살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

Summary

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

Abstract

Subcompartments 세포에 있는 단백질의 지역화에 대 한 지식을 그들의 특정 한 기능을 이해 하는 것이 결정적 이다. 여기, 우리는 지역화를 생성 하 고이 단백질의 지도 추적 하 여 단백질을 위해 액세스할 수 있는 microcompartments의 결정에 대 한 수 있도록 슈퍼 해상도 기법 제시. 또한, 멀티 컬러 지역화 현미경으로 지역화 및 추적 프로필 다른 subcompartments에 있는 단백질의 얻을 수 있습니다 동시에. 기술은 살아있는 세포에 대 한 특정 이며 단일 모바일 막 단백질의 반복적인 이미지에 기반. 관심사의 단백질 유전자 특정, 소위 자체 라벨 태그와 융합 된다. 이 태그는 기판 공유 방식으로 반응 하는 효소. 이러한 기판에 활용 된 형광 염료입니다. 형광과 효소 태그 단백질의 반응 레이블이 단백질에 기판 결과 표시. 여기, Tetramethylrhodamine (TMR)와 실리콘 Rhodamine (선생님)는 효소의 기질에 부착 된 형광 염료로 사용 됩니다. NM 범위에 오후에 기질 농도 사용 하 여 하위 화학 량 론 라벨 이루어집니다 뚜렷한 신호 귀착되는. 이러한 신호 ~ 15-27와 지역화는 nm 정밀도. 기술을은 사용할 수 막 투과성 염료와 효소 레이블이 자체적으로 지정 하는 것이 레 퍼 토리에 의해 색상 수는 제한 하는 의하여 단일 분자의 멀티 컬러 이미징 할 수 있습니다. 우리 품질 관리 효소 (Pten)의 지역화를 결정 하 여 기술의 타당성을 보여줍니다-다른 막 단백질에 관하여 처리 하는 동안 다른 미토 콘 드 리아 구획에 니 1 (PINK1)을 유발. 단일 분자 무서 워 또는 공동 추적에 의해 다르게 레이블이 단일 단백질 간의 진정한 실제 상호 작용에 대 한 테스트는 제한 하지만, 낮은 라벨도 두 개의 인접 한 단백질을 동시에 표시 하는 데에 대 한 확률 감소 때문입니다. 기술은 단백질 막 구획에 이미징에 대 한 강한 동안, 대부분의 경우 높은 모바일 수용 성 단백질의 지역화가 결정 적합 하지 않다.

Introduction

이 프로토콜의 목표는 지역화 하 고 단일 막 단백질 라이브 셀 내부를 추적 하는 이미징 방법 제공. 추적 및 지 방화 현미경 검사 법 (TALM)^1,2이 메서드를 호출 하 고. 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍)³ 와 같이 형광 Photoactivation 지역화 현미경 검사 법 ((F) 팜)^4,5, TALM 단일 분자 기반 형광 지역화 기술 이다. 그러나, 그것은 동일의 반복적인 이미지와 함께 조합에 있는 막 단백질의 이동성 표시 계시 한다 다른 위치에 분자 microcompartment 모바일 단백질에 대 한 액세스할 수 있는 방식으로 구분 됩니다. 즉, 단백질의 가능한 국부 세포 기관이의 건축 및 단백질¹의 이동성에 의해 설정 됩니다. 메서드는 지역화 및 탄도 이미징 모바일 단백질에 의해 지도 계시 한다 때문에 다양 한 다른 슈퍼 해상도 기법^6,,78 보완. 라벨은 se 당 비 형광은 유전자 조작된 융해 단백질을 사용 하 여 기반으로 합니다. 이 융해 단백질은 자체 효소 반응 covalently 염료에 활용 된 기판 레이블이 지정 됩니다. 이 절차는 라벨도 될 수 있는 이점이 있다 추가 된 기판의 크기에 의해 제어. 또한, 그것은 선택한 활용된 염료에 따라 형광의 색상을 다양 하 게 있습니다. 여러 자체 라벨 효소-태그는 사용할 수⁹. 또 다른 장점은, 사용 하는 자체 효소 태그 라벨 활용된 염료를 일반적으로 더 안정적이 고 밝은 형광 단백질¹ 와 개별 단백질 따라서 기록 될 수 있습니다 더 이상 보다는 더 정확 하 게 때까지 그들은 표백. 모바일 단백질의 궤적의 녹음 및 확산 계수^10,11의 추출에 대 한 수 있습니다.

