방법 논문

CRISPR/Cas9 유전자 인간 말라리아 기생충의 조건부 돌연변이 게 P. falciparum 에 편집

DOI:

10.3791/57747

⸱

2018년 9월 18일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular Biology, University of Georgia, 2Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리 glmS생성 하는 방법에 설명- 변형 체 falciparum 게놈 편집 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 조건부 최저의 돌연변이 체를 기반으로.

초록

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말라리아 병 적 상태와 사망률 전세계의 중요 한 원인입니다. 주로 열 대와 아열대 지역에 그 생활에 영향을 미치는,이 질병은 변형 체 기생충 감염에 의해 발생 합니다. 전투 말라리아에 더 효과적인 약물의 개발이 복잡 한 기생충의 생물학의 우리의 이해를 개선 하 여 가속 될 수 있다. 이 기생충의 유전자 조작; 그들의 생물학을 이해 하는 열쇠 이다 그러나, 역사적으로의 P. falciparum 게놈이 되었습니다 조작 하기 어려운. 최근, CRISPR/Cas9 게놈 편집 태그, 조건부 단백질 knockdowns의 생성 및 유전자의 삭제 쉽게 단백질에 대 한 허용 하는 말라리아 기생충에 이용 되어 있다. CRISPR/Cas9 게놈 편집 말라리아 연구의 분야를 발전을 위한 강력한 도구가 될 입증 되었습니다. 여기, 우리가 glmS생성 하는 CRISPR/Cas9 방법 설명- P. falciparum에 조건부 최저의 돌연변이 기반으로. 이 메서드는 매우 다른 종류의 유전자 조작, 단백질 태그를 포함 하 여 및 유전자 녹아웃에 적응할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

말라리아 속 변형 체의 protozoan 기생충에 의해 발생 하는 치명적인 질병 이다. P. falciparum, 대부분 치명적인 인간 말라리아 기생충 51세 미만의 아이 들에서 주로 년 당 약 445,000 사망자를 발생합니다. 변형 체 기생충 모기 벡터와 척추와 관련 된 복잡 한 라이프 사이클 있다. 인간은 먼저 감염 된 모기는 혈액 식사 때 감염 될. 그런 다음, 기생충 어디 그것은 성장, 발전 하 고 분할 약 1 주일 간 침공. 이 과정 후, 기생충은 어디 그들이 받을 성적 복제 적혈구 (Rbc)에 혈 류로 발표 됩니다. Rbc 내 기생충의 성장을 직접 말라리아2와 관련 된 임상 증상에 대 한 책임이 있습니다.

최근까지, 유전자 변형 P. falciparum 에의 생산 힘 드는 과정, 몇 달 동안을 했다 하 고 높은 고장율을 했다 약물 선택의 여러 라운드를 포함 했다. 이 시간이 걸리는 절차 relieson 무작위 DNA의 세대 나누기 관심 영역에 비록 그것의 게놈을 고쳐야 하는 기생충의 내 생 능력 동종 수리3,,45,6 . 최근, 클러스터 정기적으로 Interspaced 구조 반복/Cas9 (CRISPR/Cas9) 게놈 편집은 성공적으로 이용 되어 P. falciparum7,8. 말라리아 연구에서이 새로운 기술의 도입이 치명적인 변형 체 기생충의 생물학의 이해를 발전에 대 한 중요 한 되었습니다. CRISPR/Cas9 가이드 동종 관심사의 유전자는 RNAs (gRNAs)을 통해 유전자의 특정 대상에 대 한 수 있습니다. GRNA/Cas9 복잡 한 gRNA를 통해 유전자 인식 하 고 Cas9 다음 유기 체9,10수리 메커니즘의 개시를 강제로 이중 가닥 브레이크 소개. P. falciparum 복구 비 동종 끝에 합류를 통해 DNA 나누기 기계 부족, 때문에 그것은 동종 재결합 메커니즘을 활용 하 고 Cas9/gRNA-유도 복구 동종 transfected DNA 템플릿을 통합합니다 두 배 물가 틈11,12.

