드롭릿 기반 미세 접근 및 단일 가닥 DNA Amplicons 위한 스피어 PCR 증폭

요약

이 작품에는 미세 물방울 기반 플랫폼의 제조와 스피어 PCR 확대를 위한 polyacrylamide 스피어의 응용 프로그램에 대 한 방법을 제공 한다. 스피어 PCR 방법 단일 가닥 DNA amplicons 이중 가닥 DNA를 분리 하지 않고 얻을 수 있습니다.

초록

드롭릿 기반 마이크로 제어 크기와 취득된 스피어의 형태를 제공 하는 미세 채널에서 균질 스피어의 안정적인 생산 가능 스피어 acrydite DNA 프로브 copolymerized 성공적으로 조작 했다. 비대칭 PCR, exonuclease 소화와 streptavidin 입히는 자성 구슬에 격리 같은 다른 방법은 단일 가닥 DNA (ssDNA) 합성에 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법을 효율적으로 많은 양의 매우 순화 된 ssDNA 사용할 수 없습니다. 여기, 우리가 어떻게 ssDNA 수 수 효율적으로 증폭 및 구분 dsDNA에서 단순히 PCR 반응 관에서 pipetting 스피어-PCR 프로토콜을 설명 합니다. SsDNA의 증폭 DNA microarray 및 DNA SELEX (지 수 풍부에 의하여 ligands의 체계적인 발전) 프로세스에 대 한 잠재적인 약으로 적용할 수 있습니다.

서론

단일 가닥 DNA (ssDNA) DNA-DNA 교 잡^1,2에 대 한 본질적인 속성 때문 분자 인식 요소 (MRE)으로 광범위 하 게 고려 하고있다. SsDNA 합성 시스템의 개발 생물학 응용 DNA microarrays³, oligotherapeutics, 진단 및 보완 상호 작용^4,5에 따라 통합 분자 감지 등 발생할 수 있습니다.

날짜 하려면, 마이크로미터 스케일 폴리머 입자는 성공적으로 시연 미세 장치를 사용 하 여. 여러 미세 기술 아닌 환경^6,7연속 흐름에 매우 동질적인 스피어를 생산에 대 한 강력한 것으로 입증 되었습니다.

이 외 의 연구에서 ⁸, copolymerizable 올리고 스피어와 ssDNA 증폭의 미세 합성에 대 한 미세 물방울 기반 플랫폼으로 알려졌다. 2 ....

프로토콜

1입니다. PDMS 미세 플랫폼의 제조

1. 베이스 폴리머와 볼륨의 비율은 10: 1에 촉매를 혼합 하 여 액체 PDMS prepolymer의 20 mL를 준비 합니다. 미세 네트워크의 위쪽 부분에 대 한 실리콘 웨이퍼에 준비 수 8 금형에 액체를 PDMS의 10 mL를 붓으십시오. 아래 평평한 부분에 대 한 같은 양의 액체 PDMS 몰드 구조 없이 실리콘 웨이퍼에 붓는 다.
   참고: 미세 네트워크 설계 CAD 프로그램에 및 다음 일반적인 포토 리소 그래피 과정 (참조 추가 숫자)를 사용 하 여 마스터를 조작 하기 위해는 포토 마스크를 변환. 이 마스터는 실리콘 웨이퍼¹¹에 부정적인 감광 수-8 형의 구성입니다.
2. 핫 플레이트에 치료 30 분 동안 75 ° C에 액체 PDMS prepolymer와 코팅 2 실리콘 웨이퍼를 배치 합니다.
   1. 수동으로 수-8 형에서 치료 PDMS 레이어를 벗기다. 1.5 m m 직경 구멍 구멍을 뚫는 도구 매크로 액체 샘플 미크론 규모 흐름 채널 인터페이스 복제 미세 네트워크에 오일 포트를 라운드를 맞춥니다. 펀치 구멍을 통해 밖으로 수동으로.
   2. 펀칭 두 솔루션 및 출구 포트의 형성에 대 한 세 번 과정 반복.