여기, 우리는 미토 콘 드 리아 멤브레인 단백질, TALM의 타당성 입증 하지만 그것은 또한 다른 세포 유형^12,13를 포함 하 여 다른 내부 및 여분 cellular 막 단백질에 적용할 수 있습니다. 우리 다 색 TALM 추가 기존 슈퍼 해상도 형광 현미경 검사 법 기술^14,15, 보완성에 다른 subcompartments에 있는 단백질의 동시 구별에 대 한 허용 표시 ¹⁶. TALM 라이브 셀 이미징¹⁷와 호환 됩니다. 사진-물리학 선택한 rhodamines Tetramethylrhodamine (TMR)와 실리콘-Rhodamien (선생님)의 특히 그들의 밝기와 안정성, 수 있게 기록 단일 막 단백질 지역화 (및 궤적) 지도 제공 하는 여러 프레임에 걸쳐. 그러나 모션 블러는 너무 높은 때문에 프레임 마다 수집 된 광자는 적절 한 지역화를 위해 너무 낮은, TALM 높은 확산 계수와 수용 성 단백질의 지역화에 대 한 제한 됩니다. 게다가, TALM phototoxic 효과 감소 예 폭풍 또는 자극 방출 소모 (호텔 위치) 현미경^6,7, 보다 전원을 적게 필요 합니다. 이것은 phototoxic 스트레스는 종종 organellar 형태학¹⁸ 및 따라서 이동성 분석¹⁹영향을 때문에 중요 한. 합계에서는, 선물이 살아있는 세포에 다 색 TALM 지역화 현미경 방법 폭풍/호텔 위치 사이의 간격을 채우는 기술 (F) 팜 및 photobleaching 후 단백질 이동성 형광 복구 등을 분석 하는 기법 (졸라)^{20 / ,21}, 형광 상관 분광학 (FCS)²², 그리고 형광 상관 분광학 (FCCS)^11,23크로스.

