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방법 논문

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

9.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57685

⸱

2018년 6월 7일

 ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Baylor College of Medicine, 2Interdepartmental Graduate Program in Translational Biology and Molecular Medicine, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기 우리가 설립된 피하 종양에서 종양 면역 및 비 면역 microenvironment의 구성 요소를 풍부 하 게 분리 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 종양 면역 침투 및 비 면역 종양 분수는 종양 면역 microenvironment의 포괄적인 특성화를 허용할 수 있는 별도 분석에 대 한 수 있습니다.

초록

종양 면역 microenvironment (시간) 최근 특히 immunotherapies에 대 한 단단한 종양에서 치료 응답의 중요 한 중재자로 인정 받고 있습니다. 최근 임상 발전 immunotherapy 정확 하 고 철저 하 게 종양 및 그 관련된 면역 침투 특성 재현 방법에 대 한 필요성을 강조 표시 합니다. 종양 효소 소화 및 흐름 cytometric 분석 허용 광범위 한 특성 수많은 면역 세포 하위 집합 및 고기; 그러나, 분석의 깊이 종종 fluorophore 제한 패널 설계 및 큰 종양 샘플을 확보 하는 필요의 희귀 면역 인구를 관찰에 의해 제한 됩니다. 따라서, 우리는 분리 및 농축 비 면역 종양 구성 요소에서 종양 면역 침투에 대 한 효과적이 고 높은 처리량 방법을 개발 했습니다. 설명된 종양 소화와 밀도 기반 원심 분리 기술은 종양 및 종양에 대 한 별도 특성 면역 침투 분수 및 세포 생존을 유지 있으며 따라서 종양의 광범위 한 특성을 제공 합니다 면 역학적 상태입니다. 이 방법은 하는 광범위 한 공간 면역이 단단한 종양에서 더 일관 된 전체 종양 면역학 프로 파일링 기법에 대 한 필요성을 보여주는 사용 되었다. 이 방법은 피하 고체 murine 종양; 면 역학적 특성에 대 한 효과적이 고 융통성 있는 기법을 제공 하는 전반적으로, 이 도구를 사용 하 수 있다 더 나은 종양 면역학 기능을 특성화 하는 등, 소설 immunotherapeutic 전략의 전 임상 평가.

서론

진압 시간 최근 암의 각 인으로 인정을 받고 있다 그리고 immunotherapy1그들의 민감성을 완화 뿐만 아니라 개발, 진행, 그리고 고체 종양 암의 보호에 중요 한 역할을 알려져 있습니다. 에 수많은 세포 하위 집합 및 고기, 종양의 면 역학적 상태에 중요 한 통찰력을 제공 하는 모두는 구성 됩니다. 이러한 면 역학적 하위 집합 추가 함께 타고 난 및 적응형 면역 반응2,3의 대다수를 구성 하는 림프 구 또는 골수성 근원의 세포로 층 화 될 수 있다. Immunotherapeutic 전략 (즉, 검사점 면역 억제제, 공상 항 원 수용 체 T-세포, 등) 튼튼한 암 유발 가능성이 있는 암 immunotherapy 분야의 최근 발전 증명 재발; 그러나, 그들은 상대적으로 단단한 종양 암4,5에서 효과 유지. 수많은 그룹 시간 치료 성공6,7을 재생할 수 및 따라서, 거기에 특별히 초점을 맞추고 전 임상 설정에서 새로운 immunotherapies 정확 하 게 평가할 필요가 남아 있다 중요 한 장애물이 나타났습니다 그들의 변조 또는8시간 극복 하는 능력.

