Calorespirometry:에 대 한 강력 하 고, 비 침 투 적인 접근 세포 에너지 대사를 조사

요약

이 프로토콜 calorespirometry, 방열 및 에너지 대사를 평가 하는 비 침범 성 접근을 제공 하는 호흡의 직접 및 동시 측정에 설명 합니다. 이 기술은 총 세포 에너지 흐름을 모니터링 하 여 호 기성 및 혐 기성 경로 에너지 사용률에의 기여를 평가 하는 데 사용 됩니다.

초록

기본적인 생물 학적 및 생물 의학 연구에 사용 하는 많은 세포 선 둘 다 호 기성 및 혐 기성 호흡의 결합을 통해 에너지 항상성을 유지 합니다. 그러나,는 두 경로 세포 에너지 생산의 풍경에 기여 하는 정도 지속적으로 간과. 변형 된 세포 포도 당 레벨을 자주 포화에 교양 산화 인 산화 기질 수준 인 산화의 증가 의해 보상 된다 ATP 생산에 감소 종속성을 표시 합니다. 대사 균형에 있는이 교대는 미토 콘 드 리아 독 소의 존재에도 불구 하 고 증식 하는 세포 수 있습니다. 변환 된 셀의 변경 된 대사 균형, 무시에 제약 심사 결과 이후는 잘못 해석 될 수 있는 잠재적으로 mitotoxic 효과 수 있습니다 감지 되지 않을 높은 포도 당 존재 교양된 모델 셀 라인을 사용 하 여 농도입니다. 이 프로토콜은 두 개의 강력한 기술, respirometry 및 세포질 ATP 생산을 둘 다 호 기성 및 혐 기성 공헌의 양적 및 비 침 투 적인 평가 대 한 허용 하는 열 량의 페어링 설명 합니다. 호 기성 및 혐 기성 호흡 모니터링 을 통해 주사 될 수 있는 열을 생성 합니다. 한편, 산소 소비 속도 측정 하는 것은 호 기성 호흡의 정도 평가할 수 있습니다. 열 소비, 산소 소비와 동시에 측정은 때 calorespirometric 비율을 확인할 수 있습니다. 실험적으로 얻은 값 상응 이론 oxycaloric에 비해 다음 수 그리고 혐 기성 호흡의 정도 재판 될 수 있다. 따라서, calorespirometry 다양 한 약물 개발, 미생물 성장, 및 normoxic 및 hypoxic 조건 모두에서 기본적인 생체를 포함 하 여 생물학 질문을 분석 하는 독특한 방법을 제공 합니다.

서론

생물 학적 시스템, 물질 대사 도중 열 릴리스 또는 엔 탈피 변화는 일반적으로 중 하나를 직접 모니터링 (통해 직접 열 량) 또는 O₂ 소비 및 CO₂ 생산 (respirometry)를 통해 통해 간접적으로. 불행히도,이 기술은 격리에 사용 되는 경우 중요 한 정보 혐 기성 경로 세포질 물질 대사에의 기여 등 손실 됩니다. Calorespirometry 열 분산 및 호흡의 동시 측정에 의존 하는 강력한 기술입니다. 완전히 산소 포유류 세포에 있는 혐 기성 물질 대사를 조사 하 고 호 기성 및 혐 기성 경로 변형된 세포에도 불구 하 고 에너지 항상성의 동시 기여 시연 calorespirometric 작업을 개척 한 완전히 산소 환경¹. Calorespirometry 이후 다양 한 생물학 질문에 적용 되었습니다. 몇 가지 예로 동물 너 지론 낮은 산소 수준에서의 연구, bivalves, 지구 생물의 물질 대사 그리고 유기 토양 문제^2, 의 미생물 분해의 아가미에 제 초 제와 에스트로겐의 효과 ^{3 , 4 ,}

프로토콜

1. 세포 배양

1. 인간의 간세포 암 (HepG2) 셀 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 추가 기판 (10 mM 포도 당, 2 mM 글루타민 그리고 1 mM pyruvate)를 포함 하는 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 유지 (5% CO 2 , 95% 공기, 습도 100%).
   주: DMEM respirometry와 열 량에 대 한 이후 단계에서 참조 되는 경우 위의 DMEM 배합을 사용 합니다.
2. 1 x 10⁶ 세포 격판덮개 세포 100 m m 문화 접시와 subculture 그들 모든 7 일 또는 90 %confluency 도달 하기 전에 고 매체 마다 3-4 일 갱신.
3. 세포는 60-80% 합칠 때 실험을 수행 합니다.

