식물 감염 테스트: 스프레이 식물 병원 체 Magnaporthe Grisea 와 상처-중재 접종

요약

여기, 우리 식물 병원 체와 식물 독성 테스트 프로토콜을 제시 Magnaporthe grisea. 이 보고서 균 분리의 pathotypes의 대규모 검열을 하 고 분자 번 식 하는 동안 식물의 저항 메커니즘을 이해 하기 위한 훌륭한 시작 지점으로 제공.

초록

식물 병원 성 곰 팡이 의해 잠재적인 위협 으로부터 방어 하는 강력한 시스템을가지고 있습니다. 그러나 농업으로 중요 한 식물에 대 한, 현재 조치 같은 병원 체에 대처 하기 위해 너무 보수적인 증명 그리고, 따라서, 충분 하지 효과적인, 그리고 그들은 수 있습니다 잠재적으로 포즈 환경 위험. 따라서, 그것은 매우 내성 germplasm의 식별, 격리 및 저항 유전자의 특성 및 분자 사육을 통해 자연스럽 게 제어 식물 질병을 호스트 저항 요소를 식별 하는 데 필요한 저항 하는 재배 품 정. 이와 관련, 번 식 하 고 식물 저항 유전자를 개발, 신속, 정확 하 고 대규모 접종 메서드를 설정할 필요가 있다. 쌀 버섯 모양 병원 체 Magnaporthe grisea 원인 심각한 질병 증상을 폭발 하 고 손실을 항복. 최근에, M. grisea 식물 곰 팡이 병원 체 상호 작용의 메커니즘을 공부에 대 한 모델 생물으로 떠오르고 있다. 따라서, 우리 보고 M. grisea위해 특정 식물 독성 시험 방법의 개발. 이 메서드는 conidial 현 탁 액을 분무 접종 및 균 사체 큐브 또는 conidial 서 스 펜 션의 방울 부상 접종에 대 한 제공합니다. 분리 된 쌀 잎 부상 접종 방법의 주요 단계는 호스트 침투 저항으로 인 한 간섭 방지 식물 잎에 상처를 만드는 것입니다. 이 M. grisea 격리의 pathotypes의, 정확, 신속 하 고 대규모 심사에 기여 스프레이/부상 프로토콜. 이 통합 하 고 체계적인 식물 감염 방법 식물 병리학에서 문제의 광범위 한 관점을 확보에 대 한 훌륭한 출발점 될 것입니다.

서론

쌀 폭발, M. grisea를 기인한 쌀 품종 전세계^1,2에 대 한 가장 심각한 질병 중 하나입니다. 프로세스는 M. grisea 감염 호스트 식물 conidia 생산 및 표면 부착, conidia 발 아 및 appressorium 형성, 침투 못 감염 hypha 차별화의 형성을 포함 하 고 질병 확산 ³. 이러한 모든 단계는 많은 다른 식물 병원 성 곰 팡이에서 일반적이 고, 실제로, 모든 단일 단계 봉쇄 호스트 식물의 감염을 방지. 때문에 그것의 경제 중요성 및 유전 추적성, M. grisea 식물 곰 팡이 병원 체 상호 작용^1,4의 메커니즘을 공부에 대 한 모델 생물으로 떠오르고 있다. 따라서, 기본 균 pathogenicity 및 심사 및 디자인 소설 후보 대상 유전자의 식별 분자 메커니즘을 명료 하 도움이 될 것입니다 이러한 발달 단계 M. grisea 에 분자 기초 공부 살 균 제⁵.

최근 보고서 M. grisea 감염에 관한 사전 침투 단계, 특히에서 conidiation, appressorium 형성, 침투 못 및 전염 성 성장^3, 의 분자 메커니즘에 초점을 맞춘합니다 ⁶. 따라서, M. grisea 감염 테스트 상세한 프로토콜을 개발 하는 것이 필수적입니다. 여기, 우리 conidial 서 스 펜 션와 M. grisea의 사체 플러그와 상처의 접종 감염 스프레이 중재 분석을 활용 한 감염 테스트에 대 한 자세한 방법 제시. 이 보고서는 프로토콜, conidiation 솔루션의 준비와 바로 플러그 중재 접종 M. grisea와 식물의 종자, 문화에 중점을 둡니다. 다음이 단계는 아래의 세부 사항 그리고 방법의 전체 워크플로 보여주는 회로도 보기에 설명 하 고 전형적인 병 변은 각각 그림 1 과 2에 표시 됩니다.

