방법 논문

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

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⸱

DOI:

10.3791/57688

⸱

2018년 6월 19일

 ,  , 
1Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Department of Bioengineering, University of California at San Diego

교신 저자: Alexandre R. Colas <acolas@SBPdiscovery.org>

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기 우리 Activin A와 overexpression-lentivirus 중재 Id1의 간단한 조합을 사용 하 여 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서 생성 하는 확장 메서드를 설명 합니다.

초록

많은 양의 기능 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 심장 창시자의 정의 심장 분야 원산지 cardiomyocytes 세대 셀 기반 심장 치료 및 질병 모델링에 대 한 필수입니다. 우리는 최근 Id 유전자는 필요 하 고 척추 개발 하는 동안 첫 번째 심장 필드 창시자 지정 하려면 충분 한 나타났습니다. 이 분화 프로토콜 이러한 연구 결과 활용 하 고 첫 번째 심장 필드 같은 (FHF-L) 창시자를 생산 하 강력한 지정 큐로 Activin A와 함께에서 Id1 overexpression를 사용 합니다. 중요 한 것은, 결과 창시자 효율적으로 심 실 같은 cardiomyocytes에 (~ 70-90%)를 구분합니다. 여기는 1) 생성 Id1 overexpressing hPSCs 2) 차별화 cryopreservable FHF L 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes의 확장 가능한 수량을 상세한 방법에 설명 합니다.

서론

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)의 대규모 생산-파생된 심장 창시자 및 cardiomyocytes는 줄기 세포 기반 요법1,2,3 와의 빠른 특성을 모델링 하는 질병에 대 한 필수 새로운 통로 규제 심장 차별화4,,56 과 생리학7,8. 비록 연구9,10,11,12,,1314의 번호,15 는 앞에서 설명한 고효율 심장 차별화 프로토콜 hPSCs에서, 아무도 중요 한 분자 차이 왼쪽의 식별도 결과 cardiomyocytes의 심장 필드 근원 해결 (첫 번째 심장 분야) 및 오른쪽 (두 번째 심장 분야) 심 실 cardiomyocytes16 과 심장 분야 특정 선 천 성 심장 질환;의 존재 즉, hypoplastic 좌 심 혼 증후군17 또는 arrhythmogenic 오른쪽 심 실 발육 이상18. 따라서, 심장 창시자의 생성 및 hPSCs에서 정의 된 심장 분야 원산지 cardiomyocytes 되고있다 치료로 그들의 관련성을 증가 하기 위하여 필요성 및 질병 모델링 도구.

이 프로토콜의 Id1, 최근 확인 된5 첫 번째 심장 필드 지정 큐 필요 하 고 충분 한 hPSCs에서 cardiogenesis를 시작 하는 Activin A와 함께에서 하는 제정 overexpression에 의존 합니다. 특히, 커닝 햄 외. (2017) 5 표시는 Id1 유도 창시자 구체적으로 표현 첫 심장 필드 (HCN4, TBX5) 하지만 하지 두 번째 심장 필드 마커 (SIX2, ISL1) 그들은 심장 차별화를 받 다. 또한, 저자는 또한 표시 유전자 변형 마우스 배아의 유전자 (i d 1-4), 전체 Id 가족 부족 첫 심장 필드 심장 창시자, 더 많은 중간과 뒷부분 심장 창시자 (동안 형성 없이 개발 두 번째 심장 필드) 아직도 그로 인하여 Id 단백질 필수적인 첫 번째 심장 필드 cardiogenesis에서 vivo에서시작 하는 제안, 형성할 수 있다. 편리 하 게, Id1 유도 창시자 cryopreserved 수 고 저절로 cardiomyocytes 표시 심 실 같은 특성을 포함 하 여 심 실 전용 마커 (IRX4, MYL2) 식으로 차별화 하 고 같은 심 실 활동 전위.

여기는 첫 번째 심장 필드 같은 (FHF-L) 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes Id1 overexpressing hPSCs에서 생성 하는 간단 하 고 확장 가능한 방법에 설명 합니다. 이 프로토콜의 중요 한 특징은 편리한 cryopreservation 단계를 사용 하 여 후속 cardiomyocyte 생산에서 심장 조상 세대 연결을 푸십시오 가능성. 요약 하자면,이 프로토콜 (1) 생성 Id1 overexpressing hPSCs, (2) hPSCs에서 FHF L 심장 창시자를 생성, (3) cryopreserve 결과 창시자, 및 (4) 재개 FHF L 심장 조상 차별화에 필요한 단계를 자세히 설명 하 고 생성 매우 농축 (> 70-90%) 심 실 같은 cardiomyocytes 박동.

