체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화

요약

여기는 자동된 광학 카메라 현미경으로는 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 테스트 하는 절차에 설명 합니다. 스크래치 분석 결과 널리 사용 되었습니다 어디 스크래치의 폐쇄는 세트 기간에 대 한 다음. 광학 현미경 세포 이동의 신뢰할만 하 고 저렴 한 감지 수 있습니다.

초록

셀 이동 건강, 암, 상처 치유 등의 여러 측면에 영향을 미치는 중요 한 프로세스 이며 그것은, 따라서, 마이그레이션 공부 방법 개발을 위한 중요 한. 스크래치 분석 결과 가장 일반적인 생체 외에서 방법 그것의 저가 및 간단한 절차 때문에 안티 프로 migration 속성으로 화합물을 테스트 하. 그러나, 분석 결과의 자주 보고 하는 문제는 처음의 가장자리에 걸쳐 세포의 축적을 이다. 또한, 분석 결과에서 데이터를 얻기 위해 다른 노출의 이미지 이동 해야 시간의 기간 동안 정확한 같은 자리에는 이동의 움직임을 비교 하. 다른 분석 프로그램 스크래치 폐쇄를 설명 하기 위해 사용할 수 있습니다 하지만 그들은 노동 집약, 부정확 한, 및 온도 변화에의 힘 주기. 이 연구에서는 마이그레이션 효과, 예를 들면 자연스럽 게 발생 단백질 인간 및 소 Lactoferrin 및 그들의 N 맨끝 펩 티 드 Lactoferricin HaCaT 상피 세포 선에 대 한 최적화 된 방법을 설명 합니다. 중요 한 최적화는 세척 하 고 가장자리를 따라 셀의 상기 축적을 제거 하는 PBS에 스크래치 이다. 이 keratinocyte-셀 연결에 영향을 보여왔다 양이온의 제거에 의해 설명 될 수 있습니다. 이동의 진정한 검출을 보장 하기 위해, 미리 미토마이신 C, DNA 합성 억제제로 치료 프로토콜에 추가 되었습니다. 마지막으로, 우리는 재현성에 개선 하 고 시간이 지남에 스크래치의 동일한 섹션의 분석을 보장 하면서 자동된 광학 카메라, 과도 한 온도 사이클 제거 스크래치 폐쇄 분석, 육체 노동 방법을 보여 줍니다.

서론

마이그레이션 여러 생리 적 측면을 영향을 미치는 중요 한 과정 이다. 상처 치유, 마이그레이션 용이 피부 다시 epithelization. 치유 되지 않은 상처, 만성 상처 등에서 기회 주의 박테리아 상처의 감염 원인과 오픈 상처 박테리아 성장과 biofilm^1,2의 형성에 이상적입니다. Biofilm 내성 박테리아의 개발의 원인 중 하나는 우리의 현대 사회³에 가장 큰 위협 중 하나입니다. 상처 치유, 면역 세포는 biofilm을 침투 수 없습니다. 암, 암 세포의 전이의 중추적인 단계는 단단한 종양^4,5환자에 대 한 죽음의 주요 원인입니다. 따라서, 그것은 마이그레이션 공부 수 중요 합니다.

스크래치 분석 결과 종종 저렴 하 고 쉽게 부착 셀 라인, 섬유 아 세포, 내 피, 상피 세포 라인^6,7등에서 수행 하는 때문에 셀 마이그레이션 테스트 하는 데 사용 됩니다. 오늘, 흠집

프로토콜

실험적인 체제 윤리적 및 법적 제한이 있으며 로스킬레 대학 계약 실시 했다. 실험 설정에 대 한 개요는 그림 1 과 그림 2에 광학 카메라의 메커니즘에서 볼 수 있습니다.

1입니다. 준비

1. 벤치 및 실험의 시작 이전에 70% 에탄올과 모든 장비를 청소 하 여 살 균 층 류 벤치에서 모든 단계를 수행 합니다.
2. 셀에 대 한 최적의 조건을 보장 하기 위해 5% CO₂ 와 37 ° C에서 기존의 인큐베이터에 광학 카메라를 배치 합니다.
3. 10 %FBS T75 플라스 크에서 1 x 항생제 (페니실린과 스) DMEM 미디어에서 HaCaT 세포 성장.
4. 1 mL 1 x 트립 신을 사용 하 여 셀을 분리 하 고 하위 그들 매 3-4 일 함으로써 배양 세포 층에 분산. 사용 하기 전에 실내 온도에 열 중.

2. 48-웰 스 결정 플레이트에 셀 생성 HaCaT의 단층

1. 파스퇴르 피 펫과 T75 플라스 크에서 매체를 제거 합니다.
2. T75 플라스 크에 5 mL 1 x 살 균 PBS....

결과

HaCaT은 keratinocyte 셀 라인, 피부에서 가장 풍부한 셀 형식 중 하나입니다. 상처 발생, 피부 세포 증식 및 상처 침대를 닫습니다 (그림 3) 상처를 통해 마이그레이션 시작 합니다. 두 프로세스는, 그러므로, 적절 한 치료에 매우 중요.

광학 카메라는 실시간으로 두 프로세스를 따를 수 있습니다. 마이그레이션, 시스템 제공 3 데이터 세트: 셀 적용 지역, 간격 폭 및 간격 지역. Lactoferrin, Lactoferricin 또는 EGF 치료 모니터링 흠집, 광학 현미경 수 있습니다 시간이 지남에 따라 이러한 세 가지 매개 변수를 모니터링. 48 h 부 화 후 우리는 EGF의 상처, 치료 컨트롤 (그림 3A)의 38% 폐쇄에 비해 95% 폐.......

토론

개발, 상처 치유, 면역학, 및 암 연구에 이동의 중요성 여러 다른 방법 마이그레이션 연구를 주도하 고 있다. 마이그레이션 확장의 표현 또는 셀에 의해 간격의 폐쇄 수 있습니다. 그것은 쉽게 하는 단층 세포 성장 이며 성장 하는 특정 폼⁸셀 보다 스크래치 스크래치의 가장 자주 폐쇄 테스트 됩니다. 우리의 연구는 기술 마스터 하기 쉽고 저렴 한 비용으로 수동 긁힘에 대 한 최적화 된 메서드를 보여 줍니다. 우리는 DNA 합성 억제제 미토마이신 C, 최적화 게시 방법¹⁸, 그리고 높은 처리량 연구를 허용 하는 광학 카메라의 사용에 비해 스크래치에 여분의 워시 도입.

생체 외에서 스크래치 시험 요구 우물의 바닥에 제대로 바인딩 부착 셀 라인 하 고 마이그레이션 스크래치, 감지 하 확산 저해 될 필요가. 이 두 기능은 분석 결과 대 한 필수적입니다. 진정한 마이그레이션, 검출 하기 위하.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
oCelloScope	BioSense 솔루션 ApS		광학 카메라
UniExplorer 소프트웨어	BioSense 솔루션 ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
Bispebjerg 병원에서 기증된	HaCaT 세포
DMEM(1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	HaCaT용 배지
FBS	Gibco	10270	소 태아 혈청
PBS	Gibco	D837	Mg+ 및 Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	항생제
트립신 (10x)	Sigma	T3924
미토마이신 C	토크리스	3258	증식 억제
마이크로타이터 플레이트	Greiner Bio-one	677 180
인큐베이터	Panasonic		37° C, 5 % CO2
혈구 계	보조		T ü rk (0.1 mm)
피펫 보이	Accu-Jet pro