜브 크기에 따라
기타 공기 플라즈마 기계Femto Science귀여운PDMS 장치용 표면 플라즈마 처리 바닥.
2" x 3" 유리 슬라이드TED PELLA, INC.2195PDMS 장치 Masterflex
스풀 백금 경화 실리콘 튜빙 지원, L/S 14Cole-ParmerEW-96410-14미세유체 및 연동 펌프용 튜빙
1/16인치 Luer 커넥터, 남성Harvard 장치PC2 72-1443유체 가이드용 커넥터
50mL Falcon tubeCorning21008-940샘플 수집 및 준비
인산염 완충 식염수, 칼슘과 마그네슘 없는 1X코닝45000-446 시료를 희석하기 위한 완충 용액
Halyard 폐쇄 흡입 카테터, 팔꿈치, 14F/ 채널 4.67mmHALYARD HEALTH22113기관 분리 흡입 카테터
0.9% 멸균 일반 식염수, 10mL 사전 충전 주사기BD PosiFlushNHRIC: 8290-306547환자로부터 기관 분리 수집을 위해
SecurTainer™ III 표본 용기, 20mLSimport1176R36멸균 가래(기도 분비물) 수집 용기
주사기와 Luer-Lok 팁, 10mLBDBD309604점액 샘플을 피펫화하고 표본 튜브 BD의 바닥에 도달하기 위해
; Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok  팁BD: 피펫으로 점액 샘플을 균질화하고 샘플 튜브
40 µ의 바닥에 도달하십시오. M 나일론 셀 스트레이너 Falcon21008-949미세유체 접근 구멍 또는 채널을 막을 수 있는 큰 덩어리 또는 혈전을 제거합니다.
연동 펌프(Masterflex L/S 디지털 드라이브)Cole-ParmerHV-07522-30미세유체역학
작동 BD LSR II 유세포분석기BD BioscienceLSR II 유세포분석기세포 회수율 정량화
플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 접합 마우스 항인간 CD66b 단클론 항체BD Bioscience561927유세포분석기 분석을 위한 호중구 면역염색
Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibodyBD Bioscience561864유세포 분석기 분석을 위한 호중구 면역 염색
플레이트 리더Thermo Fisher scientific구 엘라스타제 분석을 위한 Varioskan 플레이트 리더, ex485/em525
호중구 엘라스타제 분석 키트Cayman Chemical600610호중구 기능 평가
Fluoresbrite YG 마이크로스피어 10.0&마이크로; m폴리사이언스, Inc.18140-2미세유체역학에서 백혈구 궤적을 발현하는 형광입자
호중

참고문헌

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