프로토콜

1. Id1 바이러스 준비 및 감염

  1. 공동 transfecting pCMVDR8.74, pMD2.G, 및 pCDH EF1 Id1 PGK PuroR Id1 overexpressing lentivirus 생성 (Addgene: 플라스 미드 #107735) HEK293T 세포로. 바이러스 성 입자를 수집 하 고, 여과 하 고, 상쾌한에서 정화 하 고 무라 외 에서-80 ° C에서 저장 (2003) 19. 또는 pCDH EF1 Id1 PGK PuroR lentivirus 생산 공급 업체에 전송 하 여 Id1 lentivirus를 상업적으로 생산.
    주의: lentiviral 안전 규정 및 표준 작동 프로토콜을 따르시기 바랍니다.
    참고: 중요 한: 최적의 바이러스 titer 적어도 10 이어야 한다8 10에9 Transducing 단위/mL (TU/mL).
  2. 이전에 감염, 코팅 시 약, 일반적으로 Engelbreth-Holm-떼 마우스 육 종 세포 ( 재료의 표참조)에 의해 분 비 젤라틴 단백질 혼합물의 50 µ l 96 잘 접시의 한 잘 코트.
  3. 6 잘 플레이트에서 PBS 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 고 0.5 m EDTA의 1 mL을 추가 하 여 재배 하는 만능 줄기 세포의 한 잘 해리
    참고: 3-10 분에서 분리 시간 변화 한다. 세포의 80% 이상이 접시의 바닥에서 분리 됩니다, 다음 단계로 진행.
  4. 피펫으로 멸 균과 세포 현 탁 액 15 mL 플라스틱 원심 분리기 튜브에 수집 합니다.
  5. 분리 시 약 5 mL의 PBS 포함 된 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +와 중화.
  6. 원심 (200 x g 3 분) 하 여 펠 릿 세포.
  7. 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 펠 릿을 꺼내 위해 튜브를 터치.
  8. 다시 셀 줄기 세포 미디어의 1 ml에서를 일시 중단 합니다.
  9. 공급 업체 지침에 따라 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
  10. 당 접시 20000 가능한 셀 줄기 세포 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충의 50 µ L에서 잘 (96 잘 접시) 코팅 ( 표 1 및 2참조).
  11. 24 시간 후에 셀 첨부 파일에 대 한 모니터링 및 2 µ M로 / 바위 통로 억제제와 6 ng/mL hexadimethrine 브 로마 이드 보충 100 µ l 줄기 세포 미디어 미디어 바꿉니다 ( 표 1 및 2참조), lentiviral 감염 전에 한 h.
    참고: 셀 해야 단단히 장착할 접시의 바닥에.
  12. 얼음에 Id1 lentivirus 녹여
  13. 잘 당 정화 lentivirus의 3 µ L 추가 (바이러스 titer 10 사이 여야8 109 화/mL), 다음 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2, 20% O2)를 다시 접시를 전송.
  14. 24 시간 후 바이러스 성 감염, 감염된 세포에 신선한 줄기 세포 미디어의 100 µ L를 추가.
  15. 48 h 후 lentiviral 감염, 신선한 줄기 세포 미디어 1 µ g/mL puromycin 보충의 200 µ L 미디어를 포함 하는 대체 바이러스.
  16. 줄기 세포 미디어 1 µ g/mL puromycin 보충의 200 µ L 매일 미디어를 새로 고침 합니다.
  17. 문화 80 %confluency 도달, 해리 (96 잘 접시의 한 우물)에 대 한 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + + 0.5 m EDTA 없이 PBS의 200 µ L를 사용 하 여 셀.
  18. 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.
  19. 분리 시 약 5 mL의 PBS 포함 된 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +와 중화.
  20. 원심 (200 x g 3 분) 하 여 펠 릿 세포.
  21. 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 펠 릿을 꺼내 위해 튜브를 터치.
  22. 다시 셀 줄기 세포 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충의 1 ml를 일시 중단 합니다.
  23. 모든 셀 (1 mL) 전송 12-잘 접시의 코팅.
  24. 24 시간 후 셀 줄기 세포 미디어의 1 mL와 잘 및 바꾸기 미디어 첨부 파일에 대 한 모니터는 6 ng/mL hexadimethrine 브 로마 이드, 변환 전에 한 h 2 µ M로 / 바위 통로 억제제와 보충.
  25. 얼음에 Id1 lentivirus 녹여
  26. 잘 (12-잘 접시) 당 정화 바이러스의 5 µ L를 추가 합니다.
  27. 24 시간 후 lentiviral 감염, 신선한 줄기 세포 미디어 3 µ g/mL puromycin 보충의 1 mL와 함께 미디어를 포함 하는 대체 바이러스.
  28. 48 h lentiviral 감염 게시, 신선한 줄기 세포 미디어 6 µ g/mL puromycin 보충의 1 mL와 함께 미디어를 포함 하는 바이러스를 대체.
  29. 문화 80 %confluency 도달, 해리 (12-잘 접시의 한 우물)에 대 한 PBS 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 고 0.5 m EDTA의 500 µ L를 사용 하 여 셀.
  30. 절반을 전송 (250 µ L) 코팅 시 약의 한 잘에 세포 현 탁 액의 줄기 세포 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충의 2 개 mL를 포함 하는 6 잘 플레이트 코팅.
  31. 다른 절반을 사용 (250 µ L) RNA 추출 및 qRT-PCR lentiviral 중재 Id1 식 레벨, Colas 외 로 결정 하기 위해 샘플의 (2012 년) 4.
    참고: 중요 한: Id1 mRNA 식 레벨 GAPDH 식 수준 (qRT-PCR 뇌관 표 3 참조)의 0.005 배 보다 낮은 경우, 반복 감염 과정 Id1 식 수준 초과 될 때까지 위에서 설명한 대로 임계값입니다.

