상피 세포의 Shigella 감염 동안 캘리포니아2 + 응답 이미징

요약

여기, 선물이 HeLa 세포 이질균에 감염 하 여 elicited 칼슘 (캘리포니아^{2 +}) 응답을 시각화 하는 프로토콜. 세균 감염의 매개 변수를 최적화 하 고 캘리포니아^{2 +} 형광 프로브 이미징, 비정형 글로벌 및 로컬 Ca^{2 +} 신호 감염 활동의 넓은 범위를 통해 박테리아에 의해 유도 된 특징 이다.

초록

캘리포니아^{2 +} 모든 알려진된 세포질 과정에서 포함 된 유비 쿼터 스 이온 이다. 글로벌 Ca^{2 +} 응답 세포 운명에 영향을 미칠 수 있습니다, 하는 동안 무료 캘리포니아^{2 +} cytosolic 농도에서 내부 상점 또는 원형질 막 채널을 통해 유입에서 릴리스 연결할 로컬 유사 대뇌 피 질의 세포 프로세스를 통제 한다. 병원 체는 준수 또는 호스트 셀 트리거 기본 호스트 원형질 막, 글로벌 및 로컬 Ca^{2 +} 신호에 영향을 미치는 가능성이 있는 걸 골격의 개편을 침공. 이러한 이벤트는 확장된 활동을 통해 의사 확률적으로 낮은 주파수에서 발생할 수 있습니다, 때문에 병원 균에 의해 유도 된 Ca^{2 +} 신호 분석 해결 되어야 할 주요 기술 과제를 발생 시킵니다.

여기, 우리는 글로벌 및 로컬 Ca^{2 +} 신호 상피 세포의 Shigella 감염 시의 검출에 대 한 프로토콜을 보고합니다. 이러한 프로토콜에 장기간된 노출에 연결 된 인공 물 및 photodamage 캘리포니아^{2 +} 형광 프로브의 여기와 관련 된는 엄격 하 게는 동안 정의 된 시간 기간 동안 수집 매개 변수를 제어 하 여 트러블 슈팅을 Shigella 침공. 절차는 엄격 하 게 분석 하는 진폭 글로벌 cytosolic 캘리포니아^{2 +} 신호 주파수 확장된 감염 속도 론 화학 프로브 Fluo-4 사용 하는 동안 구현 됩니다.

서론

캘리포니아^{2 +} cytoskeletal 개편, 선 동적인 응답 및 호스트 병원 체 상호 작용^1,2,3에 관련 된 세포 죽음 통로 포함 하 여 모든 알려진된 세포 프로세스를 통제 한다. 생리 적인 조건 하에서 기초 cytosolic 캘리포니아^{2 +} 농도 낮은 수백 nM 범위에에서 있지만 주 작동 근 자극에 따라 일시적 증가를 받게 될 수 있습니다. 이 변이 자주 플라즈마 및 바인딩과 그물 막에 펌프와 채널의 행동을 통해 진동 동작을 표시합니다. 이러한 진동의 패턴 기간, 기간, 및 캘리포니아^{2 +} 증가의 진폭에 의해 특징 및 세포, 차례 차례로, Ca^{2 +} 코드^{4,5로 알려져 있습니다 무엇에 특정 응답을 방 아 쇠에 의해 해독} . 병 적인 조건 하에서 cytosolic 캘리포니아^{2 +} 농도 증가 지속된 미토 콘 드리 아 막의 permeabilization 및 프로-apoptotic 또는 괴 사 성 요인

프로토콜

1입니다. 준비

1. 박테리아 준비
   1. 박테리아를 접시-Shigella 야생-타입 스트레인 (M90T-AfaE) AfaE adhesin 표현-는 trypticase에 간장 (TCS) 한 접시 포함 0.01% 콩고 레드 (CR)와 18 h 37 ° c.에 대 한 그들을 품 어
      참고: 그들의 재현성을 높이기 위해 단계 1.1.1에서에서 얻은 Shigella 접시 4 ° C에 저장 됩니다 및 CR 매체에 모든 식민지 빨갛게 될 것 결국 시간이 지남에 있기 때문에, 1 주일 이내 사용 해야 합니다.
   2. 조 흔 격판덮개에서 3 빨간 식민지를 수확 하 여 TCS 국물 사전 문화를 예방.
      참고: 3 식민지와 접종 누구의 독성 플라스 미드 유전자 재결합을 겪고 있다 단일 클론 선택의 가능성을 제한 하 수행 됩니다.
   3. 200 rpm에서 37 ° C에서 16 h 떨고 인큐베이터에서 액체 세균성 문화를 성장. 75 mg/mL의 최종 농도에 암 피 실린을 추가 합니다. 으로 항생제의 과잉 큰 독성 플라스 미드의 손실로 이어질 수 있습니다 항생제 농도가 최소 억제 농도, x 3를 넘지 말아야 한다.
      참고: Shigella 독성 플라스 미드의 유지 보수는 도금 ....

결과

Shigella 침공은 관련 된 비정형 오랫동안 로컬 Ca^{2 +} 응답:

위에서 언급 한 프로토콜에 따라 Fluo-4 로드 HeLa 세포 WT Shigella 와 도전 그리고 스트림 인수 Ca^{2 +} 신호 분석을 수행 했다. 대표적인 실험 단일 셀, 그리고 해당 단계 대조 이미지 (그림 1A, 왼쪽에 대 한 관심의 영역에서 평균 Fluo-4 프로브의 형광 강도의 시간 경과 이미지 시리즈 그림 1에 표시 됩니다. 패널)입니다. Shigella 침공 사이트 막 주름 위상 대비 이미지 (그림 1A, 화살표)에서 발견에 의해 특징입니다.......

토론

이 원고는 우리 Shigella의 확장된 활동 동안 글로벌 Ca^{2 +} 응답 Shigella 침공의 상대적으로 짧은 활동 기간 동안 로컬 Ca^{2 +} 신호를 따라 설계 된 프로토콜을 설명 합니다. 아래 키를 캘리포니아^{2 +} 의 검색을 최적화 하기 위해 해결 되어야 할 문제를 찾을 수 있습니다 생물 학적 과정을 어떤 방해를 최소화 하면서 신호.

화학 대 유전자에 캘리포니아^{2 +} 프로브 인코딩:

로컬 Ca^{2 +} 유사 이미지, 우리는 그것의 높은 양자 수율 및 그것의 빠른 응답 역학 Fluo-4 화학 프로브를 사용 합니다. 듀얼 파장 수집을 수행할 수 없습니다 이후 인수에 필요한 속도 또한 비율 프로브를 사용 하 여를 걸로 하겠습니다. 그러나 병원 성 미생물의 사용, 캘리포니아^{2 +}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph 버전 7.7	Universal Imaging
CoolLED 조명 시스템 pE-2	Roper Scientific
마이크로 디쉬 35mm, 높이	IBIDI	81156
Trypticase Soy (TCS) 육수	Thermofisher		B11768
TCS 한천	Thermofisher		B11043
콩고 레드	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri Serotype V. AfaE adhesin
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	AfaE 부착물을 발현하는 동원성 ipgD 돌연변이 균주