여기, 선물이 프로토콜 P. falciparum 에 조건부 최저의 돌연변이의 발생을 위한 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용 하 여. 프로토콜에는 PfHsp70x의 조건에 따라 최저 단백질 수준 glmS ribozyme의 사용 방법을 보여 줍니다 (PF3D7_0831700)는 보호자 여 내보낸 P. falciparum 호스트에 Rbc13,14. GlmS ribozyme 다니엘의 관련된 mRNA, 단백질14에 있는 감소에 지도를 (어떤 셀에 글루코사민-6-인산으로 변환 됩니다) 글루코사민 치료 활성화 됩니다. 이 프로토콜 불안 도메인 또는 RNA aptamers4,,515등 다른 조건부 최저의 도구 활용을 쉽게 적응 될 수 있다. 우리의 프로토콜 내용을 조류 (HA) 태그와 glmS ribozyme 코딩 시퀀스 시퀀스에 의해 형벌의 구성 된 수리 플라스 미드의 세대는 동종 PfHsp70x 열려있는 독서 프레임 (ORF)와 3'-UTR에 있습니다. 우리는 또한 드라이브 식는 gRNA의 두 번째 플라스 미드의 생성을 설명합니다. 드라이브 Cas9의 표현 제 3 함께 이러한 두 개의 플라스 미드는 Rbc로 페 고 P. falciparum 기생충의 게놈을 수정 하는 데 사용. 마지막으로, 우리는 연쇄 반응 (PCR) 기술-태그와 glmS ribozyme의 통합을 확인 하는 기술을 기반으로. 이 프로토콜은 수정 이나 말라리아 기생충의 생물학에 새로운 통찰력을 생성 하는 우리의 기능을 강화, 어떤 P. falciparum 유전자의 완전 한 녹아웃에 대 한 높은 적응력입니다.

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프로토콜

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P. falciparum 에의 지속적인 문화 인간의 RBCs의 사용을 요구 하 고 우리 모든 식별자의 박탈 되었고 익명 혈액의 상업적으로 구입한 단위를 활용. 제도적 검토 보드와 조지아 대학에서 Biosafety 사무실 우리의 프로토콜을 검토 하 고 우리가 실험실에서 사용 되는 모든 프로토콜을 승인 했다.

1. gRNA 시퀀스 선택

  1. CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/)에 고 ' Fasta 대상 '을 선택 합니다. '대상', 열려있는 독서 프레임 (ORF) 유전자의 3' 끝에서 200 기본적인 쌍 그리고 유전자의 3'-UTR의 시작에서 200 자료 쌍을 붙여 넣습니다. 아래 '에서', 'P. falciparum' 선택 (3D 7 v3.0), ' CRISPR/Cas9 ' 에서 '사용'을 선택 하 고. 다음, ' 찾을 대상 사이트 '를 클릭 합니다.
  2. 가장 효율적인 gRNA 수정의 사이트에 가장 가까이 있고 가장 적은에서 대상 사이트에 특혜를 주는 제시, 옵션에서 gRNA 시퀀스를 선택 합니다.
    참고: 때문에 그들은 즉시 업스트림의 Protospacer 인접 한 모티브 (PAM),이 DNA에 Cas9의 채용에 필요한 잠재적인 gRNA 시퀀스 식별 됩니다. PMK-U6, 벡터는 gRNA 식으로 복제 되는 순서는 20 기지 PAM의 즉시 업스트림. S. pyogenes Cas9에 대 한 특정 팸 뉴클레오티드 순서 NGG 이며 pMK U6로 복제 시퀀스에 포함 되 면 안.
    참고: CHOPCHOP 시각적으로 순위 gRNA 시퀀스, 앰버, 덜 이상적인 옵션 녹색과 빨간색으로 최악의 옵션에서 최고의 옵션을 표시 합니다. CHOPCHOP 각 gRNA 시퀀스는 문학에서 가장 최신 매개 변수를 사용 하 여 계산 하는 효율성 점수를 그리고 그들은 예측 대상 오프 사이트는 gRNA에 의해 인식 될 수 있는. 2 개 또는 3 개의 gRNA 시퀀스는 특정 유전자에 적합 한 최고의 gRNA를 찾으려고 시도 할 수 있습니다.
  3. GRNA 시퀀스 및 그것의 반전 보수 Polyacrylamide 젤 전기 이동 법 정화 oligos로 구입. 대상 PfHSP70x 사용 하는 gRNA 순서는 그림 1B에서 찾을 수 있습니다.
    참고:이 올리고 15 기본 쌍 gRNA 표현 플라스 미드를 동종 시퀀스 및 결 찰 독립적인 pMK U6 벡터16으로 (SLIC) 복제에 필요한을 포함 해야 합니다.