2입니다. hPSCsId1 유지 보수

  1. 코팅된 6 잘 플레이트에 hPSCsId1 문화와 줄기 세포 미디어 6 µ g/mL puromycin 보충의 당 3 mL에서 성장.
  2. HPSCsId1 80 %confluency 도달, 효소 없는 분리 시 약 공급 업체의 지침을 사용 하 여 집계 (1:6 분할 비율)로 셀을 통과 하 고 줄기 세포 미디어 6 µ g/mL puromycin 보충의 당 3 mL에 성장 한다.

3. 차별화 hPSCsi d 1 의 준비

  1. 코트 코팅 시 약의 당 500 µ L와 12-잘 접시.
  2. Id1 도달 90% confluency hPSCs 1 mL의 PBS 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 고 잘 당 0.5 m m EDTA 추가 하 여 세포를 분리 하는 경우 5-10 분에 대 한 분리 과정 1 분 마다 확인 하 고 세포의 80%는 접시에서 해리는 한 번 다음 단계를 수행 하십시오.
  3. 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.
  4. 분리 시 약 5 mL의 PBS 포함 된 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +와 중화.
  5. 원심 (200 x g 3 분) 하 여 펠 릿 세포.
  6. 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 펠 릿을 꺼내 위해 튜브를 터치.
  7. 다시 셀 줄기 세포 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충의 2 개 mL를 일시 중단 합니다.
  8. 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
  9. 줄기 세포 미디어 조직 문화 인큐베이터에 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 및 6 µ g/mL puromycin, 전송 접시 보충의 1 mL에 잘 당 300000 플레이트 세포.
  10. 줄기 세포 미디어 문화 90 %confluency 도달할 때까지 6 µ g/mL puromycin 보충의 2 mL와 함께 매일 미디어를 새로 고침 합니다. 이 시점에서 심장 차별화를 시작 (다음 단계).

4. 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자 (FHF L CPs)에 hPSCsi d 1 의 차별화

  1. 12 잘 플레이트 형식에 대 한 유도 미디어 (표 1)의 1.5 mL와 함께 줄기 세포 미디어를 대체 하 여 시작 차별화 (0 일) 보충 Activin를 (100 ng/mL) (참조 표 2 에 대 한 권장 볼륨 및 Activin A에 대 한 농도 다른 플레이트 형식)입니다.
  2. 하루에 1 (차별화 시작 후 24 h), 미디어를 (당 12-잘 접시의 우물) Activin A 없이 유도 미디어의 2 mL 바꿉니다.
  3. 3 일에 2 mL (당 12-잘 접시의 우물) Activin A 없이 유도 미디어의 미디어를 바꿉니다.
  4. 당일 5, FHF L CPs cryopreservation 수집 (다음 단계).
    참고: 중요 한: Cryopreservation는 선호이 시점에서, 그것은 연결을 푸십시오 셀의 후속 cardiomyocyte 생산과 biobank 대규모 배치에서 심장 조상 세대 수 있습니다. 참고 또는 그 날 5 FHF L CPs 차별화 계속, 단계 5.1-5.5 passFHF L CPs 참조 하십시오 다음 단계 6.5 차별화 진행을 갓 코팅된 판에 전달 될 수 있습니다.