Protocol

다음 프로토콜 로컬 기관 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

1입니다. 방법

1. 세포 배양
   1. 배양 세포, 예를 들면 HeLa 세포 (인간의 자 궁 경부 암), T25 셀 문화 플라스 크 포함 하는 37 ° C, 5% CO₂성장 매체의 5 mL에.
      참고: 이미지에 대 한 준비 coverslips (1.3과 1.4 단계 참조)에 셀을 분할 하 고 영상 매체에 유지.
2. 세포 transfection
   참고: 사용 가능한 태그 단백질을 안정적으로 나타내는 셀 라인을 피하기 위해 강력한 overexpression²⁴ . 일시적인 transfection에 대 한 플라스 미드 DNA transfection에 대 한 사용 금액을 적응. 예를 들어 Ca^{2 +} 인산 transfection²⁵ 를 사용 하는 경우에 셀 (80-90 %confluency) 플라스 미드 DNA의 2.5-5 µ g으로 3.5 cm 세포 문화 접시에 transfect. 더블 transfection를 수행할 때 각 플라스 미드 구조 당 2.5 µ g를 사용 합니다.
   1. 듀얼 컬러 실험에 대 한 하나의 자체 라벨 단백질의 안정적인 식이 셀 라인을 사용 하 고 뚜렷이 다른 자체 라벨 단백질¹⁷인코딩 플라스 미드와 transfect.
      참고: 여기, 듀얼 컬러 실험, HeLa 세포 사용 되었다 안정적 PINK1-헤일로-태그와 Tom20-fSNAP 셀프 라벨링 단백질을 표현.
3. Coverslips의 청소
   1. 장소는 비 커에 coverslips입니다. coverslips를 포함 하는 비 커에 H₂O의 30 mL를 추가 하 고 부드럽게 흔들어 그들의 표면에서 먼지를 제거 하.
   2. 핀셋으로는 coverslips를 수집 하 고 질소의 흐름과 함께 그들을 건조.
   3. 플라즈마 청소, 예를 들어, coverslips의 표면에 유기 오염을 제거 합니다.
      참고: 추가 유리 재료의 오염을 피하기 위해, 처리는 coverslips의 중 장갑을 착용 합니다.
      주의: coverslips 플라즈마 청소 여 청소를 하는 경우는 coverslips의 위 측에만 청소; 폴 리-L-리-폴 리 에틸렌 글리콜-아르기닌-글리신-aspartate (PLL-말뚝-RGD) (섹션 1.4)로 코팅 한 셀 시드 (섹션 1.5)이이 측면을 사용 합니다.
4. PLL-말뚝-RGD와 Coverslip 코팅
   참고: PLL-말뚝-RGD는 폴 리 에틸렌 글리콜 (3000 다)와 cysteine-glycine-arginine-glycine-aspartate-serine (CGRGDS) 펩 티 드 연결 된 폴 리-L-리 신 (PLL) 파생. PLL 부정 청구 유리 표면에 고 못 브러시를 형성 한다. 충전된 형광 염료의 불특정 바인딩 대폭 줄어듭니다. 또한, RGD 모티브 integrin 수용 체의 신호 펩 티 드를 모방 하 고 그로 인하여 그렇지 않으면 쉽게 고착 하지 않는 셀의 integrin 중재 준수를 촉진.
   1. 앞에서 설명한²⁶으로 PLL-말뚝-RGD를 준비 합니다. 즉, 1 mL의 PBS에 PLL-말뚝-RGD의 0.8 mg 분해. 깨끗 한 coverslip의 상부에 PLL-말뚝-RGD 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다.
   2. 두 번째 coverslip 고 (위에 있는 PLL-말뚝-RGD 드롭)는 첫 번째 coverslip;에 거꾸로 그것의 깨끗 한 표면 배치 이 두 개의 coverslips 사이 PLL-말뚝-RGD 솔루션 사이에 발생 합니다.
   3. 신중 하 게 비 커에 샌드위치 coverslips를 배치 하 고 먼지가 없는 건조 한 환경에서 실 온에서 1 h에 품 어.
   4. 1 시간 후 물으로 coverslips를 완전히 커버 하는 비이 커에 H₂O의 30 mL를 추가 합니다.
   5. Coverslips는 서로에서 분리 될 때까지 부드럽게 비 커를 흔들.
   6. 핀셋을 사용 하 여 물에서 coverslips를 수집 하 고 질소 가스의 흐름에 따라 그들을 건조.
      참고: 코팅된 coverslips 저장할 수 있습니다 건조, 살 균 유리 뚜껑이 있는 페 트리 접시에에서 며칠에 대 한.
5. 이미징에 대 한 시료의 준비
   1. PLL-말뚝-RGD 코팅 표면 위 35 mm 셀 문화 접시에 단일 코팅된 coverslips 전송 및 영상 위에 매체의 2 개 mL를 추가.
   2. 영상 매체와 코팅된 coverslip 셀 문화 접시에 2 mL에 각 막 단백질에 자체 라벨 태그를 표현 하는 ~ 500000 trypsinized 셀 (200-500 µ L)를 추가 합니다. 얻기 위해 셀의 균일 분배를 보장 하기 위해 손으로 부드럽게 악수를 균일 하 게 셀 레이어.
   3. 80 %confluency이 때까지 셀에서 37 ° C, 5% CO₂ 를 품 어.
      참고: 셀 샘플 영상 전과 transfection 전에 1 한 일 시드 되어야 합니다. 안정적으로 표현 하는 관심사의 단백질, 세포 이미징 하기 전에 2 일 시드할 수 있습니다. 나중에, 성장 하는 coverslip에 셀만 몇 군데.
6. 태그 단백질의 라벨
   참고: 형광 기판 물 무료 DMSO에 해체 해야 한다. 1 µ M 형광 기판의 재고 솔루션을 사용 하 여 최종 레이블 농도 0.2-30 nM¹⁷때 좋습니다. 세포 내부 막 단백질 이미징, 막 투과성 형광 기판 사용 합니다.
   1. 따뜻한 물 욕조에 37 ° C에 영상 매체를.
   2. 뚜껑 2 mL 튜브에 미리 데워 진된 영상 매체의 1 mL를 플라스틱. 1 µ M 재고 솔루션 최종 라벨 솔루션을 준비 하에서 형광 기판의 0.2-30 µ L를 추가 (최종 농도: 0.2-30 nM).
   3. 소용돌이 10 라벨 솔루션 s.
   4. 대체는 coverslip에 셀으로 35mm 문화 접시에 있는 매체 (단계 1.5 참조) 준비의 1 mL에 의해 라벨링 솔루션.
   5. 20-30 분 동안 37 ° C, 5% CO₂ 라벨 솔루션에서 셀을 품 어.
   6. 셀 2 mL PBS의 한 번, 다음 두 번 매체 이미지의 2 mL 씻으십시오. 마지막으로, 셀 요리에 신선한 영상 매체의 1 mL를 플라스틱 하 고 적어도 1 시간에 대 한 37 ° C, 5% CO₂ 배양 기에 다시 샘플을 넣어. 이미징, 전에 영상 매체를 한 번 더 교환 합니다.
      참고: 처음으로 실험을 실행 하는 경우 상용 세포 기관이 특정 염료^27,28와 세포 얼룩 자체 레이블된 organellar 막 단백질의 올바른 대상으로 확인 합니다. 이 경우에, 자체 라벨 효소에 대 한 기판의 100-200 nM을 사용 하 여 강한 신호를 생성 하도.
7. 형광 구슬 샘플의 준비
   참고: 광 유를 결정 하 고 다른 채널의 이미지 정렬, 다 색 형광 구슬 (0.1 µ m) 사용 됩니다. 기록 된 이미지와 함께 두 개의 방출 채널에 대 한 관계 변환 매트릭스를 생성 됩니다.
   1. 구슬 순수한 H₂o. 1%의 솔루션을 희석
   2. 장소 5 방울 청소 coverslip에 5 개의 다른 위치에서 형광 구슬 준비 솔루션 (단계 1.3 참조).
   3. 건조 한 깨끗 한 벤치에 형광 구슬 샘플을 보자.
      참고: 샘플 다시 사용할 수 있습니다; 따라서, 오염 방지 4 ° c.에 그것을 유지 하는 알루미늄 호 일로 샘플을 커버