일반적으로 시간을 특성화 하기 위해 현재 노력 중 현미경 활용 또는 항 체 면역 세포 하위 집합 및 그들의 기능9,10식별 하는 전략을 라벨 함께 cytometry 흐름. 이 두 가지 전략 현미경 세포 하위 집합의 공간 감사 있으며 cytometry 제공 높은 처리량 및 세포 변화의 광범위 한 정량화 고유 하 게 서로 다른 정보를 제공 합니다. 형광 성 다중 immunohistochemistry 지금 최대 7 매개 변수를 지원할 수, 스펙트럼 이미징 시스템 최적화에 최근 개선에도 불구 하 고 제한 된 패널 크기 어려운 광범위 한 레벨 프로 파일링 면역 이며 따라서이 기술을 자주 자세한 예약 집중 분석. 결과적으로, cytometry는 가장 널리 사용 되는 면역 프로 파일링 기법 중 하나 남아 있다. 시간 특성에 그것의 광범위 한 사용, 처리 및 얼룩을 위해 사용 되는 방법을 매우 변수는 있습니다. 가장 자주 프로토콜 활용 종양 효소 해리 (즉, collagenases, DNase, 등) 및 수동 분리 방법은 단일 셀 정지를 달성 하기 위해 다음 항 체 얼룩이 지 고 분석7. 각 방법의 장점에도 불구 하 고 수많은 그룹11이러한 기법 통해 유도 될 수 있는 광범위 한 다양성을 보여주었다. 이것은 종양 microenvironment 프로 파일링의 크로스-연구 비교 매우 어려운 동일한 murine 종양 모델을 평가 하는 경우에 합니다. 또한, 종양 세포를 평가 하기 위해 제한 된 잠재력을 제공 하는 이러한 메서드 및 종양 면역 침투 하지 구성 요소 독립적으로, 때문에 두 구성 요소는 소화 후 산재. 샘플 수량 다음 제한 멀티 패널 얼룩 및 분석, 희귀 면역학 하위 집합 특성 하려고 할 때 주요 문제 되는 (즉, 종양 관련 T-세포)12. 대량 cytometry cytometry (CyTOF), 비행 시간 등 최근 기술 42 독립적인 매개 변수13보다 큰 패널 디자인을 지 원하는 일부 시스템 셀룰러 하위 집합의 차원 높은 phenotypic 분석 허용. CyTOF 기술에 면역 프로 파일링의 엄청난 힘에도 불구 하 고 그것은 비용, 분석 전문 및 장비에 대 한 액세스 제한 된 남아 있습니다. 또한, 많은 CyTOF 프로토콜 추천14, 신호 대 잡음 비율 개선 하기 위해 면역 하위 집합의 정화 그리고 따라서 좋습니다 우리의 농축 메서드를 사용할 수는 업스트림 데이터 품질 향상을 위한 CyTOF 분석의.

여기 우리가 종양 microenvironment 소화 및 분석 분리를 침투 하는 종양 면역을 통합 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법의 목적은 종양 면역 침투 및 종양 microenvironment의 광범위 한 특성 분석을 위한 종양 세포 분수의 독립적인 높은 처리량 프로 파일링 수 있도록. 이 방법을 사용 하 여, 더 설명 전체 종양 분석의 중요성으로 피하 고체 종양 모델은 중요 한 공간 면역학이 발견 합니다. 전반적으로,이 방법은 더 정확 하 고 일관 되 게 비교할 수 샘플 사이의 종양 내에서 면역 세포 하위 집합에 대 한 풍요롭게 종양 세포와 종양의 면역 분수의 독립적인 프로 파일링을 허용 하기 때문에.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 베일 러 대학의과 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 종양 수확 및 소화

참고: 수확에 필요한 시간은 3-5 분/종양, 및 처리에 필요한 시간 1 ~ h + 2-3 분/종양.