5입니다. cryopreservation FHF L CPs의

  1. 5 일을 포함 하는 우물에서 모든 미디어를 발음 FHF L CPs 신속 하 게 따뜻한 (37 ° C) 1 x 분리 시 약 포함 하는 효소의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조). 조직 문화 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
  2. 1 분 후 접시를 인큐베이터에서 좌우로 흔들어.
  3. 2 분 (전체 시간), 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거 하 고 10 %FBS 미디어의 1 mL를 추가 합니다.
  4. 부드럽게 피펫으로 세포를 위아래로 5 mL 피펫으로 접시에서 셀 분리를 촉진 하기 위하여와.
  5. 3 분 x g 200에서 원심 분리 하 여 원심 분리기 튜브와 펠 릿 세포에 세포 현 탁 액을 수집
  6. 다시 cryopreservation 시 약의 2 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
  7. 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
  8. 추가 cryopreservation 시 약 ( 재료의 표참조) 원하는 농도 (일반적으로 5-10 × 106 셀/mL)에서 세포를 cryopreserve에 충분 한 볼륨에.
  9. Cryopreservation 튜브 셀 전송 냉각 장치 (1 ° C/min)에 튜브를 배치 하 고 냉각 장치-80 ° C 냉장고에서 밤새 껏 두기 위하여.
  10. 24 시간 후 장기 저장을 위한 액체 질소 냉동된 튜브 전송.
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

6. 심 실 같은 Cardiomyocytes에 FHF L CP 차별화

  1. 드라이 아이스 용기에 액체 질소 저장에서 하루 5 FHF L CPs 냉동 튜브를 전송.
  2. 세포 현 탁 액은 완전히 해 동 때까지 2 ~ 3 분 동안 37 ° C 물 목욕에 튜브를 배치 합니다.
    참고: 중요 한: 녹고 과정은 시간에 민감한. 과도 한 양의 시간에 대 한 셀 cryopreservation 미디어 노출 (즉, 10 분) 세포 생존 능력을 감소 것입니다.
  3. 15 또는 50 mL 원심 분리기 튜브, 해 동된 튜브의 수에 따라 셀 전송.
  4. Dropwise (5 방울 30 초 마다) 미리 데워 진된 (37 ° C) cardiogenic 미디어 (표 1) 셀 솔루션을 분배. 1:3 cryopreservation 미디어까지이 과정을 계속: cardiogenic 미디어 비율에 도달. 이 시점에서, 1시 10분까지 cardiogenic 미디어 추가 속도 증가 cryopreservation 미디어: cardiogenic 미디어 비율에 도달.
    참고: 중요 한: 빠른 osmolarity 변경 과정에서 녹고; 세포 죽음을 증가할 것 이다 따라서, cardiogenic 미디어의 dropwise 또한 위에서 설명한 대로 좋습니다.
  5. 원심 (200 x g 3 분)에 의해 세포 현 탁 액 및 펠 릿 세포를 원심.
  6. 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 터치 하는 원심 분리기 튜브 셀 펠 릿을 꺼내.
  7. 다시 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충 하는 cardiogenic 미디어와 셀을 일시 중단 합니다.
    참고: 셀 생존 thaw 해 동에서 하 고, 일반적으로 다를 수 있습니다, 그리고 > 65% 생존 예측 좋은 도금 효율.
  8. 도금에 대 한 원하는 셀 농도를 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충 하는 cardiogenic 미디어와 희석 집중 세포 현 탁 액 (다른 판 형식에 대 한 표 2 참조).
    참고: 중요 한: 주의 심장 분화 효율 셀 너무 띄엄띄엄 시드 경우 거부할 수 있습니다.
  9. 접시에 시드 셀입니다.
  10. 조직 문화 인큐베이터에 그것을 전송 하기 전에 20 분 동안 조직 문화 후드에서 플레이트를 유지.
  11. 차별화의 날 6, 셀 첨부 파일을 모니터링 합니다.
    참고: 심장 창시자는 차별화의 5 일에 cryopreserved는. 셀을 녹고 후 24 h는 차별화의 6 일에는 것입니다.
    참고: 부동 (죽은) 세포의 존재를 일반적입니다.
  12. 7 일에는 미디어의 50%를 발음 하 고 신선한 cardiogenic 미디어의 동일한 금액으로 바꿉니다.
    참고: cardiogenic 미디어 로/바위 통로 억제제의 추가 필요 하지 않습니다이 시점 이후.
  13. 매일 cardiogenic 미디어와 미디어의 50%를 교체 합니다.
  14. 참고를 꺾고 자발적인 11 일과 13 일 사이 나타납니다.
  15. 15 일에 DAPI (핵 얼룩) 및 ACTC1를 사용 하 여 면역 형광에 의해 심장 분화 효율을 계량 (팬 심장 마커).

7. 합격 및 심 실 같은 Cardiomyocytes의 유지 보수

참고: 하루 14 ~ 16, 자발적으로 심 실 같은 cardiomyocytes 계약의 단층 해야 얻을 수 있습니다. 이 시점에서, 그것은 해리 하 고 다시 접시 cardiomyocytes 문화를 균질 하 고 셀 접시에서 분리 하는 것을 방지 하기 위해 좋습니다.

