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방법 논문

생체 외에서 직감 호스트 미생물 인터페이스에 합성 세균 컨소시엄의 생존 능력을 평가

11K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57699

⸱

2018년 7월 4일

 ,  , 
1Center for Microbial Ecology and Technology (CMET), Ghent University

이 논문에서

요약

창 자 미생물 호스트 상호 작용은 합성 구두 커뮤니티, 생체 외에서 위장 소화, 그리고 소장 상피의 모델을 결합 하 여 새로운 접근 방식을 사용 하 여 평가 됐다. 우리 세포 침입 병원 체와 다중 종 biofilms의 평가 또는 테스트 probiotic 정립 생존 적응 될 수 있는 방법 제시.

초록

호스트와 microbiota 사이 상호 작용은 오랫동안 인식 하 고 광범위 하 게 설명. 입 주민 microbiota 발생 하 고 외 인 박테리아에 의해 식민을 방지, 위장의 다른 섹션와 비슷합니다. 사실, 구강에서 발견 되는 박테리아의 600 이상 종 그리고 하나의 개별 약 100 다른 언제 든 지가지고 있습니다. 구강 박테리아 상주 미생물 지역 사회, 및 호의 보이는 성장 및 생존 통합 되 고 따라서 구강 생태계에서 다양 한 틈새에 고착 하는 기능을가지고 있습니다. 그러나, 삼 키는 동안 창 자에 박테리아의 흐름은 본질적인 microbiota의 균형을 방해 제시 되었다. 사실, P. gingivalis 의 구강 관리 ileal microflora에 세균성 구성 이동. 우리 사용 합성 커뮤니티 자연 구두 생태계의 단순화 표현으로 생존 및 시뮬레이션 된 위장 운송 조건을 복종 구강 박테리아의 생존 능력을 명료 하 게. 14 종 선택, 하 체 외에 타 액, 위, 장 소화 프로세스를 받게 되었고 Caco-2와 HT29 MTX 시뮬레이션 창 자 점 막 상피 세포를 포함 하는 multicompartment 세포 모델을 제시. 이 모델 장 순환에 관련 된 세포에 삼 킨된 박테리아의 영향을 해명 하기 제공. 가상 커뮤니티를 사용 하 여 제어 및 재현성에 대 한 수 있습니다. 따라서,이 방법론 병원 체 생존 능력 및 염증 관련 된 변경, probiotic 혼합물의 식민 용량 평가에 적용할 수 있습니다 그리고 궁극적으로, 잠재적인 박테리아 presystemic 순환에 영향을 미치는.

서론

인간은 인간 세포1와 동일한 수에 존재 하는 박테리아와 함께 동서. 따라서, 그것은 중요 한의 인간의 미생물에 대 한 포괄적인 이해를 얻기 위해 중요 한입니다. 그것은 나누어 여러 작은 서식 지, 따라서 박테리아와 그 다른 위치에 biofilms의 큰 다양성을 포함 하는 구강 독특한 환경입니다. 오픈 생태계를 되 고, 입에서 일부 수 종은 일시적인 방문자 수 있습니다. 그러나, 특정 미생물 식민지 탄생과 형태 구성 biofilms2후에 빨리. 이들은 gingival 틈새, subgingival 틈새, 혀, 점 막 표면 및 치과 보 철 및 충전 재3위에 치아 표면에서 발견 된다. 박테리아로 flocs 치아 운하의 루멘에 있는 planktonic 세포 괴 사 성 펄프 조직 개 및 액체 단계에서 중단에 있을 수 있습니다.