  1. 이산화탄소 흡입 하 여 마우스를 안락사와 머리 오염을 방지 하기 위해 수확 하기 전에 70% 에탄올과 아래로 각 마우스 스프레이. 수술로 쥐에서 피하 종양을 제거 하 고 종양 어떤 오염 조직 (즉, 머리, 피부, 복 막, 등)의 무료 인지 확인. 각 종양 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 24-잘 접시에서 없이 기본 RPMI 1640 미디어의 1.8 mL에 놓습니다. 큰 수확에 대 한 계속 판 찬 세포 생존 능력을 유지 하기 위해 얼음에.
    참고: 불 임이 필요한 경우 모든 종양 ╂ biosafety 어떤 추가 단계 뿐 아니라 불 임 수술 도구 (즉, 가 위, 집게, 등), 캐비닛에서 필요 합니다. 0.5-1 ㎝ 사이 가장 긴 직경이 종양은 최적의 그리고 더 큰 또는 작은 종양 시 약의 스케일링 필요 합니다.
  2. 가 위를 사용 하 여 각 잘 내3 조각을 1 m m 미만으로 종양을 잘라.
  3. 콜라를 용 해 하 여 소화 칵테일 x 10을 준비 10 mg/mL, 2500 U/mL, 그리고 DNase에서 콜라 4에서 나 기본 RPMI 1640 미디어 (FBS) 없이 200 U/mL에서 나.
    참고: 소화 칵테일 사전에 하루를 준비 하 고 수-20 ° C에 저장 그러나, 효소 활동 한번 해산 시간이 지남에 잃게됩니다 장기간된 보관 권장 하지 않습니다.
  4. 난, 콜라 4, 및 DNase 콜라를 포함 하는 분리 칵테일 x 10의 200 µ L을 추가 나 1 m m3 조각으로 각 잘 하.
  5. 60-100 rpm 궤도 격판덮개 셰이 커를 사용 하 여 가볍게 흔들어 동안 37 ° C에서 1 시간에 대 한 소화 샘플 수 있습니다.
    참고: 효소 소화 하는 동안 37 ° C에 온도를 상승 면역 세포 활성화를 발생할 수 있습니다.
  6. 1 시간 후 RPMI 1640 미디어 각 음을 5 %FBS 2 mM EDTA와 보충의 1 mL을 추가 하 여 반응 중화.
  7. 50 mL 원심 분리기 튜브 위에 앉아 40 µ m 셀 스 트레이너로 종양 소화와 나머지 종양 조각 플라스틱.
    참고: 종양 소화는 스 트레이너를 쉽게 전송에 대 한 1 mL 피 펫 팁의 끝을 잘라.
  8. 10 mL 주사기 플런저를 사용 하 여 기계적으로 스 트레이너를 통해 종양 조각 세분화. 주기적으로 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL와 여과기를 헹 굴 (포함 하는 5 %FBS) 셀 스 트레이너는 종양의 명확한 때까지 반복.
    참고: 전체 미디어의 약 4-10 mL 적절 하 게 종양의 여과기를 헹 구 게 충분 해야 한다.
    참고:이 단계는 세포 생존 능력을 유지 하기 위해 모든 샘플에 대 한 완료 될 때까지 얼음에 샘플을 놓습니다.
  9. 각 50ml 원심 분리기 튜브 보충된 RPMI 1640 미디어를 사용 하 여 동일한 볼륨을 조정 합니다.
    참고: 볼륨 조정은 원심 분리기 균형 중요 합니다. 이 단계를 건너뛰는 원심 분리기 손상 또는 상해 될 수 있습니다.
  10. 셀 정지 (5 분, 805 x g, 4 ° C) 원심 supernatants, 삭제 하 고, 다시 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL에 일시 중단.
    참고: 셀 집계를 resuspend 어려운 원심 분리에 따라 형성 수 있습니다. 계속 하기 전에 헤어 5 mL 혈 청 학적인 피 펫과 혼합 빠르게 사용 합니다.

2. 면역과 종양 세포 분수의 분리

참고:이 단계에 필요한 시간은 약 1 시간입니다.