  1. 우물에서 모든 미디어를 발음 하 고 신속 하 게 미리 따뜻하게 (37 ° C) 1 분리 시 약 포함 하는 효소의 1 mL를 추가 합니다.
    참고: 포함 하는 효소 분리 시 볼륨 x 1 플레이트 형식에 따라 다르지만 완전히 잘 표면의 바닥을 커버 해야 합니다.
  2. 조직 문화 인큐베이터에 접시를 전송 합니다.
  3. 부드럽게 흔들 플레이트 좌우로 분리 프로세스를 가속 화 하기 위해 인큐베이터 안에 매 2 분.
  4. 5-15 분 후 세포의 80% ~ 100%는 접시의 바닥에서 분리 때 인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 10 %FBS 미디어의 동일한 볼륨을 추가 하 여 포함 하는 효소 분리 시 약 활동 x 1을 억제.
    참고:이 프로세스에 대 한 1 x 효소 포함 된 분리 된 보육 시간 일괄 처리를 일괄 처리에서 달라질 수 있습니다.
  5. 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.
  6. 피펫으로 및 count 셀 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 세포 현 탁 액을 혼합.
  7. 원하는 셀 농도에 세포 현 탁 액 희석 (다른 판 형식에 대 한 표 2 참조) 유지 보수 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충.
  8. Cardiomyocytes 접시에 시드, 후 균등 하 게 셀 하 고 세포 조직 문화 인큐베이터에 접시를 전송 하기 전에 10-20 분에 대 한 연결을 허용 합니다.
  9. 다시 도금 후 h 24 모니터링 셀 첨부 파일 및 복구 합니다.
    참고: 부동 (죽은) 세포의 존재를 일반적입니다. 다시 도금 후 48-72 h, cardiomyocyte 자발적 수축을 재개 한다.
  10. Cardiomyocyte 문화를 유지 하려면 대체 미디어의 50% 유지 보수 미디어와 함께 매일 같은 심 실 cardiomyocytes의 사용까지 후속 실험에 대 한.

결과

HPSCs의 생성 I d 1 라인
hPSCs 중재 Id1 overexpression (그림 1A) lentivirus 감염 됩니다. HPSCId1 생성 됩니다 일단 transgene 식 qRT-PCR (그림 1B)에 의해 정량입니다. 그 GAPDH 0.005 배 보다 높은 레벨에서 Id1 mRNA 표현으로 하는 hPSCId1 선만 차별화 사용 되어야 한다.

hPSCs I d 1 유지 보수 및 D에 대 한 준비 ifferentiation
최적의 문화 조건이 필요 하 고 중요 한 성공적인 첫 필드 같은 심장 조상 차별화 (그림 2A) 심장. hPSCId1 문화 줄기 형태 유지 관리 및 지속적인 확산에 대 한 매일 모니터링 해야 합니다. 단단히 포장된 줄기 세포 식민지를 도달할 때 차별화를 시작 합니다 > 90 %confluency (그림 2B). 차별화가 시작 되는 최적의 confluency 이전 세포 죽음은 향상 하 고 분화 효율 (그림 2C)를 거부할 수 있습니다. 마찬가지로, 자란된 문화 제대로 (그림 2D)를 수행 합니다.

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자 (FHF L CPs)에서 세대 hPSCs I d 1
하루에 1 (24 h 게시물 차별화 개시), 셀 (셀 표시 아첨 하 고 줄기 세포 보다 어두운) 줄기 형태학의 손실을 관찰 하 모니터링 해야 합니다. 세포 죽음은 차별화, 첫날 있지만 셀 합류에 유지 한다 > 75% (그림 2E). 차별화의 24 h 후 대상된 면적의 50% 이상 손실 된 경우 셀을 폐기 해야한다.

3 일에 차별화 셀 클러스터 된 있어야 하 고 초기 24 시간 기간 (그림 2F) 동안 만든 격차를 가득. 독립적으로 성장 하는 플랫 셀 차선 분화 조건을 나타내는 있습니다.

하루에 4, 최적의 차별화는 지속적인 확장과 접시의 범위를 표시 합니다.

5 일에 세포는 수확 하 고 cryopreserved. 최적의 차별점 균질 형태학 모양 (그림 2G)와 밀접 하 게 연결 된 셀 클러스터 발생 한다. 참고 플랫 셀의 낮은 밀도 클러스터 차선 차별화 결과 표시 합니다. 다양 한 잘 당 5 심장 창시자 문화 형식 하루의 평균 수익률 표 2 를 참조 하십시오.

FHF L CPs에서 심 실 같은 Cardiomyocytes의 세대
하루 5 FHF L CPs는 플레이트 형식 종속 밀도 그들의 심장 감 별 법 잠재력을 극대화 하기 표 2에 설명 된 (그림 3A 와 표 2)에서 해 동. 녹고 후 생존 모니터링할 필요가 있다. 일반적으로, 생존 범위는 70-80%에서. 생존 능력 60%가 하 있는 경우에, cardiomyocytes의 수익률 영향을 받을 것 이다.