호스트 셀과 주민 microbiota4간의 활성화, 지속적인 간 이야기가 있다. 박테리아 통신 시간과 사이 종, 그리고 다른 박테리아 이러한 기본 colonizers에 연결 하는 동안 자연 식민지 개척자의 작은 비율만 조직에 고착 할 수 있다. 예를 들어, 미생물 간의-셀 바인딩 구두 biofilms에 보조 식민지 개척자를 통합 하 고 상호 작용 미생물 세포4의 복잡 한 네트워크 구축에 대 한 키입니다. 약 타 액 샘플에서 박테리아의 70%는 Porphyromonas sp., 연쇄 상 구 균 sp., Prevotella sp., Veillonella sp., 그리고 알 수 없는 Bacteroidetes에 의해 형성 된다. F. nucleatum subgingival biofilm에 늦은 colonizers P. gingivalis, T. denticola, 및 Tannerella 개나리, 염5연루와 집계는 중간 식민지 개척자입니다. 또한, 연쇄 상 구 균 mitis S. sanguinis 그리고 S. gordonii 치아3식민지 선호 점 막 및 치과 서식 지를 차지 합니다. 따라서, S. sanguinis 이다 더 낮은 앞 니와 송곳에 동안放 naeslundii 위 anteriors6에서 발견 되었습니다.

더하여, 토착 미생물2인간의 건강 유지 하는 역할을 재생 합니다. 주민 microbiota 참여 면역 교육에서 및 병원 체 확장을 방지 합니다. 이 식민 저항 표면에 부착에 적응 그리고 더 효율적으로 성장에 대 한 사용할 수 있는 영양분을 metabolising 네이티브 박테리아 더 있을 수 있습니다 때문에 발생 합니다. Probiotic 긴장 살아남을 위장 통과 하 고 활성 상태로 유지, 위장의 위 위치에서 삼 autochthonous 박테리아의 지 속성 없는 완전히 설명 하고있다. 따라서, 우리 시뮬레이션 된 위장 운송 조건 인공 커뮤니티, 대표 구두 생태계의 대상이. 세균성 세포의 생존 능력은 창 자 상피를 닮은 multicompartment 모델을 사용 하 여 평가 했다. 현재 창 시뮬레이터 luminal 미생물 커뮤니티7의 분석 측면에서 적합 한 재현성을 제공합니다. 그러나, 세균성 접착 및 호스트 미생물 상호 작용은 별도로 해결,8도전 미생물 지역 사회와 세포를 결합 하는으로. 반면, 우리는 성공적인 식민 이벤트 창 인터페이스에 보고의 잠재적인 기계 설명을 제공 하는 프레임 워크를 제시. 실제로,이 모델 사용할 수 있습니다 공동으로 정적 용기 모델 호스트 표면 신호에 미생물 커뮤니티의 영향을 평가 하기 위해.

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프로토콜

1. 긴장 조건 문화

참고: 합성 구두 지역 사회는 일반적으로 구강 미생물3에 있는 긴장에 의해 구성 되었다.

  1. 미국 유형 문화 수집 (ATCC)에서 다음 종자를 얻기: Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), 연쇄 상 구 균 mutans (ATCC 25175), 연쇄 상 구 균 sobrinus (ATCC 33478),放 naeslundii (ATCC 51655), 연쇄 상 구 균 gordonii (ATCC 49818),放 viscosus (ATCC 15987), 그리고 연쇄 상 구 균 mitis (ATCC 49456).
  2. 미생물의 라이프니츠 연구소 DSMZ-독일어 컬렉션 및 세포 배양 (DSM 2007), BCCM/LMG 박테리아 컬렉션 (LMG 14657)에서 구 sanguinis 에서 Veillonella parvula 취득 및 사용 연쇄 상 구 균 salivarius 변형 TOVE R9, 그리고 연쇄 상 구 균 oralis10.

2. 개발 구강 미생물의 Multispecies 커뮤니티 담당자의

참고: 생체 외에서 창 자 상피에 구강 박테리아의 잠재적인 접착 능력을 시뮬레이션 하기 위해 합성 커뮤니티를 생성 합니다. 혈액 한 천 배지 에르난데스 Sanabria 외 에 설명 된 대로 5 μ g/mL hemin와 1 μ g/mL menadione, 5% 살 균 defibrinated 말 혈액 보충에 박테리아를 성장 (2017) 11. 간단히:

  1. 100mg 2 ml의 1 M NaOH hemin의 분해, 압력가 증류수 100 mL를 추가 합니다. 어두운 컨테이너에 저장 합니다. 0.22 μ m 필터를 통해 매체를 추가 하기 전에 소독.
  2. 100mg menadione 96% 에탄올 20 mL에 용 해. 0.22 μ m 필터를 통해 매체를 추가 하기 전에 소독.
  3. 혈액 한 천 매체의 1 리터를 준비 ( 재료의 표참조) 제조 업체의 지침 및 오토 클레이 브. 말 피와 보충 추가 하기 전에 식힙니다. 혼합 하 고 접시를 붓는 다.
  4. 이전에 보고 된12수정된 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 국물을 준비 합니다. 압력가 마로 소독 후 hemin의 5 μ g/mL와 menadione의 1 μ g/mL를 추가 합니다.
  5. Hungate 튜브에 매체의 9 mL를 분배 하 고 고무 마 개, 알루미늄 캡으로 닫습니다. N2/CO2 (90% / 10%)와 튜브를 플러시.
  6. 혐 기성 매체의 1 mL 주사기로 검색 하 고 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에. 각 세균성 종에의 한 식민지를 선택 하 고, 매체에서 resuspend 혐 기성 수정 된 BHI에 다시 전달. S. salivarius, 24 h에 대 한 인 큐베이 팅 해야 합니다을 제외 하 고 37 ° C에서 48 h에 품 어.
  7. 필요한 경우 가상 커뮤니티를 조립 하기 전에 문화의 순도 확인 합니다. 간단히:
    1. 에르난데스-Sanabria 외 에서 액체 문화에서 DNA를 추출 (2010 년) 13 16S rRNA 유전자는 뇌관을 사용 하 여 증폭 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) 및 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT), 및 다음 프로그램: 95 ° C에서 5 분, 1 분 동안 95 ° C의 30 주기 55 ° C 1 분 1.5 분 동안 72 ° C 다음 최종 확장 단계 72 ° c.에 5 분의
    2. 상업으로 PCR 제품을 정화 키트 ( 재료의 표참조), 제조업체의 지침에 따라.
    3. 10 μ 총 볼륨의 0.5 μ를 포함 된 정제 제품의 시퀀싱 반응 수행 ( 재료의 표참조), M13f 뇌관 (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC), 시퀀싱 버퍼, x 5와 20의 2.0 μ의 3.2 pmol 염색 ng 서식 파일의 사용 하는 상업적인 시퀀싱 시스템 키트 ( 재료의 표참조).
      참고:이 절차를 상업적으로 실행 했습니다.
    4. 모든 시퀀스 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 결정 하는 가장 가까운 알려진된 taxon 고 RDP 분류자 온라인 도구 (http://rdp.cme.msu.edu/)는 시 나를 사용 하 여 원래 긴장의 순서와 비교에서 폭발 검색을 수행 맞춤 서비스 (https://www.arb-silva.de/aligner/)입니다.
  8. 에르난데스 Sanabria 외 에 설명 된 대로 cytometry 및 SYBR 녹색/Propidium 요오드 화물 얼룩을 사용 하 여 외피의 끝에 휴대폰 번호를 측정 (2017) 11. 문화-1105 셀 mL를 희석, BHI 수정 사용 하 여.
  9. 혐 기성 BHI의 75 mL로 S. mitis 의 1 mL을 추가 하 고 고정 단계 (6 h)까지 품 어. 다음, 각 희석 긴장과 혐 기성 조건 하에서 혼합의 0.75 mL 수집 합니다.
  10. 일단 모든 문화, 혼합 소 우주의 1 mL를 걸릴 고 BHI의 75 mL를 추가 합니다. 합성 커뮤니티 10% 이내를 품 어 CO2, 10% H2, 80% N2 48 h 37 ° C와 200 rpm ( 재료의 표참조).
  11. 2.8에서 세포 밀도 측정 합니다. 전에 셀 모델을 커뮤니티 제시. 사회의 구성 양적 실시간 PCR, 뇌관을 사용 하 여 및 어 닐 링 온도 Slomka 외 의 표 1에서와 평가 될 수 있다 (2017) 10. 또한, 16S rRNA 유전자 amplicon 시퀀싱을 사용 하 여 초기 회원 현재13,14에 정보를 제공. 어느 정체성 확인 프로토콜에 대 한 템플릿으로 cDNA를 사용 하 여 적극적으로 속기 단백질, 박테리아를 나타냅니다 하 고 템플렛으로 DNA를 사용 하 여 긴장의 존재/부재를 공개.