프로토콜

1. 스프레이 접종 M. grisea Conidia의 서 스 펜 션

1. M.grisea 에 대 한 곰 팡이 문화
   1. 곰 팡이 긴장에 대 한 오트밀 토마토 agar (OTA) 문화 매체를 준비 합니다.
   2. 오트밀의 30-50 g를 무게, 소 주/이온된 수 (ddH₂O)의 800 mL에 이것을 추가 하 고 전기 냄비에 30 분을 위한 혼합물을 비등.
   3. 거 즈 조각을 통해 비 커에 끓인된 오트밀 주스를 필터링 합니다.
   4. 토마토 주스와 한 천 20g 150 mL 비 커에 여과 액을 더하고 ddH₂O 최대 1000 mL.
2. 실험 자료의 준비
   1. 3 d ddH₂O에서에서 벼 (Oryza sativa) 품종 Lijiangxintuan-heigu (LTH)의 약 50 씨앗을 담가 또는 보 리의 약 50 씨앗을 담가 (Hordeum vulgare 이력서 골든 약속) ddH₂오 약 1 d.
   2. 촉촉한 거 즈에 쌀 이나 보 리의 씨앗을 포장 하 고 직경 10 cm x 10 cm에서 28 ° c.의 약 30 접시에 축축한 필터 종이에 그들을 발 아 쌀 종자 발 아에 약 2-3 d, 보 리 씨앗 발 아 시간이 약 2 d. 상대 습도 온실에서 대략 70% 이다.
   3. 압력가 화분 용 흙 및 급수를 사용 하 여 냄비에 쌀 이나 보 리의 묘를 설치 하 고 질 석의 계층으로 그들을 커버.
   4. 1 약 25 ° C에서 캐비닛 적합 한 유리 공장 또는 성장에 식물을 배치 ~ 2 주.
   5. 원형에서 필터 종이의 3 층 (각 동그라미는 8 cm 직경 있어야 함) 무 균 수술가 위로 잘라 100mm 살 균 플라스틱 접시에 그들을 배치.
   6. 필터 종이를 각 접시 ddH₂O를 추가 합니다.
   7. 필터 종이 완전히 젖은 것을 확인 하지만 여분의 물 추가.
   8. 진공 펌프를 가진 어떤 과잉의 물을 제거 합니다.
   9. 쌀/보 리를 지원 하기 위해 문화 접시에 장소 2 살 균 이쑤시개 잎; 이쑤시개는 공간 ~ 2-3 cm 떨어져.
   10. 씨앗을 파 종 후 2 주 쌀의 나뭇잎을 수집 하거나 보 리 7 d의 잎 씨앗을 파 종 후.
   11. 쌀/보 리의 묘 목 4-6 잎을 사용 하 여, 정상에서 ~ 5 센티미터에 줄기의 아래 부분을 잘라 하 고 나뭇잎을 수집 합니다.
3. 스프레이 접종 프로토콜
   1. 문화 ~ 4 d 서 모스 탯 인큐베이터 (25 ° C)에서 OTA 접시에 곰 팡이 부담.
   2. DdH₂O 0.5-5 mL 피 펫 각 4-하루-오래 된 접시를 사용 하 여 ~ 2 mL를 추가 합니다.
   3. 접종 루프와 사체 잔해에 M. grisea 야생-타입 긴장과 돌연변이 스트레인의 사체를 다쳤어요.
   4. 사체 잔해를 수집 하 고 새로운 OTA 접시에 그것을 전송. 받아 사체 파편 타격 건조 깨끗 한 벤치에.
   5. 24-48 시간 (10 h) 밤에 25 ° C (14 h) 하루에 23 ° C에서 온실에서 conidia의 성장에 필요한 습도 되도록 거 즈의 3 레이어 플레이트 커버.
   6. 각 접시 ddH₂O의 2 개 mL를 추가 하 고 뒤에 렌즈 종이의 2 층을 통해 여과 멸 균 면봉으로 부드럽게는 conidia를 다쳤어요. 문화 매체의 표면을 긁을 조심 해야.
   7. 100-1000 µ L 피펫으로 새로운 50 mL 튜브에 conidia 현 탁 액을 전송 합니다.
   8. 25 ° c.에 x g 5000의 최소한 5 분 동안 원심 분리기
   9. 제거는 상쾌한 고 mL 당 2 × 10⁴ conidia 0.025% (v/v) 트윈 20 솔루션에에서 주려고 펠 릿 resuspend. 트윈-20 솔루션은 일반적으로 약 10-20 mL.
   10. 휴대용 분무기에 포자 현 탁 액을 붓는 다.
   11. Spay 2 주 된 쌀 묘 또는 보 리 쌀 잎에 conidial 서 스 펜 션의 약 10 mL 보 리 7-하루-오래 된 묘 목의 잎 하 고 0.025% (v/v) 트윈 20 솔루션 컨트롤 식물 25 ° c ~ 24 h. 스프레이 대 한 어두운, 습 한 약 실에서 그들을 품 어.
   12. 12 h photoperiod 잎 25 ° C에서 형광등 불빛 아래에서 또 다른 습 챔버로 전송.
   13. 접종 후 5 d에 질병 증상을 기록 합니다. 길이 ~ 6 cm의 병 쌀/보 리 잎을 검사 합니다. 표준 평가 국제 쌀 연구 연구소 (IRRI)의 폭발 저항에 대 한 채 점 시스템에 따라 이다. 폭발 저항에 대 한 채 점 시스템의 세부 정보는 표 1에 나와 있습니다.
   14. 사진 테스트 긴장의 감염을 평가 하는 나뭇잎. 감염 병 변 3.6 c m²당 수로 평가 했다.