날 6 (24 h 차별화를 다시 시작한 후), FHF L CPs 커버 한다 > 90%의 사용 가능한 면적 및 셀 (그림 3B)의 유형이 같은 단일 레이어로 나타납니다. 6 일에 낮은 합류 cardiomyocytes에 FHF L CPs 차별화를 줄일 것입니다.

결과 cardiomyocytes 하루 11-13 (그림 3C 와 영화 1) 차별화의 려 시작 합니다. 하루 14-16 replating 프로세스 동안 다양 한 문화 형식에 잘 당 cardiomyocytes의 평균 수확량에 대 한 표 2 를 참조 하십시오. 분화 효율은 일반적으로 핵 (DAPI) 마커 및 혈관 내 피 마커 (CDH5), 섬유 (TAGLN), 심장 (ACTC1)에 대 한 면역 형광에 의해 평가 됩니다. 리니지 정량화 자동된 이미징 및 형광 정량화, 커닝 햄 외 에서 사용 하 여 수행 됩니다. (2017) 5 (그림 3D-E). 결과 cardiomyocytes의 하위 특성 qRT-PCR (그림 3F) 및 활동 전위 과도 분석 운동 이미징 및 전압 감지 프로브 (그림 3G 및 영화 2)를 사용 하 여 의해 수행 됩니다. 전압 프로브 및 결과 활동 전위 추적 분석 (그림 3H)에 대 한 형광 정량화는 McKeithan 외 에 설명 된 대로 수행 (2017) 7.

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그림 1: hPSC의Id1 라인. (A) hPSCsId1 세대 프로토콜의 도식 적인 표현입니다. QRT-PCR 결과 hPSCId1 한 hESC 라인 등의 뚜렷한 선과 hPSC 라인의 두 줄에서 중재 lentiviral 표현식에 의해 생성 하는 대표적인 Id1 mRNA 레벨을 보여주는 (B) 예. 파선은 Id1 식 임계값을, 어떤 hPSCId1 아래 라인 Id1 lentivirus 감염의 추가 사이클을 받이 필요가 나타냅니다. "p" 통행 수를 나타냅니다. 괄호에 번호 Id1 lentiviral 감염의 라운드의 수를 나타냅니다. 오차 막대는 3 중에서 수행 하는 실험의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 2: 세대의 첫 번째 심장 Field-Like 심장 창시자 (FHF L CPs) 차별화에서 hPSCId1. (A) FHF L CP 세대 프로토콜의 도식 대표. HPSC 최적 (B),Id1 (0 일)의 대표적인 밝은 필드 사진 하위 합칠 (노란색 화살표 표시 셀 사이의 빈 영역) (C) 와 오버 합칠 (D) 밀도. 하루에 1, hPSCId1 차별화의 대표적인 밝은 필드 사진 3과 5를 각각 (E), (F), (G). 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 3: 심 실 같은 Cardiomyocyte FHF L CPs에서의 세대. (A) 심 실 같은 cardiomyocyte 세대 프로토콜의 도식 적인 표현입니다. (B) (1 일 후 녹고) 하루 6 분화 세포의 밝은 필드 이미지. 하루 12 잔 문화 (C) 밝은 필드 이미지. 하루 15 문화 (384-잘 플레이트 형식)의 (D) 대표적인 면역 형광 이미지. ACTC1 표시 cardiomyocytes, TAGLN: 섬유 아 세포/부드러운 근육, CDH5: 혈관 내 피 세포와 DAPI: 핵 (는 삽입 참조). (E) 하루 15 문화의 계보 정량화. ((F)) qRT-PCR 데이터 시간 코스 식 5 일에서 하루 25 심 실 전용 마커 (IRX4 및 MYL2) 및 팬 심장 마커 (MYL7)입니다. 차별화의 하루에 25 실의 같은 cardiomyocytes에서 (G) 대표 활동 전위 추적입니다. (H) 활동 전위 기간 (APD50 및 APD90)의 측정 결과 심 실 같은 cardiomyocytes (n = 12). 오차 막대 (별도로 지정 되지 않은 경우) quadruplicate에서 수행 하는 실험의 표준 편차를 나타냅니다. 바 규모 = 100 µ m. RFU, 상대 형광 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

매체기본 매체첨가제
줄기 세포 미디어mTesR1n/a
유도 미디어RPMI 1640 매체인슐린 없이 B-27 혈 청 무료 보충, 1 x
유도 미디어RPMI 1640 매체Puromycin, 6 µ g/ml
유도 미디어RPMI 1640 매체페니실린-스, 1 x
Cardiogenic 미디어RPMI 1640 매체B-27 혈 청 무료 보충, 1 x
Cardiogenic 미디어RPMI 1640 매체페니실린-스, 1 x
미디어 유지 관리RPMI 1640 매체B-27 혈 청 무료 보충, 1 x
미디어 유지 관리RPMI 1640 매체녹아웃 혈 청 교체, 2%
미디어 유지 관리RPMI 1640 매체페니실린-스, 1 x

표 1: 미디어 구성 요소 (기본 미디어 및 첨가제 재료의 표 참조).