2입니다. 현미경

1. 실험적인 체제
   참고: 듀얼 컬러 단일 분자 이미징에 대 한 기본적인 현미경 시스템은 거꾸로 현미경에 기반: 그것은 다중 mode 광학 편광 단일 총 내부 반사 (사격)으로 monomode 섬유를 유지를 통해 결합 하는 두 개의 레이저 장비 콘덴서, TIRF, polyband 방출 필터, 이미지 스플리터와 매우 민감한 카메라 (그림 1)를 위한 석유 집중 목표. 사격 콘덴서는 입사 각도의 지속적인 튜닝는 피-, 높은 경사를 전환할 필요 고 적 층된 광학 시트 (매우 경사 얇은 조명 (힐로)²⁹)와 함께 TIRF 흥분 모드 최적화 침투 깊이입니다. 이미지는 매우 민감한 냉각된 검출기 시스템 획득, 예를 들어, 백업 조명 전자 멀티 충전 결합 된 장치 (EMCCD) 카메라 (양자 효율 QE > 90%) 또는 sCMOS 카메라 (QE > 80-90%).
   1. 그 나중 실험, 예를 들어, 10000 프레임 실험에 기록 하는 경우, 비드 샘플 또한 10000 프레임을 기록으로 동일한 조건 하에서 형광 구슬 (단계 2.2 참조) 이미징 하 여 광학 드리프트를 결정 합니다. 광학 드리프트의 결정에 대 한 첫 번째 프레임과 마지막 인수 프레임 (그림 1B)에 구슬의 위치를 비교 합니다. 필요한 경우 나중에 광학 드리프트³⁰ 이미지 시리즈를 수정 및/또는 드리프트 안정적인 환경을 사용.
   2. 주황색과 빨간색 형광 플러스 오렌지 형광 및 빨간 형광에 대 한 적절 한 방출 필터에 대 한 적절 한 색 성 빔 스플리터, 예를 들어, 필터 큐브를 장비. 적당 한 필터 이미지 스플리터를 장비. 두 채널 (그림 1C)에 단일 색상 샘플을 기록 하 여 다른 채널에 신호를 한 채널에서의 가능한 누수를 확인 합니다.