2. 접종 균 큐브 또는 방울 Conidial 정지의 M. grisea 부상

1. 분리 된 쌀/보 리 잎;의 주요 혈관에 3 2-3 cm 긴 상처를 긁어 해부학 바늘을 사용 하 여, 알아서 하지 잎에 침투.
2. 이쑤시개에 긁힌 것된 잎을 넣고 0.02% (v/v) 트윈 20 솔루션 방울의 층을 형성 하는 잎에 스프레이.
3. OTA 접시에서 각 M. grisea 스트레인 (야생-타입, 돌연변이, 보완 긴장, 또는 다른 테스트 긴장)에 대 한 0.5 c m x 0.5 c m 바로 플러그를 잘라.
4. 바로 플러그를 넣어 또는 부상에 conidial 서 스 펜 션의 25 µ L 방울 단풍 잎 3-8 d의 습기 챔버에 25 ° c를 품 어.
5. 5-7 d 후 접종에 장애를 검사 합니다. 시험 방법은 같은 스프레이 접종 방법으로 (단계 1.3.13 참조).
6. 길이 ~ 6 cm의 병 쌀/보 리 잎을 검토 하 고 테스트 긴장의 감염을 평가 하기 위해 사진을. 감염 병 변 3.6 c m²당 수로 평가 했다.

결과

기술에 대 한 전체 워크플로 그림 1에 표시 됩니다. 14 일 된 취약 밥 묘 종에 식물 감염 분석 수행 (O. sativa 이력서 공동-39) 취약 7-하루-오래 된 보 리 잎 또는 (H. vulgare 이력서 골든 약속)^7,,89. 쌀 잎에 감염에 대 한 테스트, M. grisea 야생-타입 변형과 P131 Com1 삭제 돌연변이 스트레인의 conidial 정지 (⁵ 포자/10ml x 1.0) 준비 되었고 그 후 14 일 된 취약의 잎 칼 집에 살포 다음 5 d¹⁰에 대 한 촉촉한 실에 보관 했다 공동 39 묘 P131 주사 공동-39 잎 ...

토론

식물 질병 저항 유전자 곰 팡이 병원 균^1,12를 포함 하 여, 병원 균에 의해 감염 방지에 필수적인 역할을 재생 합니다. 쌀 폭발 병원 체 인구 구조의 특성을 이해 하 고 식물 저항 유전자⁴를 식별 하는 모델로 사용 되었습니다. 따라서, 그것은 질병 저항 유전자를 지속적으로 재배 될 수 있는 질병 저항 식물을 식별 하는 농업 식물의 주요 품종의 avirulence genotypes을 검사 하는 데 필요한. 또한, 필드 병원 체의 avirulence genotypes의 장점을 호스트 종류^12,13의 다른 저항 genotypes의 합리적인 분배 해야. 그러나, 현재 접종 방법 저항 및 병원 체 식별^14,

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
여과지	GE 헬스케어 브랜드(스웨덴)
50-mL 튜브	CORNING(Amercia)	430290
원심분리기	Eppendorf(Amercia)	5804R
배양 접시	Thermofisher(Amercia)	150326
0.5-5 mL 피펫	Eppendorf
100-1000uL 피펫	Eppendorf	4920000083
진공 펌프	Leybold	D25B
해부 바늘	FST	26000-35
인큐베이터	MEMMERT	PYX313
접종 링	Greiner Bio One	731175

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