384 잘96 잘12 잘6 잘100 m m150 mm
(잘) 당 코팅 볼륨10 Μ L50 Μ L500 Μ L1 mL5 mL10 mL
중간 볼륨
(잘) 당		100 Μ L300 Μ L2 mL5 mL12 mL30 mL
차별화 0 activin 농도 (ng/mL)100100100300
심장 시 조
제 5 일 수익률
(셀/잘)		1.0-1.2 10 x5 2.5-3.0 10 x5 1.0-1.5 10 x7 2.0-3.0 10 x7
심장 조상 하루 5 replating 또는 밀도 (셀/잘) 녹고2.0 x 104 7.5 x 105 4.5 x 106 8.0 x 106 2.2 x 107
심 같은 cardiomyocyte
14-16 일 수익률
(셀/잘)		2.0-5.0 10 x4 0.8-1.2 x 106 3.5-5.0 x 106 0.8-1.2 x 107 1.8-2.5 10 x7
심 같은 cardiomyocyte 밀도 replating
(셀/잘)		2.5 x 104 1.0 x 106 4.5 x 106 1.0 x 107 2.2 x 107

표 2: 확장 가능한 차별화 매개 변수 (코팅 볼륨, 중간 볼륨, Activin A 농도, 밀도 replating 수확량).

유전자 이름유전자 은행 가입시퀀스
GAPDHNM_001256799F: GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT
R: GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
마우스 Id1NM_010495F: CCTAGCTGTTCGCTGAAGGC
R: CTCCGACAGACCAAGTACCAC
IRX4NM_016358F: GGCTCCCCAGTTCTTGATGG
R: TAGACCGGGCAGTAGACCG
MYL2NM_000432F: TTGGGCGAGTGAACGTGAAAA
R: CCGAACGTAATCAGCCTTCAG
MYL7NM_021223F: GCCCAACGTGGTTCTTCCAA
R: CTCCTCCTCTGGGACACTC

표 3: qRT-PCR 뇌관 시퀀스입니다.

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영화 1: 밝은 필드 녹음 (100 프레임/s) 하루 15 cardiomyocytes 자발적 수축을 관찰할 수 있다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)

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영화 2: 하루 25 id1 유발 심 실 같은 cardiomyocytes에 전압에 민감한 형광 프로브의 운동 영상 (100 프레임/s). 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)

토론

성공적인 차별점에 대 한 밀접 하 게 지침에 따라 위에 나열 된 확인 합니다. 또한, 여기 우리가 강력 하 게 차별화 결과 영향을 주는 주요 매개 변수 강조 표시 합니다. 감 별 법을 시작 하기 전에 다음 세 개의 매개 변수 형태를 관찰 해야 합니다: hPSCsId1, 높은 세포 압축 및 높은 합류의 줄기 형태 (> 90%) 0에서 문화. 그런 측면에서 최적의 차별화 조건 단일 세포로 도금 해리 hPSCsi d 1 에 의해 만들어집니다 가장 하 고 형태를 밀접 하 게 그들을 수 있도록 클러스터 성장 monolayers ~ 90% 합류 2 ~ 3 일의 과정. 반대로, hPSCId1 문화 쇼 가난한 셀 및 식민지 형태학, 낮은 식민지 압축 및 문화 내에서 차별화의 큰 분야의 존재, 성공적인 FHF L CP 차별화 가능성이 되지 않습니다.

미디어 볼륨 및 Activin A 농도 FHF L CP 차별화 및 플레이트 형식 의존 ( 표 2참조)의 중요 한 매개 변수가 있습니다. 또한 최적의 Activin A 농도에 따라 다를 수 있습니다 점에 유의 hPSC 라인을 사용 하 고 농도 최적화를 해야 할 수도 있습니다.

HPSCs에 Id1 mRNA 수준은입니다 효율적으로 홍보 FHF L CP. 차선 Id1 수준 강력한 FHF L CP 차별화를 생산 실패 하 고 차별화의 1 하루에 의해 대규모 세포 죽음 관찰 될 것 이다 중요 한. -투-GAPDH Id1의 상대 식 비 효율적인 분화를 촉진 하는 0.005를 초과 해야 한다. Puromycin (6-10 µ g/mL)의 높은 복용량을 사용 하 여 지속적인된 선택 lentiviral 중재 Id1 식의 높은 레벨을 유지 하려면 것이 좋습니다. Id1 mRNA 수준 평가 10 구절 마다 것이 좋습니다.