3. 일반 세포 배양 방법

주: 세포 배양의 일반적인 측면에 대 한 저자를 참조 마스터와 스테이 시 (2007 년)15. 유럽 컬렉션의 인증 셀 문화 (Caco-2 ECACC 86010202와 HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, 공중 보건 영국, 영국)에서 사용 하는 셀 라인을 얻을. 세포 배양에 대 한 시 약을 구입할 수 있습니다 ( 테이블의 자료를 참조), 달리 지정 하지 않는 한.

  1. 유지 보수 및 Caco-2와 HT29 MTX 셀 라인 뿌리고
    참고: Caco-2와 HT29 MTX 셀 25 cm2 조직 배양 플라스 크 포함 하는 보충된 DMEM 매체 (표 1) 정기적으로 성장 된다. 60-70% 합류에 도달할 때 셀 trypsinized 있습니다.
    1. 플라스 크에서 세포 배양 매체를 제거 합니다. /Mg Ca ++++없이 PBS의 5 mL로 두 번 세척.
    2. 트립 신, 0.22 g/L 에틸렌 diamine tetraacetic 산 성 (EDTA)의 0.5 mg/L 해결책의 2 개 mL를 추가 합니다. 부드럽게 플라스 크를 이동 하 여 트립 신 솔루션을 배포 합니다. 1.5 mL의 트립 신 솔루션을 제거 하 고 10 분 동안 37 ° C에 플라스 크를 품 어.
    3. 세포를 플라스 크 표면에서 분리는 현미경 아래에서 확인 하십시오. 필요한 경우 추가 5 분 동안 품 어.
    4. 비활성화 된 트립 신을 플라스 크에 보충된 세포 배양의 5 mL를 추가 합니다. 균질 단일 셀 서 스 펜 션 여기저기를 피펫으로.
    5. 즉시, 50 µ L 셀 서 스 펜 션의 aliquot 고 Caco-2 셀에 대 한 1:1 (v/v) 비율 또는 1:5 v/v HT29-MTX에 대 한 살 균 0.4 %Trypan 블루 솔루션 혼합. 세 실로 pipetting와 부하에 의해 혼합 ( 재료의 표참조).
    6. 현미경 (흰색 밝은 셀) 가능한 셀의 개수 (제조 업체의 지침을 참조 하십시오).
    7. 씨앗 1 x 104 셀/cm2, 4 × 105 셀/c m2 의 조밀도에 새로운 플라스 크에서 Caco-2, HT29-MTX, 각각.
      참고: (1) Caco-2 셀 차별화 하 고 꽉 접합 한 번 도달 하는 confluency를 형성 한다. 오버-confluency trypsinization 전에 피하기 위해 매우 중요 하다. 자라 난 플라스 크에 세포의 trypsinization 또는 셀 덩어리 후 셀 분리 실패를 일으킬 수 있습니다. (2) HT29-MTX 세포는 점액을 생산 높은 신진 대사 활동16셀. 셀은 높은 밀도에서 하는 경우에 특히 이러한 기능 세포 배양의 빠른 산성화를 일으킬 수 있습니다. HEPES buffer (표 1) 7과 7.2 사이 pH를 유지 하기 위해 세포 배양에 추가할 수 있습니다. PH가 떨어지면, 매체 수 50% 미만 이다 교환 때 confluency. 그러나, 만약 confluency > 50%, 셀 문화 분할 해야 합니다.

4. 창 자 미생물 호스트 인터페이스 시뮬레이션 Multicompartment 셀 모델의 조립

참고: 완료 스 더블 챔버 (직경 24mm, 기 공 크기 0.4 μ m; 참조 테이블의 재료) 공동 문화.

