방법 논문

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

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DOI:

10.3791/57685

2018년 6월 7일

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이 논문에서

요약

여기 우리가 설립된 피하 종양에서 종양 면역 및 비 면역 microenvironment의 구성 요소를 풍부 하 게 분리 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 종양 면역 침투 및 비 면역 종양 분수는 종양 면역 microenvironment의 포괄적인 특성화를 허용할 수 있는 별도 분석에 대 한 수 있습니다.

초록

종양 면역 microenvironment (시간) 최근 특히 immunotherapies에 대 한 단단한 종양에서 치료 응답의 중요 한 중재자로 인정 받고 있습니다. 최근 임상 발전 immunotherapy 정확 하 고 철저 하 게 종양 및 그 관련된 면역 침투 특성 재현 방법에 대 한 필요성을 강조 표시 합니다. 종양 효소 소화 및 흐름 cytometric 분석 허용 광범위 한 특성 수많은 면역 세포 하위 집합 및 고기; 그러나, 분석의 깊이 종종 fluorophore 제한 패널 설계 및 큰 종양 샘플을 확보 하는 필요의 희귀 면역 인구를 관찰에 의해 제한 됩니다. 따라서, 우리는 분리 및 농축 비 면역 종양 구성 요소에서 종양 면역 침투에 대 한 효과적이 고 높은 처리량 방법을 개발 했습니다. 설명된 종양 소화와 밀도 기반 원심 분리 기술은 종양 및 종양에 대 한 별도 특성 면역 침투 분수 및 세포 생존을 유지 있으며 따라서 종양의 광범위 한 특성을 제공 합니다 면 역학적 상태입니다. 이 방법은 하는 광범위 한 공간 면역이 단단한 종양에서 더 일관 된 전체 종양 면역학 프로 파일링 기법에 대 한 필요성을 보여주는 사용 되었다. 이 방법은 피하 고체 murine 종양; 면 역학적 특성에 대 한 효과적이 고 융통성 있는 기법을 제공 하는 전반적으로, 이 도구를 사용 하 수 있다 더 나은 종양 면역학 기능을 특성화 하는 등, 소설 immunotherapeutic 전략의 전 임상 평가.

서론

진압 시간 최근 암의 각 인으로 인정을 받고 있다 그리고 immunotherapy1그들의 민감성을 완화 뿐만 아니라 개발, 진행, 그리고 고체 종양 암의 보호에 중요 한 역할을 알려져 있습니다. 에 수많은 세포 하위 집합 및 고기, 종양의 면 역학적 상태에 중요 한 통찰력을 제공 하는 모두는 구성 됩니다. 이러한 면 역학적 하위 집합 추가 함께 타고 난 및 적응형 면역 반응2,3의 대다수를 구성 하는 림프 구 또는 골수성 근원의 세포로 층 화 될 수 있다. Immunotherapeutic 전략 (즉, 검사점 면역 억제제, 공상 항 원 수용 체 T-세포, ) 튼튼한 암 유발 가능성이 있는 암 immunotherapy 분야의 최근 발전 증명 재발; 그러나, 그들은 상대적으로 단단한 종양 암4,5에서 효과 유지. 수많은 그룹 시간 치료 성공6,7을 재생할 수 및 따라서, 거기에 특별히 초점을 맞추고 전 임상 설....

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 베일 러 대학의과 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 종양 수확 및 소화

참고: 수확에 필요한 시간은 3-5 분/종양, 및 처리에 필요한 시간 1 ~ h + 2-3 분/종양.

  1. 이산화탄소 흡입 하 여 마우스를 안락사와 머리 오염을 방지 하기 위해 수확 하기 전에 70% 에탄올과 아래로 각 마우스 스프레이. 수술로 쥐에서 피하 종양을 제거 하 고 종양 어떤 오염 조직 (즉, 머리, 피부, 복 막, )의 무료 인지 확인. 각 종양 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 24-잘 접시에서 없이 기본 RPMI 1640 미디어의 1.8 mL에 놓습니다. 큰 수확에 대 한 계속 판 찬 세포 생존 능력을 유지 하기 위해 얼음에.
    참고: 불 임이 필요한 경우 모든 종양 ╂ biosafety 어떤 추가 단계 뿐 아니라 불 임 수술 도구 (즉, 가 위, 집게, ), 캐비닛에서 필요 합니다. 0.5-1 ㎝ 사이 가장 긴 직경이 종양은 최적의 그리고 더 큰 또는 작은 종양 시 약의 스케일링 필요 합니다.
  2. 가 위를 사용 하 여 각 잘 내

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결과

우리의 결과 프로토콜에 설명 된 대로 비 면역 종양 구성 요소에서 분리 할 때의 중요 한 혜택을 보여 줍니다. 또한, 설립된 단단한 종양의 중요 한 면역학이 설명한 방법을 사용 하 여 설명 합니다.