5 일의 밀도 도금 FHF L CPsis 또한 심장 분화 효율에 대 한 중요 한 매개 변수. 경우 하루 5 FHF L CPs는 낮은 밀도에서 도금, 상대 심장 수율 저하 됩니다. 최적의 도금 밀도 표 2 에 나열 되며 플레이트 형식에 따라 다릅니다.

이 프로토콜에 대 한 주요 제한 결과 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes의 치료 사용을 제한할 수 있습니다 promoteFHF L CP 차별화에 Id1 overexpression lentiviral 중재의 사용 이다. 또한, 때문에 lentiviruses 사이트에 통합할 수 있습니다 그 수 잠재적으로 영향 hPSC 유지 보수 및 개발 잠재력, stemnessId1 식민지 hPSCs의 모니터링 해야 평가 하 여 줄기 유전자 발현 및 형태학 징후 관찰 감 별 법입니다. 참고는이 제한을 극복 하는 것 하 고는 현재 저희 연구실에서 조사 되 고 비 통합 벡터를 사용 하 여 Id1 overexpressing.

이 방법의 한 편리한 기능만 한 cytokine, Activin A, FHF L CPs hPSCsi d 1에서 생성 하 요구 하는 때 분화 프로토콜의 단순입니다. 비교에서는, 다른 프로토콜 9,10,11,12,13,,1415 cytokines의 조합의 복잡 한 시퀀스 요구 및/또는 홍보 하 고 심장 차별화를 유지 하기 위해 작은 분자. 또한,이 프로토콜 고유 하 게 연결을 푸십시오 FHF L CP 세대 후속 cardiomyocyte 생산에서을 가능 하 게 편리한 cryopreservation 단계를 설명 합니다. 이 기능을 biobank 큰 일괄 처리를 사용 하면 하루 5 녹고 시에서 심장 차별화로 다시 FHF L CPs의와 신속 하 게 생성 cardiomyocytes 냉동된 창시자에서. 이 전략 hPSCs에서 심장 차별화를 시작 하는 것에 비해 시간 2 주 1을 얻을 수 있습니다. 또한, 그리고 가장 중요 한 것은,이 프로토콜은 다른 프로토콜9,,1011,12 동안 정의 된 심장 필드 출신의 심장 창시자를 생성 하는 날짜에 첫 번째 프로토콜 ,13,,1415 남아 그런 측면에서 정의 되지 않은.

요약,이 프로토콜을 대량 생산 하는 강력 하 고 확장 가능한 방법 설명 (> 108– 109) 발달 관련 FHF L CPs 및 심 실 같은 cardiomyocytes. 차례로 결과 세포 심장 차별화 및 생리학, 소설 규정 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다에 대 한 재생 및 질병 모델링 목적.

공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 유용한 토론 Colas 실험실의 구성원 및 원고의 중요 한 리뷰 감사합니다. 이 연구는 NIH/NIEHS R44ES023521-02에 의해 지원 되었다 고 CIRM DISC2-10110 박사 Colas를 부여 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ACTC1 항체SigmaA7811
Activin AStem Cell TechnologiesHu Recom Activin A
Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti)Thermo Fisher Scientific15240062
B27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
B27 supplement w/o - insulinThermo Fisher ScientificA1895601
B27 보충제 w/o - 비타민 AThermo Fisher Scientific12587001
CDH5 항체R& D SystemsAF938
CryoStor CS10줄기세포 기술7930냉동 보존 시약
DMEM 고포도당Mediatech10-013-CV 
DPBS w/ Ca & MgCorning21-030-CV
EDTAThermo Fisher Scientific15575-038
FBSVWR89510-186
FluoVolt 막 전위 키트   Thermo Fisher ScientificF10488광학 작용 전위 획득에 대해서는 McKeithan et al. 2017
KnockOut Serum ReplacementGibco10828010
Matrigel, Growth Factor ReducedCorning356231Coating reagent
mTeSR1 media kitStem Cell Technologies5850
PBS w/o Ca & MgCorning21-040-CV
페니실린-스트렙토마이신Gibco
Puromycin Acros227422500
ReLeSR줄기세포 기술5872무효소 해리 시약
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093
TAGLN 항체Abcamab14106
ThiazovivinStem Cell Technologies72254RHO/ROCK 경로 억제제
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12605 -0101X 효소 함유 해리 시약
Tyrodes 용액 혼합 패킷   SigmaT2145-10X1L(광학 작용 전위 획득에 대해서는 McKeithan et al. 2017 참조)

참고문헌

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1Id1Activin A
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