  1. 15 mL 원심 분리기 튜브의 하단에 밀도 그라데이션 매체의 3 mL를 추가 합니다. 준비 하 고 각 종양에 대 한 충분 한 튜브 라벨.
  2. 레이어 2 개의 층의 혼합을 방지 하기 위해 튜브의 측면 아래로 천천히 pipetting으로 밀도 그라데이션 매체 위에 종양 세포 현 탁 액 2 mL.
  3. 조심 스럽게 원심 분리기에 스핀 805 x g, 20 ° C, 아니 브레이크에서 20 분에 대 한 계층화 된 튜브를 놓습니다.
    참고: 그것은 매우 적절 한 균형을 확인 하 고 아무 브레이크 원심 분리 하는 동안 사용 되도록 하는 것이 중요입니다. 이 과정의 혼선 레이어 혼합 되며 전체 샘플 복구는 어려울 것 이다.
  4. 조심 스럽게 (틸) 계층과 전송 피 펫을 사용 하 여 새로운 15 mL 튜브에 최고의 미디어 계층 백혈구 침투 종양 전송. 모든 나머지 밀도 그라데이션 매체를 삭제 하 고 보충된 RPMI-1640의 2 ml에서 튜브의 하단에 종양 펠 릿 resuspend.
    참고: 원심 분리 후 있을 것입니다 아래로 각각 해당 하는 위에서 보이는 4 개의 층: 미디어, TILs, 밀도 그라데이션 매체, 및 종양 세포 펠 릿. 그림 2 다양 한 계층의 예를 참조 하십시오.
  5. 모두 때까지 원심 종양 샘플 튜브 (5 분, 805 x g, 4 ° C)를 분리 하 고 삭제는 상쾌한.
  6. Resuspend 200 µ L에 때까지 샘플 및 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL에 종양 펠 릿. 생존 능력을 유지 하기 위해 얼음에 계속.

3. 도금 및 얼룩

참고: 도금에 필요한 시간은 30 s/종양; 표면 얼룩에 필요한 시간은 1 시간; 세포내 얼룩에 필요한 시간은 40 분; 필요한 흐름 cytometry 분석-1 시간 4 분/종양.

  1. 준비 하 고 얼룩 패널 및 셀에 대 한 추가 판 각 면역에 대 한 레이블 96 잘 U-하단 플레이트 계산.
    참고: 일반적으로, 3 개의 접시 준비가 총에서: 림프 구 집중 패널 판, 골수성 집중 패널 플레이트, 그리고 셀 수 접시.
  2. Aliquot는 얼룩의 각 단일 셀 정지 패널 접시와 설정된 볼륨 수 접시에.
    참고: 카운트 접시 정확한 세포 인구 수 수 있도록 각 착 색 패널에 추가 하는 셀의 총 수를 계산 하는 데 사용 됩니다. 96 잘 접시 샘플링 및 volumetric 분석 기능 교류 cytometer 각 샘플 µ L 당 세포 수를 제공 하 고 그러므로, 각 착 색 패널에 추가 하는 셀의 수를 계산 수 있습니다. 수 판 고정 FACs 버퍼와 rinsing 4 ° C에서 하룻밤 후 다음 날 취득 될 수 있다 (인산 2% 식 염 수 (PBS) 버퍼링 FBS), FACs 버퍼의 설정된 볼륨에서 resuspending 및.
  3. (5 분, 805 x g, 4 ° C) centrifuging와 모든 무료 FBS를 제거 하려면 각 린스 사이 상쾌한 삭제 샘플 당 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS)의 200 µ L로 두 번 셀 워시.
  4. Fc 블록의 50 µ L 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 샘플 혼합 및 4 ° c.에 20 분 동안 품 어 추가
  5. 2 x의 50 µ L 집중 extracellular 대상 항 체와 고칠 수 생존 얼룩 혼합물, 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 혼합 하 고 RT 또는 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 품 어 추가
    참고: 정확한 착 조건 항 체에 대 한 제조업체의 지침에 따라 달라 집니다. 모든 얼룩 희석 DPBS, 고칠 수 생존 염료의 포화를 방지 하기 위해 아무 추가 FBS와 이어야 합니다. 이 원고에 사용 되는 착 색 패널의 최적의 희석에 대 한 테이블의 재료/장비 를 참조 하십시오. 항 체와 고칠 수 생존 솔루션 얼룩 얼룩 Fc 블록에 추가 될 때 전체 얼룩 볼륨 100 µ L에서 농도 x 최종 1을 2 배 농도에서 준비가 되어 있습니다.
  6. (5 분, 805 x g, 4 ° C) centrifuging와 각 린스 사이 supernatants 삭제 FACs 버퍼와 두 번 샘플을 씻으십시오.
  7. 고정/permeabilization 솔루션 x 1의 200 µ L에서 resuspend 하 고 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 밤새 품 어.
    참고: 실험 일시 중지할 수 있습니다 하룻밤이 시점에서: 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 샘플을 계속.
  8. 다음 날, 원심 판 (5 분, 805 x g, 4 ° C) 그리고는 상쾌한 삭제.
  9. Permeabilization 버퍼, 원심 분리기 (5 분, 805 x g, 4 ° C), x 1의 200 µ L로 한 번 헹 구 고는 상쾌한 삭제.
  10. 1 x 집중된 세포내 항 체 얼룩 패널 1 x permeabilization 버퍼에 준비의 100 µ L을 추가 하 고 실시간 또는 (이 제조 업체에서 얼룩 권장 사항에 따라 달라 집니다) 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 품 어.
  11. 1 x permeabilization와 버퍼 (5 분, 805 x g, 4 ° C), 상쾌한, 삭제 되 면 헹 구 고 린스 FACs 버퍼와 함께 두 번째 시간 (PBS 2 %FBS).
  12. FACs 버퍼의 300 µ L에서 샘플을 resuspend (PBS 2 %FBS), 교류 cytometry 튜브 샘플 전송 및 흐름 cytometry 분석 수행.