그림 1 : 광학 레이아웃입니다 다 색 추적 및 지역화 (TALM) 오렌지와 빨간색 미터. (A) 두 개 이상 여기 레이저, TIRF 콘덴서, TIRF 적당 한 목표, 이미지 스플리터와 민감한 카메라 거꾸로 현미경 설치. 삽입: 셀 안에 세포를 자극, 입사 빔 각도 설정 되어야 합니다 매우 달성 하기 TIRF에 대 한 중요 한 각도 경사와 광학 시트 조명 (힐로)을 적 층 하는 보다 작은. D c 1: Dichroic 거울 1; D c 2: Dichroic 거울 2입니다. EF: 방출 필터입니다. 다음 실험으로 동일한 프레임 속도 10000 프레임에 대 한 형광 구슬의 위치를 이미징 하 여 광학 드리프트에 (B) 테스트 (여기: 15 Hz). 처음 500 프레임 및 마지막 500 프레임의 연결 된 위치는 드리프트를 보여줍니다. 또한, 빨간색과 파란색에서 첫 번째 및 마지막 프레임의 위치와 병합 된 이미지를 최소한의 드리프트를 보여줍니다. 드리프트 신호의 중심 사이의 거리 시간으로 나눈 총 녹음, 여기 125 오후/미 신호, 여기 TMR 및 선생님의 명확한 구분에 (C) 검사입니다. 두 채널 (채널 1에 TMR)과 채널 2에서 경 3, 000 프레임에서 누적 합계 이미지 생성 되었다. 선생님^HTL Tom20 HaloTag와 TMR^HTL OxPhos 복잡 한 V-HaloTag에에 붙어 있었다. 색상은 거짓 색상입니다. 바 규모 = 100 nm (B) 및 1 개의 µ m (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 이미지 분할의 물리적 맞춤 이미지 생성
   참고: 장착 하는 coverslip에 준비 된 표본에 대 한 성가 샘플 홀더 수 사용 (그림 2A). 먼지, 등 샘플에 빠지지 않으려면 장소 문화 접시의 뚜껑 느슨하게 챔버, 위에 설치 하는 경우. 동일한 샘플 홀더 형광 구슬 또는 셀; coverslip 마운트를 사용할 수 있습니다. 세포는 군데 추가 0.5-0.8 mL 영상 매체의. 이미지 분할 2로 이미지를 분할 또는 더 괴기 하 게 채널을 분리 하 고 동일한 카메라에 그들 측면-의해-측면을 프로젝트. 이 프로세스는 잠재적으로 통과 뚜렷한 광학 경로 때문 채널 사이의 체계적인 왜곡을 소개 하 고 직접 colocalization 분석을 방해. 따라서, 실제 정렬 및 두 번째, 수행 후 보정 변환 매트릭스를 정렬. 두 정렬 프로세스에 대 한 형광 구슬 homogenously 보기의 필드에 걸쳐 배포 될 한다.
   1. 소계 (PTFE) 사이 샘플 홀더에 형광 구슬 가진 준비 된 샘플을 마운트-링과 빨간 고무 링 (그림 2A).
   2. 현미경, 모든 하드웨어 구성 요소, 그리고 현미경 검사 법에 필요한 모든 소프트웨어를 시작 합니다.
   3. 소 프로 파 놀과 접촉 보풀 조직 지우기와 목적과 coverslip 아래쪽을 청소. 다음 두 항목 모두 신선한 보풀 조직으로 건조. 대물 렌즈의 눈동자에 침수 기름 작은 물방울을 놓습니다.
   4. 하는 coverslip 하단의 연락처 기름 현미경 스테이지에 비드 샘플 샘플 홀더를 배치 합니다. 전송 빛 또는 레이저를 사용 하 여 구슬에 초점.
   5. 두 개의 형광 채널에서 비슷한 신호 강도 달성 하기 위해 두 여기 레이저의 파워를 조정 합니다. 많은 독특한 형광 신호 영역에 대 한 검색.
   6. 카메라 제어 소프트웨어를 사용 하 여 형광 채널의 병합 된 보기를 생성 합니다. 다음 수동으로 기울기 두 형광 채널 (그림 2B)에서 신호의 최고의 오버레이 달성 하기 위해 이미지 스플리터의 내부 거울 이미지 분배기에 나사를 사용 합니다.
      참고: 주의! 카메라의 동적 범위를 초과 하지 마십시오.
3. 맞춤 소프트웨어 공간 변환을 수행 하 여 괴기 하 게 분리 된 채널을
   참고: 다음 부분 후 교정 맞춤 및 우리의 소프트웨어 플러그인 (요청 시 사용 가능)와 지역화 절차를 보여 줍니다.
   1. TIRF 현미경 제어 소프트웨어를 시작 하 고 라이브 스트림 모드에서 개별 채널을 표시 하려면 선택 합니다. 모든 채널 (그림 2C)에 스냅숏 이미지 흥미로운 형광을 가져가 라.
   2. 이 스냅숏 이미지를 사용 하 여 변환 매트릭스를 생성 ( 그림 2참조).
      참고: 변환 매트릭스 공간 변환, 일반적으로 유사 하나, 번역 (단일 포인트 소스 두 채널 사이에서 신호 발산)에 대 한 해결을 위해 사용 됩니다.
   3. 소프트웨어 분석 플러그인을 시작 ( 그림 2C참조 하십시오 우리의 실험실에서 요청 시 얻어질 수 있다).
   4. 소프트웨어에 형광 구슬 (단계 2.2 참조) 이전에 기록 된 듀얼 컬러 이미지를 로드 합니다. 형광 채널의 사용된 방향을 선택 합니다.  '예' '이미지 보정'에 대 한 질문 받을 때 클릭 하 고 이전 찍은 스냅샷 선택 합니다.
   5. 단위 변환 요인 (픽셀 크기, 프레임 속도, 광자 변환 인수)를 정의 하려면 "장치 관리자"를 엽니다.
   6. "지역화 관리자"를 엽니다. 지점 확산 기능 (PSF)를 먼저 확인 합니다. 단추: "PSF 반경". "PSF 견적" 창이 열리면 정의 숫자 조리개와 최대 방출. 시작 "견적 PSF 반경"를 클릭 하 여. 평가 상자를 얻은 실험 PSF. 정의 수락, 디플레이션 루프의 수 및 얼마나 많은 코어 컴퓨터의 계산을 위해 사용 된다. "지역화" 2D 대칭 가우스 함수 (그림 2C) 단일 입자의 강도 분포를 피팅 시작을 누릅니다.
   7. "수락" 얻은 실험 PSF. 정의 평가 상자, 디플레이션 루프의 수 및 얼마나 많은 코어 컴퓨터의 계산을 위해 사용 된다. "지역화" 2D 대칭 가우스 함수 (그림 2C) 단일 입자의 강도 분포를 피팅 시작을 누릅니다.
   8. "교정 관리자"를 엽니다. 두 채널의 렌더링된 병합 된 이미지에서 원래 신호 및 지역화 된 센터 표시 됩니다. "" 모드를 선택 합니다. 수동으로 연결 선을 그려 같은 형광 구슬에서 유래 하는 두 개의 채널에 지역화 된 센터의 해당 쌍을 연결 합니다.
   9. 보기의 필드를 통해 모든 배포 해당 신호를 연결 합니다. 이 후, "동의"를 누릅니다. 보정을 저장 합니다.
      참고: 공간 변환 각 형광 구슬에서 샘플 이며 사이 보간됩니다. 추출 된 변환 함수 이후에 그들은 그들의 지역화 정밀도 내에서 중첩 되도록 실험 듀얼 컬러 단일 분자 지 방화를 수정 하는 데 사용 되는 변위 필드 Δr(x,y)를 나타냅니다. 공간 변환 매트릭스는 일반적으로 번역, 스케일링, 및 회전 나노미터의 정확도와 채널 간의 해결 관계 한 고이 수동 일대일 매핑 (그림 2C)에서 추정 될 수 있다.