  1. 꼭대기 구획 및 2 mL에는 기저를 완전 한 세포 배양의 1.5 mL를 추가 합니다. 사전 시드 때 세포 현 탁 액의 분배를 20-30 분 동안 품 어.
  2. 섹션 3에에서 설명 된 대로 Caco-2와 HT29 MTX의 세포 배양을 trypsinize. Trypsinization 절차 덩어리 없이 단일 셀 정지에서 두 셀 라인의 균일 분배를 달성 하기 위해 정확 하 게 따라야 합니다.
  3. 3.1.8에 설명 된 대로 실행 가능한 세포를 계산.
  4. Caco-2/HT29-MTX 셀 90/10 비율에 104 셀/cm2 x 6.5에 셀 밀도 조정 합니다.
  5. 셀 정지 균질 하 고 보충된 셀 문화 미디어와 함께 미리 채워진 살 균 컨테이너 Caco-2와 HT29 MTX 셀의 해당 볼륨을 추가 합니다. 포부에 의해 챔버의 꼭대기 쪽에서 미리 incubated 미디어를 제거 합니다.
  6. 부드럽게 pipetting, 세포 현 탁 액을 혼합 하 고 챔버 삽입의 꼭대기 구획을 1.5 mL를 전송. 시드 절차 세포 현 탁 액의 일정 한 균질 세포 침전 하는 경향이 필요 합니다. 작업 속도 사용자의 경험에 따라 1-3 웰 스 분배 후 세포 현 탁 액을 혼합 해야 합니다.
  7. 접시 부드럽게 뒤로 및 앞으로 이동 하 고 다음 오른쪽 왼쪽 오른쪽 (5-10 배)를 더 우물에서 세포의 확산. 인큐베이터에 전송 및 플레이트의 움직임을 반복.
  8. Caco-2/HT29-MTX 셀의 공동 문화를 유지 15 일 동안 상쾌한 꼭대기와 기저 구획 보충된 DMEM와 매 2 일. 이 시간 후, 세포 배양은 항생제/antimycotic 솔루션 없이 보충된 DMEM을 변경할 수 있습니다.
  9. 20-21 일 후 매 2 일 매체를 새로 고쳐 시드까지 시스템을 유지 합니다.
  10. 분석 결과, 전기 저항 시스템을 사용 하 여 시작 하기 전에 상피 방 벽 완전성을 측정 (재료의 표 참조), 제조업체 지침에 따라.
    1. TEER 장비 완전히 충전 확인 (> 24 h) 측정을 시작 하기 전에.
    2. 전원 공급 장치 및 플라스틱 압력솥 가방 커버에서 TEER 장비를 분리 합니다. 전극을 소개 하 고 미터에 입력된 포트에 연결 하기 위해 가방에 구멍을 확인 합니다. 70% 에탄올/물 (v/v) 흐름 캐비닛으로 TEER 장비를 도입 하기 전에 살포.
    3. 전극 소독, 15 미 린스 미리 데워 진된 세포 배양에서 전극에 대 일 분 건조 공기를 허용에 대 한 70% 에탄올/물 (v/v) 솔루션에 전극 팁을 담가.
    4. 인큐베이터에서 세포 고 흐름 캐비닛 내부 실내 온도에 서 세포 허용.
    5. 미터는 충전기에서 분리 되 다는 것을 확인 하십시오. 옴을 차례 전원 스위치에 모드 스위치를 설정 합니다.
    6. 전극 삽입에 짧은 팁 및 우물에서 더 이상 팁을 immersing 하 여 셀 저항을 측정 합니다. 플레이트 삽입을 90 ° 각도로 전극 유지.

5. 세균 생존 체 외에서 위장 운송 조건에 따라

참고: 시뮬레이션된 소화 준비 Minekus 외 의 프로토콜에 따라 체액 (2014) 17, 아래 설명 된 수정. 초순 수와 모든 희석을 준비 합니다. 0.22 μ m 필터를 통해 모든 솔루션 필터 소독 하 고 메 마른 조건 하에서 소화 절차를 수행 합니다.