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결과

우리의 결과 프로토콜에 설명 된 대로 비 면역 종양 구성 요소에서 분리 할 때의 중요 한 혜택을 보여 줍니다. 또한, 설립된 단단한 종양의 중요 한 면역학이 설명한 방법을 사용 하 여 설명 합니다.

많은 종양 분리 기술로 중요 한 문제는 가혹한 소화 조건 (즉, 높은 온도, 부적절 한 영양 공급, 등)의 결과로 수시로 샘플 생존 능력의 손실. 설명된 소화 방법의 사용 하거나 밀도 없이 그라데이션 중간 농축, cytometry (그림 1A)에 의해 평가 약 70-90% 총 세포 생존 능력을 제공 합니다. 유사한 viabilities에는 때까지 관찰 되었다 농축 하 고 종양이이 방법 (그림 1

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토론

에 다양 하 고 복잡 한 세포 구성 성분과 분자의 구성 됩니다. 최근 기록은이 환경의 정확한 특성 치료 성공 또는 실패의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다 식별할 수 있습니다 심지어 치료 저항 메커니즘 제안. 예를 들어 intratumoral 수준 (즉, MDSCs, T 규정 하는 세포, 등) 다양 한 면역 세포의 증가 이펙터 면역 반응을 완화를 immunotherapeutic 효과 파기 됩니다. 다른 한편으로, 이펙터 면역 인구 (예를 들어, 종양 관련 CD8 + T 세포, 자연 킬러 세포, T 보조 세포)의 증가 intratumoral 존재 치료 성공의 강력한 predictors 수 있습니다. 종양 면역학 상태를 정확 하 게 나타내는 것을 계속 하는 또 다른 특성은 종양 세포 자체의 phenotypic 특징 이다. 이 포함 하는 다양 한 면역 ligands, 효소, 또는 겨냥 downregulating 이펙터 면역 반응 분자의 표현 (즉, PD-L1, PD-L...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