그림 2 : 듀얼 컬러 정렬에 대 한 워크플로. (A) 형광 구슬 coverslip 샘플 홀더는 PTFE와 고무 링 사이 마운트되어. 다음 챔버의 상단 및 하단 부분 함께 나올입니다. 이미지 분할에 의해 생성 되는 채널 조회의 (B) 실제 맞춤입니다. 두 개의 채널에 구슬 (0.1 µ m)에서 형광 신호를 기록 (녹색 및 빨강, 거짓 색) 병합 됩니다. 다른 신호의 최고의 오버레이 달성 될 때까지 광학 이미지 분배기에 해당 나사는 수동으로 설정 되어 (노란색, 하단 패널). (C) post-processive 채널 정렬에 대 한 변환 매트릭스의 세대. 입자의 정확한 지역화, 지점 확산 기능 (PSF) 방출 파장 및 목표의 숫자 조리개에 대 한 의존에 확인할 필요가 있다. 센터는 PSF의 맞는 대칭 2 차원 가우스에 의해 분석 된 강도 프로 파일에 의해 결정 수 있습니다. 신호 피크의 결과 지역화 다음 원래, 흐리게 신호에 예상 된다. 병합된 이미지에 두 개의 채널에서 신호의 지역화 된 센터 나중 실험 데이터의 post-processive 정렬에 사용 되는 변환 매트릭스를 생성에 연결 됩니다. 스케일 바 = 1 개의 µ m (B, C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

4. 미토 콘 드 리아 멤브레인 단백질의 단일 분자 이미징
   참고: 모든 실험 상 온에서 수행 됩니다. T-세포 또는 비 부착 한 세포 해야 될 움직일 수 agarose에서³¹이미징 하기 전에.
   1. 고무 및 PTFE 반지 (그림 3A) 사이 coverslip에 부착 세포 견본을 탑재 합니다. 0.5-0.8와 챔버를 입력 매체를 이미징 하는 mL.
   2. 2.2.2–2.2.5 단계를 반복 합니다.
   3. 조명 각도 TIRF 현미경 힐로 시트³² (힐로 모드, 그림 1A)을 통해 관심의 특정 영역을 흥분 시키기 위해 사격 모드에 대 한 중요 한 각도 보다 작은 입사 각도 만드는 소프트웨어 제어를 조정 합니다.
      주의: 레이저 빔으로 직접적인 눈 접촉을 피하십시오!
   4. EM 이득을 설정 하 고 프레임 마다 충분 한 광자를 수집 하는 실험에 대 한 적당 한 노출 시간을 선택 합니다.
   5. 레이저 파워 달성 이후 지역화 정밀 직접 S/N³³ (그림 3C)에 해당 (S/N) 비율 (그림 3B), 소음에 높은 신호를 설정 합니다.
   6. 겹치지 않는, 길쭉한 미토 콘 드리 아와 단일 분자 신호 (3D 그림; 세포 주변에 있는 영역을 찾기 보조 비디오 1)입니다. 없는 단일 분자 신호 표시 되는 경우 단일 분자 신호 (그림 3E)의 외관에 결과 표백까지 기다립니다.
   7. 신호 수까지 기록 합리적인 계속 (보통 형광 염료, 그림 3 층의 표백 동작에 따라 1000-10000 프레임) 너무 낮습니다.
   8. 영상 처리 소프트웨어 및 미토 콘 드리 아 구조 확인 적어도 1000 기록 된 프레임 (그림 3)의 이미지를 렌더링된 누적 합계를 생성 하 여 시작 합니다.
      참고: 가장 빠른 가능한 프레임 속도 판독 영역에 의해 결정 됩니다. 1 개 채널 보기의 필드 256 x 512 픽셀, 그리고 쿼드-색상 256 x 256 픽셀을 위해 듀얼 컬러 이미지 분배기 (512 x 512 픽셀)으로 감소 된다. 따라서, 두 가지 색상에 대 한 이미지 분배기를 사용 하 여, 이것이 30 Hz. 설정 프레임 전송 모드는 가장 낮은 가능한 판독 시간을 달성 하기.
   9. 소프트웨어 분석 플러그인 및 부하 원시 데이터를 시작 합니다. 채널 방향 및 로드 이미지를 선택 합니다. 단계의 2.3.9 때 "보정 이미지"에 대 한 변환 매트릭스를 사용 합니다. 채널 별도로 표시 됩니다.
   10. 각 채널에 대 한 단위 변환 요소를 정의 하기 전에 "장치 관리자"를 엽니다. 각 채널에 대 한 "지역화 관리자"를 엽니다. 다음 계산에 사용 되는 컴퓨터의 얼마나 많은 코어 설정 및 사용 조건에 대 한 이론적인 PSF 추가 평가 상자, 디플레이션 루프의 수를 정의 합니다. 마지막으로, 지역화 된 단일 입자 (그림 3 H;를 "지역화"를 누릅니다 보조 비디오 2)입니다.
   11. 참고 프로그램 마지막으로 보여주는 누적 해상도 이미지를 생성 합니다 모든 입자 (그림 3I) 지역화.
   12. 예를 들어, 오픈 소스 소프트웨어 또는 요청 시 사용할 수 있는 소프트웨어에 의해 분석을 수행 합니다.
   13. 예를 들어, 다중 표적 추적¹⁰ 모두 지역화 된 채널에 단일 분자를 추적
       참고: 단계 2.4.13 경계 조건을 올바르게 설정 하는 관심사의 단백질의 diffusibility에 대 한 예비 (실험) 지식이 필요 합니다. 일반적으로, 올바른 경계 조건을 찾는 반복 프로세스입니다.