  1. 구두 소화:
    1. 세균성 지역 사회의 3 mL 50 mL 무 균 튜브에 배치, 모의 타 액 유체 (SSF), (m m o l L-1)에 포함 된 3 mL와 혼합: KCl, 15.1; KH2포4, 3.7; NaHCO3, 6.8; MgCl2(H2O)6, 0.5, (NH4) 공동3, 0.06; HCl, 1.1; CaCl2(H2O)2, 0.75. 인간 침 유형 IX A를 SSF 돼지 위 유형 II에서에서 2 g/L mucin의 α-아 밀라 제 75 U/mL를 추가 합니다.
    2. 37 ° C, 및 100 rpm에서 2 분 동안 혼합물을 품 어. DNA 추출 및 흐름 cytometry 정량화 (S1) 2 mL 샘플을 수집 합니다.
  2. 위 소화:
    1. (M m o l L-1)에 포함 된 시뮬레이션된 위 액체 (SGF)의 4 개 mL를 추가: KCl, 6.9; KH2포4, 0.9; NaHCO3, 25; NaCl, 47.2; MgCl2(H2O)6, 0.1, (NH4) 공동3, 0.5; HCl, 15.6; CaCl2(H2O)2, 0.075. 또한,는 SGF 돼지 위 유형 II에서에서 mucin의 2 g/L를 포함 했다.
    2. PH를 측정 하 고 필요한 경우 3 1 M HCl로 pH를 조정 합니다. 37 ° C와 100 rpm에서 품 어. 2 mL 샘플 (S2)를 수집 합니다.
  3. 소장 소화:
    1. 시뮬레이션 된 장 (SIF) 포함 하는 액체 (mmol L-1)에서 4 개 mL를 추가: KCl, 6.8; KH2포4, 0.8; NaHCO3, 85; NaCl, 38.4; MgCl2(H2O)6, 0.33; HCl, 8.4; CaCl2(H2O)2, 0.3; 소화 관.
    2. 필요한 경우에 1 M NaOH로 pH 7 조정 합니다. 37 ° C와 100 rpm에서 품 어. 2 mL 샘플 (S3)를 수집 합니다.

6. 세균성 식민지 능력 생체 외에서 위장 운송 조건에 따라

  1. 2 mL의 소장 소화 2650 x g에서 10 분 원심
  2. 상쾌한을 제거 하 고 항생제와 antimycotic 없이 보충된 DMEM의 5 mL 세균 펠 릿 혼합.
  3. 얼룩 및 교류 cytometer를 사용 하 여 그대로/손상 된 세포를 계량 (참조 테이블의 자료), 헤 르 난 데스-Sanabria 외 에 설명 된 대로 (2017) 11.
  4. 항생제와 antimycotic 없이 보충된 DMEM에 희석 하 여 105 가능한 셀/mL로 세포 밀도 조정 합니다.
  5. Transwell 시스템의 꼭대기 매체를 제거 하 고 세균 현 탁 액의 1.5 mL를 추가 합니다. 공동 문화 일반 셀 문화 조건 (37 ° C, 습도 95%, 5% CO2)에서 2 시간에 대 한 시스템.
    참고:이 시간까지 48 h, 필요한 실험 프로토콜에 따라 확장할 수 있습니다. 일상적인 셀 유지 관리를 위해 오염 방지 하는 데 사용 보다 다른 인큐베이터에서 공동 문화를 유지할 수 있습니다.
  6. 4.11에 설명 된 대로 상피 방 벽의 무결성을 평가 하 부 화 후 TEER 값을 측정 합니다.
  7. 보육 시간, 완료 되 면 꼭대기 미디어를 제거 하 고 추가 분석 (S4) 0.5 mL를 수집 합니다. 미디어의 subsample 젖 산 효소 (LDH) 분석 결과 의해 세포 생존 능력의 평가에 사용할 수 있습니다 ( 테이블의 자료를 참조), 제조업체 지침에 따라.
  8. HBSS (NAC-버퍼) HT29-MTX를 제작한 점액을 solubilize 및 준수 박테리아 복구 하에서 10 mM N acetylcysteine의 0.5 mL를 추가 합니다. 동요에서 1 h 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어 (135 rpm 재료의 표참조).
  9. Microcentrifuge 튜브 (S5)에서 NAC HBSS 복구 하 고 1 mL DPBS 셀 두 번 씻어.
  10. 0.5%의 0.5 mL을 추가 Triton X-100 (w/v) monolayers, 위에 pipetting으로 세포를 방해, 1 분 속도 세제와 세균성 세포의 손상을 방지 하려면 중요 한 액체와 소용돌이 복구.
  11. 2650 x g, 5 분에 대 한 셀을 원심 하 고 상쾌한 (S6)와 펠 릿 (S7).