결과

2 개의 PDMS 층 (그림 1a) 조립된 고분자 드롭릿 기반 미세 플랫폼에 의하여 이루어져 있다. 미세 채널 네트워크의 3 종류 스피어를 생성 하는 데 사용 된다: 1) 흐름 초점 기하학과 같이 그림 1b, 2)는 사 문석 어 솔루션 II, 솔루션을 혼합에 대 한 채널과 채널 3) 합 스피어에 대 한 응고입니다. 모든 채널의 높이 60 μ m 이었다. 혼합 및 중 합 채널 길이 되었고 74.35 mm 94.45 m m, 각각. 2 개의 혼합할 수 없는 액체 흐름 및 미네랄 오일 흐름을 위해 하나 아닌 너비 100 μ m 및 200 μ m, 각각 있었다. 스피어 형성에 사용 되는 오리 피스 구조 50 μ m 길이 및 25 μ m 폭 이었다. 디퓨저 구조 각도 37 ° 이었다. 미네랄 오일의 연속 흐름에 대 한 실험실 기반 공 압 제어 시스템 및 솔루션 흐름 (

토론

DsDNA의 오염 물질 ssDNA 증폭에 큰 문제입니다. 기존의 비대칭 PCR 증폭¹⁵dsDNA 증폭을 최소화 하기 어려운 남아 있다. 또한, ssDNA를 생성 하기 위한 기술적인 개선 샘플 처리량의 효율성을 증가 있게가지고, 비록 ssDNA 절연의 높은 비용 및 불완전 한 정화 수확량 때문에 여전히 문제입니다.

비대칭 PCR ssDNA를 작업할 때 사용 하는 가장 어려운 방법 중 하나입니다. 이 메서드는 부동 한 양의 뇌관 (예, 20: 1 비율) 많은 양의 ssDNA 생성 하려면 적용 됩니다. 그러나, 모든 증폭 반응 ssDNA를 최적화 하기 매우 어렵습니다. 따라서, 부산물 (dsDNA) resultants⁴에서 제거 되어야 합니다.

추가 분리 단계 없이 ssDNA를 생성 하기 위해 우리는 acrydite 혼성 방법에 따라 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
액상 폴리디메틸실록산, PDMS	다우코닝	Sylgard 184	칩의 구성 요소
40 % 아크릴 아미드 : 비스 용액 (19 : 1)	바이오 라드	1610140	공중합 가능한 올리고 - 마이크로 스피어
과황산 암모늄의 구성 요소, APS	시그마 Aldrich	A3678	아크릴 아미드의 경화제 : 비스 용액
N, N, N&prime, N&prime, -Tetramethylethylenediamine, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	과황산 암모늄 촉매
미네랄 오일	Sigma Aldrich	M5904	표 1. 솔루션 III. 마이크로스피어 시약의 구성 요소
Cy3 표지, 상보적 올리고뉴클레오티드 프로브,	Bioneer	합성	표 3. 시퀀스 정보
ssDNA 아크릴다이트 표지 프로브	Bioneer	합성	표 1. 솔루션 I. 미세구 시약의 구성 요소
Tris	Biosesang	TE 완충액의 T1016	구성 요소, pH 완충 용액
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	TE 완충액의 구성 요소, 이온 제거(Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA 증폭
컨포칼 현미경	Carl Zeiss	LSM 510	미세구 표면의 올리고뉴클레오티드 노출 식별
, 광학 현미경	Nikon Instruments, Inc.	Eclipse 80i	Caculating 수 미세구
T100 Thermal Cycler	Bio-rad	1861096	ssDNA 증폭
휴대용 코로나 처리기	Electro-Technic	BD-20AC 실험실 코로나 처리기	친수성 표면 처리
		를 위한	HI-1000
			Solution I 및 Solution II 압축기의 균일한 흐름
	Kohands	KC-250A	Solution III의 흐름 제어
Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich Z359629		미세구 수 계산