그림 3 : 단일 분자 지 방화 현미경 검사 법 중 단계. (A) A coverslip 표본으로 만든 샘플 홀더 (J. Bereiter에 의해 한 설계)의 상단 및 하단 부분 (회색) 사이 탑재. (적색) 고무 링 및 PTFE 반지 (화이트) 인감 시스템에서 위와 아래는 coverslip 때 샘플 홀더 부품 볼트 함께. TMR 신호 잡음 비율 (B) 신호. (C) 모든 지역화 된 입자에 대 한 지역화 정밀 히스토그램을 계산. (D) 이미징, 여기, 명확 하 게 분리 된 미토 콘 드리 아와 세포 주변에 대 한 합리적인 영역의 선택. (E) 녹화 및 이미지 처리: 고유한 단일 분자 신호와 단일 프레임 표시 됩니다 (여기서, CV-HaloTag/TMR^HTL 의 단일 분자 기록 했다). (F) 강도의 TMR 녹화 시간 동안. (G) 3000 프레임, 처리 되지 않은 이미지를 누적 합계. (H) 입자의 이력서-HaloTag/TMR^HTL 단일 프레임에서 2D 가우스 기능 지역화. (나) 누적, 합계 이미지 3000 프레임에서 모든 지역화 된 CV-HaloTag/TMR^HTL 입자를 렌더링. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Results

멀티 컬러 이미징 및 colocalization 분석은 단백질의 하위 organellar 지역화가 결정을 도울 수 있다. 우리가 시연이 이전 cytosolic 인산 가수분해 효소와 tensin homologue, PINK1, 미토 콘 드 리아 프로 테아 제¹⁷에 의해 그것의 처리로 인해 다른 하위-미토 콘 드리 아 위치는. PINK1 미토 콘 드 리아 기능^34,35보장 하는 중요 한 요소 이다. 처리 (그림 4A), 라이브 셀과 멀티 컬러 슈퍼 해상도 현미경 동안 다른 미토 콘 드 리아 구획에 PINK1 지역화 수행한 결정 합니다. 따라서, PINK1 유전자 자체 라벨 태그 (HaloTag)에 융합 했다. 확인 하려면 그 지역화 기능 및 역 기능 mitochondria에서...

Discussion

여기, 듀얼 컬러 단일 분자 지역화 모바일 막 단백질의 기술을 제시 했다. 다음 프로토콜, 막 단백질 자체 라벨 TMR 및 그들의 각각 기판에 활용 된 선생님 rhodamine 염료와 반응 하는 단백질에 융합 된다. Rhodamine 밝은 photostable 염색 하 고 반복적인 이미징¹따라서 허용 합니다. 성공적인 성능에 대 한 여러 조건 및 중요 한 주제 마음에 보관 해야 합니다.