7. 샘플 분석

참고: 분석 수집된 샘플 (S1-S7) 세균 생존 능력을 평가 하 고 잠재적인 시뮬레이션된 위장 소화 다음 창 자 세포에 접착.

  1. 세균성 생존: 0.45 μ m 통해 두 번 샘플 S1-s 5를 통과 하 고 계량 라이브/죽은 세포 얼룩을 사용 하 여 세균성 세포 단계 2.811에 표시 된 대로 cytometry, 흐름.
  2. 잠재적인 접착: 직렬 희석 (-1-8) S1-S6 준비 및 혈액 한 천에서 10 µ L 행진 및 BHI 접시를 수정. 24-48 h. 플레이트 undiluted S7의 같은 볼륨에 대 한 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 품 어.
    1. 준수 박테리아의 분류학 식별:
      1. 문화 루프와 개별 식민지를 선택 하 고 각 nuclease 무료 물 10 µ L에 resuspend. 이 서 스 펜이 션의 4 µ L를 수집 하 고 뇌관 및 2.7.1에 설명 된 조건을 사용 하 여 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭에 대 한 템플릿으로 사용.
      2. 2.7.3, 2.7.4에 포함 된 절차를 사용 하 여 시퀀스의 유효성 검사에서 프로토콜에 따라 시퀀싱을 수행 합니다.
  3. 할 등 총 DNA 추출, 정량 정량화 그리고/또한 16S rRNA amplicon 시퀀싱, RNA 추출, 원하는 대로 프로 파일링 transcriptomic 다운스트림 분석 추가.
    참고: 흐름 cytometry 정량화 샘플링 후 즉시 수행 되었다. 멤브레인 permeabilized 세포에 대 한 컨트롤, 3 분 동안 70 ° C에 노출 샘플 사용 되었다. 배경 잡음 소화 액체 또는 세균 없이 셀 문화 모델에서 얻은 샘플 cytometry로 측정 하 여 평가 되었다. 모든 샘플 3 중에서 측정 했다.

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결과

이 프로토콜 elucidating 생존 및 시뮬레이션 된 위장 운송 조건을 복종 구강 박테리아의 생존에 적합 한 모델의 생성에 지도 한다. 개별 긴장에서 그대로 셀의 개수는 약 108 세포 mL-1 사전 커뮤니티 (의 설립 동안 실행 가능한 세포의 90% 이상 포함 된 multispecies 소 하면서 합성 공동체의 창조 그림 1A 및 1B). 라이브/죽은 부 량을 바탕으로, 세균 생존 능력 (그림 2) 각 소화 단계 후 감소 합니다. 이것의 위 통과 하는 동안 산 성 pH와 생리 적인 조건 하에서 발생으로 소장 소화 유체에 포함 된 담 즙 염의 결과 수 있습니다. 체 외에서 그리고 vivo에서 모두 위장 소화를 통해 운송 중 생존 ...

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토론

구강 미생물은 최근에 여러 작가20,21에서 보고 하는 인간의 건강에는 핵심 요소입니다. 이전 결과 큰 중 박테리아를 포함 하는 타 액의 섭취는 작은 창 자, 면역 못쓰게에 대 한 주요 사이트 중 하나입니다의 미생물 생태계 영향을 미칠 수 좋습니다. 호스트 인터페이스는 미생물에 구성 요소는 호스트의 영향을 해명 하기 봉사 장 상피 및 점액 분 비 세포에 의해 표현 정적 위 위장 소화 모델의 조합.

생체 외에서 모델 연구, 기계 론 적인 연구를 실시 하 고 배경 지식을 줄이기 위해, 의도 달성에 대 한 허용 더 효율적이 고 더 나은 대상 vivo에서 연구 위한 기본적인 도구입니다. 이러한 이유로, 그것은 순도, 생존 능력, 그리고 합성 미생물 지역 사회를 설치 하기 전에 axenic 문화의 최적의 성장을 위해 중요 한. 생존 능력 및 분석에 편견...