JMN 국립 연구소의 종합 의료 과학 (T32GM088129)과 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (F31DE026682)에서 재정 지원의 건강의 국가 학회 둘 다 인정합니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다. 이 프로젝트 또한 NIH (P30 AI036211, P30 CA125123, 및 S10 RR024574)와 조 엘 M. Sederstrom의 전문가 지원 자금 Cytometry 베일 러 의과대학에서 셀 정렬 코어에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
6주에서 12주 된 수컷 C57BL/6 마우스Jackson Laboratory 우리의 종양 연구에 사용된 N/A
MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line협력자로부터 획득됨 N/AE6/E7 HPV 항원이 쥐 편도선 상피암 세포주를 발현하고 있음 
70% 이소프로필 알코올 EMD 밀리포어 PX1840
쥐 수술 도구 키트세계 정밀 기기MOUSEKIT주로 가위, 핀셋, 메스만 필요합니다. 
24웰 플레이트 덴빌 사이언티픽 Inc.T1024또는 24웰 플랫 바닥 플레이트. 
RPMI-1640 매체Sigma-AldrichR0883
콜라겐분해효소 I EMD Milipore234153
Collagenase IVWorthington Biochemical CorporationLS004189
DNase I Sigma-Aldrich11284932001
Low Speed Orbital ShakerBioExpress(공급업체: Genemate) S-3200-LS또는 어떤 궤도 쉐이커. 
온도 조절 인큐베이터Fisher Scientific13-255-27또는 기타 온도 조절 인큐베이터
FBSSigma-AldrichF8192
EDTAAMRESCOE177
1 mL 피펫 및 팁Eppendorf13-690-032또는 기타 피펫 및 팁
40 um Cell StrainersFisher Scientific22363547
50mL 원심분리기 튜브Denville Scientific Inc.C1062-P
15mL 원뿔형 튜브Denville Scientific Inc.C1012
10mL Luer-Lok 주사기(바늘 없음BD309604
림포렙 밀도 그라디언트 매체STEMCELL Technologies7811
전사 피펫Denville Scientific Inc.P7212
96웰 U-바닥 플레이트Denville Scientific Inc.
DPBS시그마 알드리치 D8573
FoxP3 전사 인자 염색 버퍼 세트 ThermoFisher Scientific00-5523-00고정/투과화 버퍼 및 투과화 버퍼
열조절 원심분리기Eppendorf 5810 R
Attune NxT 플로우 사이토미터ThermoFisher ScientificN/A96-웰 세포 부피 계수용 
정제 된 쥐 안티 마우스 CD16 / CD32 (마우스 BD fc 블록)  클론 2.4G2 ThermoFisher Scientific553141Fc Block
LIVE/DEAD Fixable Blue dead Cell Stain Kit, UV excitation용ThermoFisher ScientificL34962Fixable viability stain
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780ThermoFisher Scientific47-0451-80
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APCThermoFisher Scientific17-5961-82
CD8-&알파; 항체 (KT15), PESanta Cruz Biotechnologysc-53473 
CD4 단클론 항체 (GK1.5), PE-Cyanine5ThermoFisher Scientific15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) 단클론 항체 (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700ThermoFisher Scientific56-5321-82
CD11c 단클론 항체 (N418), PE-Cyanine5ThermoFisher Scientific15-0114-82
F4/80 단클론 항체 (BM8), eFluor 450ThermoFisher Scientific48-4801-80
CD11b 단클론 항체 (M1/70), APCThermoFisher Scientific17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) 단클론 항체 (RB6-8C5), PEThermoFisher Scientific12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) 단클론 항체 (MIH5), PE-Cyanine7ThermoFisher Scientific25-5982-80
CD273 (B7-DC) 단클론 항체 (122), PerCP-eFluor 710ThermoFisher Scientific46-9972-82
Ki-67 단클론 항체 (B56), BV711BD Biosciences563755
쥐)

참고문헌

  1. Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
  2. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  3. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  4. Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
  5. Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106(2016).
  6. Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
  7. Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
  8. Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
  9. Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
  10. Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
  11. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  12. Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
  13. Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
  14. Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
  15. Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).

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