첫째, 그것은 적절 한 필터와 스플리터 TMR 및 각 신호를 명확 하 게 구분을 선택 하는 것이 중요입니다. 배경에서 셀 외부를 줄이기 위해, precleaning 및 PLL-말뚝-RGD와 coverslip의 코팅은 도움이 되었다. 염료-기판의 최종 농도 기판에 대 한 자체 라벨 효소의 선호도 셀 내부 효소의 접근성을 고려 하 여 테스트 되어야 한다. 나노-picomolar 농도에 미토 콘 드리 아 단백질¹⁷ 및...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2-(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐)-에탄술폰산, 1 M) (HEPES)	바이오크롬	#1104E
DC1: 이색성 빔 스플리터	Chroma	640 dcxr	NC506031
DC2: Polychroic Mirror, 빔스플리터	Chroma	zt405/488/561/640rpc	단종
Dulbecco´ s 인산염 완충 식염수(PBS) 1x(Ca 및 Ca 제외) Mg)	시그마-알드리치 & Co.
얼&급성; 페놀 레드가 없는 MEM, L-글루타민이 없는 및 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% 알라닐-L-글루타민 및 34.78% 탄산수소나트륨(NaHCO3 0.75g/l)			매체
Earle´ 1% Fetal Bovine Serum Superior(FBS), 0.1% HEPES(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) 및 0.1% 비필수 아미노산(NEAA)			성장 배지
EF: 방출 필터 쿼드밴드 패스	AHF 분석기sentechnik	F72-866	Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm
EMCCD 카메라	Andor Andor	iXON 897	EMCCD 카메라
방출 필터 QuadView 필터 큐브, 주황색	AHF 분석기technik	F39-637	밴드패스 582 - 619 nm
방출 필터 QuadView 필터 큐브, 빨간색	크로마		밴드패스 655 - 725 nm (HQ 690/70)
FBS (태아 소 혈청) 우수한	Biochrom	S0615
형광 비드: TetraSpeck™ 마이크로스피어, 0.1 &마이크로; m, 형광 블루/그린/오렌지/다크 레드	Thermo Fisher Scientific	T7279	형광 마이크로스피어
글루타민	Biochrom	#0951C
HeLa 세포	DSMZ	ACC-57	환자의 경추 암종 세포 Henrietta Lacks
Hela 세포 CI::p aGFP, stable	Muster et al., PLOSOne 2010
Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable	Appelhans et al., NanoLett 2012
Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable	Appelhans et al., NanoLett 2012
Image splitter	Photometrics	Dual-View QV2	이미지 스플리터 방출
이미징 처리 소프트웨어	ImageJ2 / 피지	프리웨어
이멀젼 오일 - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45)	Carl Zeiss Jena GmbH	444960-0000-000
도립 형광 현미경	Olympus IX-71/73/83
레이저 561 nm, 200 mW	CrystaLaser	CL-561-200	561 nm 방출
레이저 642 nm, 140 mW	오미크론	Luxx-642-140	642 nm 방출
MATLAB	MathWorks	버전 R2013a
MEM과 Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, 안정적인 글루타민(PR 없음	Biochrom	FG-0385
MEM과 Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, 안정 글루타민, Phenolred	Biochrom	FG-0325
MitoTracker® 딥 레드 FM	써모 피셔 사이언티픽	M22426	염료
MitoTracker® 그린 FM	Thermo Fisher Scientific	M7514	염료
멀티모드-광학 편광 유지 모노모드 섬유	Pointsource/Qioptiq		KineFLEX
NHS-PEG-MAL, Rapp 폴리머	Rapp Polymere GmbH Tü bingen		coverslip 코팅
비필수 아미노산 (NEAA)	Biochrom	#0802E
PEG 800 (폴리에틸렌 글리콜) 10 %	Carl Roth GmbH	Art No. 0263.1	coverslip coating
Penicillin / Streptomycin	Biochrom	#0122E
PINK1-Halo7-Tag 발현을위한 플라스미드	Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015
폴리-L-라이신(1.2mg/ml)	Sigma-Aldrich & Co.	고양이. No.P9155	커버슬립 코팅
RGD 펩타이드(Ac-CGRGDS-COOH)	코어링 시스템 Diagnostix GmbH, Gernsheim		커버슬립 코팅 / 인터그린 수용체 모티프
실리콘 로다민 HaloTag®-리간드(SiRHTL)	카이 존슨		염료
소프트웨어 분석 플러그인	자체 작성 C. P. Richter, Biophysik Osnabrü ck	SLIMFAST 16g
테트라메틸로다만인 / SNAP-Cell® SNAP-Ligand(TMRstar)에 연결된 TMR-Star	뉴잉글랜드 Biolab®	S9105S	염료
테트라메틸로다민은 HaloTag®-리간드(TMRHTL)와 연결되어 있습니다.	Promega	G8251	염료
TIRF 응축기	Olympus	Cell^TIRF MITICO 시스템	TIRF 응축기
TIRF 현미경 제어 소프트웨어	Olympus cellSens 1.12
TIRF 대물렌즈	Olympus	150x 오일 대물렌즈(N.A. 1.45; Olympus UAPO)
Trypsin/EDTA 10x	Biochrom	#0266
물 H2O 99,5 % Rotipuran® 낮은 유기농	칼 로스 GmbH	Art. 아니요. HN57.1