많은 종양 분리 기술로 중요 한 문제는 가혹한 소화 조건 (즉, 높은 온도, 부적절 한 영양 공급, )의 결과로 수시로 샘플 생존 능력의 손실. 설명된 소화 방법의 사용 하거나 밀도 없이 그라데이션 중간 농축, cytometry (그림 1A)에 의해 평가 약 70-90% 총 세포 생존 능력을 제공 합니다. 유사한 viabilities에는 때까지 관찰 되었다 농축 하 고 종양이이 방법 (그림 1

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토론

에 다양 하 고 복잡 한 세포 구성 성분과 분자의 구성 됩니다. 최근 기록은이 환경의 정확한 특성 치료 성공 또는 실패의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다 식별할 수 있습니다 심지어 치료 저항 메커니즘 제안. 예를 들어 intratumoral 수준 (즉, MDSCs, T 규정 하는 세포, ) 다양 한 면역 세포의 증가 이펙터 면역 반응을 완화를 immunotherapeutic 효과 파기 됩니다. 다른 한편으로, 이펙터 면역 인구 (예를 들어, 종양 관련 CD8 + T 세포, 자연 킬러 세포, T 보조 세포)의 증가 intratumoral 존재 치료 성공의 강력한 predictors 수 있습니다. 종양 면역학 상태를 정확 하 게 나타내는 것을 계속 하는 또 다른 특성은 종양 세포 자체의 phenotypic 특징 이다. 이 포함 하는 다양 한 면역 ligands, 효소, 또는 겨냥 downregulating 이펙터 면역 반응 분자의 표현 (즉, PD-L1, PD-L.......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

JMN 국립 연구소의 종합 의료 과학 (T32GM088129)과 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (F31DE026682)에서 재정 지원의 건강의 국가 학회 둘 다 인정합니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다. 이 프로젝트 또한 NIH (P30 AI036211, P30 CA125123, 및 S10 RR024574)와 조 엘 M. Sederstrom의 전문가 지원 자금 Cytometry 베일 러 의과대학에서 셀 정렬 코어에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
6주에서 12주 된 수컷 C57BL/6 마우스Jackson Laboratory 우리의 종양 연구에 사용된 N/A
MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line협력자로부터 획득됨 N/AE6/E7 HPV 항원이 쥐 편도선 상피암 세포주를 발현하고 있음 
70% 이소프로필 알코올 EMD 밀리포어 PX1840
쥐 수술 도구 키트세계 정밀 기기MOUSEKIT주로 가위, 핀셋, 메스만 필요합니다. 
24웰 플레이트 덴빌 사이언티픽 Inc.T1024또는 24웰 플랫 바닥 플레이트. 
RPMI-1640 매체Sigma-AldrichR0883
콜라겐분해효소 I EMD Milipore234153
Collagenase IVWorthington Biochemical CorporationLS004189
DNase I Sigma-Aldrich11284932001
Low Speed Orbital ShakerBioExpress(공급업체: Genemate) S-3200-LS또는 어떤 궤도 쉐이커. 
온도 조절 인큐베이터Fisher Scientific13-255-27또는 기타 온도 조절 인큐베이터
FBSSigma-AldrichF8192
EDTAAMRESCOE177
1 mL 피펫 및 팁Eppendorf13-690-032또는 기타 피펫 및 팁
40 um Cell StrainersFisher Scientific22363547
50mL 원심분리기 튜브Denville Scientific Inc.C1062-P
15mL 원뿔형 튜브Denville Scientific Inc.C1012
10mL Luer-Lok 주사기(바늘 없음BD309604
림포렙 밀도 그라디언트 매체STEMCELL Technologies7811
전사 피펫Denville Scientific Inc.P7212
96웰 U-바닥 플레이트Denville Scientific Inc.
DPBS시그마 알드리치 D8573
FoxP3 전사 인자 염색 버퍼 세트 ThermoFisher Scientific00-5523-00고정/투과화 버퍼 및 투과화 버퍼
열조절 원심분리기Eppendorf 5810 R
Attune NxT 플로우 사이토미터ThermoFisher ScientificN/A96-웰 세포 부피 계수용 
정제 된 쥐 안티 마우스 CD16 / CD32 (마우스 BD fc 블록)  클론 2.4G2 ThermoFisher Scientific553141Fc Block
LIVE/DEAD Fixable Blue dead Cell Stain Kit, UV excitation용ThermoFisher ScientificL34962Fixable viability stain
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780ThermoFisher Scientific47-0451-80
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APCThermoFisher Scientific17-5961-82
CD8-&알파; 항체 (KT15), PESanta Cruz Biotechnologysc-53473 
CD4 단클론 항체 (GK1.5), PE-Cyanine5ThermoFisher Scientific15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) 단클론 항체 (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700ThermoFisher Scientific56-5321-82
CD11c 단클론 항체 (N418), PE-Cyanine5ThermoFisher Scientific15-0114-82
F4/80 단클론 항체 (BM8), eFluor 450ThermoFisher Scientific48-4801-80
CD11b 단클론 항체 (M1/70), APCThermoFisher Scientific17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) 단클론 항체 (RB6-8C5), PEThermoFisher Scientific12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) 단클론 항체 (MIH5), PE-Cyanine7ThermoFisher Scientific25-5982-80
CD273 (B7-DC) 단클론 항체 (122), PerCP-eFluor 710ThermoFisher Scientific46-9972-82
Ki-67 단클론 항체 (B56), BV711BD Biosciences563755
쥐)

참고문헌

  1. Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
  2. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  3. Whiteside, T. L.

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