2입니다. 준비의 Respirometer 및 열 량 계

1. Respirometer 챔버로 DMEM의 2.2 mL를 피펫으로 완벽 하 게, 마 개를 삽입 하 고 스 토퍼 공백 도구 보통 공기에서 최적의 산소 보급 수 있도록 조정.
2. 저 어 지속적으로 37 ° C에서 산소 농도 (블루 추적) 및 산소 유량 (빨간 추적) 안정 될 때까지....

결과

Calorespirometric 측정의 재현성은 적절 하 고 일관 된 샘플 준비에 따라 달라 집니다. 샘플에서 세포 배양 준비 해야 사용할 수 없습니다 경우 접시는 자란 셀 카운트 응집으로 인해 정확 하지 않은 될 수 있습니다. 또한, 감소 된 열 흐름 이멀전의 셀에 제한 된 기판 확산으로 인해 발생할 수 있습니다. 따라서, 부착 셀을 사용 하 여, 60-80% 사이 confluency와 접시를 선택 하 고 매체 실험 전에 24 h 변경 긴요 하다.

적절 한 기 악 교정 및 유지 보수 또한 유익 하 고 재현 calorespirometric 측정을 위해 중요 하다. 에 따라 제조 업체의 설립은 respirometer에 대 한 청소 프로토콜, 에탄올과 광범위 한 세척 잔류 소수 uncouplers와 억제제 제거 되 고에 의해 측정을 부분적으로 타협 하지 않는 수 있도록 구현 억제 또는 연결을 푸는 미토 콘 드리 아. Respirometer 챔버 샘플 측정 전에 작동 하는지, 산소 농.......

토론

Calorespirometry의 목적은 양적 호 기성 및 혐 기성 경로 신진 대사 활동에의 기여를 평가 하 고 세포 에너지 플럭스의 복합 보기를 얻을 것입니다. 이것은 방열 및 산소 유량 상응 이론 oxycaloric와 계산 된 CR 비율의 비교에서 뒤의 동시 측정에 의해 수행 됩니다. 재현 가능 하 고 신뢰할 수 있는 데이터에 대 한 몇 가지 중요 한 단계를 고려해 야 합니다. 살 균, 건강 한 세포 배양의 정비는 중요 한 이다. 세균 이나 곰 팡이 의해 오염 남용된 열 생산 또는 산소 소비, CR 비율 의미가 렌더링 될 수 있습니다. 더, 부적 절 한 셀 카운트, 혼합, 불 쌍 한 샘플 또는 이멀전의 세포는 부정확 한 CR 비율 또한 발생할 수 있습니다. respirometer에 관한 중요 한 단계는 주입 볼륨에서 50 µ L 아래 적절 한 샘플 준비 이다. 이 볼륨 최소한 매체의 상공에서 전치과 산소 소비는 제대로 2 x 10⁶ 셀을 보장 합니다. 일상적인 호흡 관찰 되 면 제안 된 프로토콜 두 추가 t.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HepG2 세포	미국식 배양 컬렉션	HB-8065	열량
O2K-호흡계	Oroboros Instruments	10022-02	호흡계
LKB 2277 열 활성 모니터(TAM)	온도 측정 AB		온도 측정은 TA Instruments에서 구입했습니다
루브산 나트륨(100mM)	Thermofisher Scientific	11360070	DMEM 배지
Fetal Bovine Serum - Premiuim Select	Atlanta Biologicals	S11550	에 10% 첨가 DMEM 배지
Trypsn-EDTA (0.25%)	Thermofisher Scientific	25200072	해리 시약
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	Sigma Aldrich	O4876	미토콘드리아 억제제
카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존	시그마 알드리치	C2920	미토콘드리아 언커플러
코닝 100mm TC 처리 배양 접시	Corning Corporation	430167	조직 배양 접시
포도당, 분말	Thermofisher Scientific	15023021	DMEM 매체
갈락토오스	Fischer Scientific	BP656500	용 갈락토스
	Thermofisher Scientific		25030081 DMEM 매체
DMEM, 포도당 없음	Thermofisher Scientific	11966025	배양 배지

계 . 피세포 용 포도당, 분말 DMEM 매체 L-글루타민 (200 mM) 글루타민 세포