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공개 사항

저자 공개할 게 없다

감사의 글

저자는 기꺼이 마르타 Calatayud 아로요 (FWO 박사 친목-12N2815N) 플랑드르 연구 재단 으로부터 재정 지원을 인정 한다. 엠마 헤 르 난 데스-Sanabria 플랑드르 혁신 및 기업가 정신 (Agentschap voor Innovatie 문 Wetenschap en Technologie, IWT)에서 지 원하는 박사 후 연구원 이다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
STRAINS
Aggregatibacter actinomycetemcomitans American Type CultureCollection ATCC 43718
Fusobacterium nucleatum American Type CultureCollection ATCC 10953
Porphyromonas gingivalis American Type Culture 제품분류ATCC 33277
Prevotella intermedia American Type Culture CollectionATCC 25611
Streptococcus mutans American Type Culture CollectionATCC 25175
Streptococcus sobrinus American Type Culture CollectionATCC 33478
Actinomyces 비스코수스 American Type Culture CollectionATCC 15987
Streptococcus salivarius  TOVE-R
연쇄상구균 진드기 미국식 배양 컬렉션ATCC 49456
Streptococcus sanguinis BCCM/LMG 박테리아 컬렉션LMG 14657
Veillonella parvula Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell CulturesDSM 2007
Streptococcus gordonii American Type Culture CollectionATCC 49818
CELL LINES
Caco-2 cells유럽 인증 세포 배양86010202
HT29-MTX 세포컬렉션 12040401
시약 및 소모품
Brain Heart Infusion(BHI) 육수OxoidCM1135
Blood Agar 2OxoidCM0055Blood Agar medium
MenadioneSigmaM9429
HeminSigmaH9039
5% 멸균 제세정제 말 혈액E& O LaboratoriesLtd,P030
InnuPREP PCRpure KitAnalytik Jena845-KS-5010250PCR 정제 키트
BigDye Applied Biosystems4337454Dye for sequencing
ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kitApplied Biosystems4337456
SYBR  Green IInvitrogenS7585
Propidium IodideInvitrogenP1304MP
T25 배양 플라스크 비코팅, 세포 배양 처리, 통기, 멸균VWR734-2311
Trypsin-EDTA 용액Sigma-AldrichT3924-100ML
Trypan Blue 용액
0.4%, 액체, 멸균 여과		Sigma-AldrichT8154 
PBSGibco14190250
DMEM 세포 배양 배지, GlutaMAX 및 PyruvateLife 기술31966-047
Corning Transwell 폴리에스터 막 세포 배양 삽입Sigma-AldrichCLS3450-24EA
Mucin from porcine 위 Type II   Sigma-AldrichM2378
비활성화 소 태아 혈청Greiner Bio One758093
항생제-항진균제 (100X)Gibco15240062
Triton X 100 분자생물학 용Sigma-AldrichT8787 
칼슘 없는 DPBS, 마그네슘Gibco14190-250
Pierce LDH 세포독성 분석 키트Thermo Fisher Scientific88953
Corning HTS Transwell-24 well, 기공 크기 0.4 &마이크로; mCorning CostarCorp 3450
뉴클레아제가 없는 물Serva 전기영동28539010
EQUIPMENT
Neubauer 계수 챔버 개선Carl RothT729.1
BD Accuri C6 유세포 분석기BD Biosciences
PowerLyzer 24 균질화기MoBio13155
T100 열 순환기BioRad186-1096
플러시 시스템맞춤형InnOva
4080 인큐베이터 셰이커뉴브런즈윅 사이언티픽8261-30-10072.10
Memmert CO2 인큐베이터Memmert GmbH & Co.ICO150med
Millicell ERS (전기 저항 시스템)EMD Millipore, Merck KGaAMERS00002
Millipore Milli-Q 아카데믹, 초순수 시스템Millipore, Merck KGaA-Shaker
(ROCKER 3D basic)IKA4000000Shaker for 6.10
유럽 653118 용 셰이커

참고문헌

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