2. 복제 시퀀스 pMK U6 gRNA

  1. BtgZI와 pMK U6 다이제스트.
    1. 60 ° c.에 3 h BtgZI 효소 (5, 000 단위/mL)의 5 μ와 pMK U6의 다이제스트 10 μ g 반응 조건에 대 한 효소 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다.
    2. 3 h 잠복기 후 플라스 미드의 완전 한 소화를 위해 반응에 BtgZI의 추가 3 μ를 추가 합니다. 아직도 정확한 반응 조건 보장에 대 한 제조업체의 지침에 따라 추가 3 h에 대 한 다이제스트.
    3. 반응에서 소화 pMK U6 정화 열 기반 PCR 정리 키트 제조업체의 지침에 따라 사용 합니다.
    4. 0.7 %agarose 젤을 사용 하 여 소화 DNA를 분리 하 고 추출 4200 기반 쌍 밴드.
  2. GRNA 시퀀스가 포함 된 oligos anneal
    1. Nuclease 무료 물을 사용 하 여 100 μ M의 농도에 페이지 정화 oligos reconstitute
    2. 10 x 버퍼 2 ( 재료의 표참조)의 2.2 μ와 각 oligo의 10 μ를 결합 합니다. 총 반응 볼륨 22.2 μ 인지 확인 합니다.
    3. 어 닐 링 한 thermocycler 프로그램 gRNA를 실행: 단계 1: 95 ° C, 10 분; 단계 2: 95 ° C, 1 0.6의 온도 있는 감소와 함께 s ° C/사이클; 3 단계: 2 단계 16 번; 이동 단계 4: 85 ° C, 1 분; 단계 5: 85 ° C, 1 s, 0.6 ° C/주기;의 온도 있는 감소와 함께 6 단계: 16 번; 5, 단계로 이동 단계 7: 75 ° C, 1 분; 8: 75 ° C, 1 단계 0.6의 온도 있는 감소와 함께 s ° C/사이클; 9 단계: 16 번, 8 단계로 이동. 단계 10-21: 4-9 단계에서 사용 하는 온도 25 ° C에 도달할 때까지 절차를 반복 단계 22시 25분 ° C, 1 분.
  3. BtgZI 소화 하 고 젤 정화 pMK U6 플라스 미드에 단련된 gRNA oligos를 삽입 합니다.
    1. 단련된 gRNA oligos의 버퍼 2.1 및 3 μ x 10의 1 μ와 소화 pMK U6의 결합 100 ng. Nuclease 무료 물 9.5 μ를 볼륨을 증가.
    2. T4 중 합 효소의 0.5 μ를 추가 하 고 품 어 2.5 분 동안 실내 온도에 반응.
    3. 얼음을 10 분 동안 품 어 반응을 이동 합니다.
    4. 즉시 5 μ로 유능한 대장균 박테리아 공급 업체의 지침에 따라 반응의 변환. Lysogeny 국물 (파운드) 한 천 배지 100 μ g/mL 암 피 실린 포함에 박테리아 접시
    5. 37 ° C에서 하룻밤, 그 후에 식민지를 선택 성장과 상용 플라스 미드 miniprep 키트와 함께 DNA를 추출 변환된 박테리아 허용.

3. 상 동 지역 복구 서식 파일의 디자인

  1. 다시는 게놈으로 통합 된 DNA의 절단을 방지 하기 위해 상 동 수리 템플릿에서 디자인 방패 돌연변이.
    참고: 방패 돌연변이 일반적으로 이루어져 있다 Cas9 복구 서식 파일에서 휴식을 유도 하지 것입니다 있도록 PAM을 변경할 침묵 돌연변이 소개. PAM이이 프로토콜에서 사용 하는 Cas9 "NGG", 여기서 "N"은 어떤 뉴클레오티드 염기 순서에 대 한 필요 합니다. 만약에 가능 하다 면, 변경 중 G 뉴클레오티드는 A, C, 또는 T
    1. PAM는 자동으로 변경 될 수 없습니다, 경우 직접 인접 하는 PAM7,86 기본적인 쌍에 2 침묵 돌연변이 소개 합니다.
      참고: 이러한 돌연변이 gRNA에 의해 수리 템플릿 인정을 방지 하 고 다시 절단 Cas9/gRNA에 의해 복구 된 로커 스의 복잡 한 방지 됩니다. 방패 돌연변이 돌연변이 포함 하는 뇌관으로 DNA를 증폭 하 여 상 동 지역에 도입 될 수 있습니다.
  2. 복구 서식 파일에 대 한 ORF 상 동 영역을 증폭.
    1. PCR를 사용 하 여 대상 유전자의 ORF의 3' 끝에서 800 기본 쌍 증폭. 디자인 뇌관이이 amplicon에서 정지 codon를 제외 하는 데 사용 됩니다.
    2. 에는 pHA-glmS DNA 결 찰 반응 또는 SLIC16SacII와 AfeI 소화 되어이 amplicon의 삽입을 위한 뇌관 디자인.
  3. 3'-UTR homology 지역 복구 서식 파일에 대 한 증폭.
    1. PCR를 사용 하 여 대상 유전자의 정지 codon 직후 800 기본 쌍 증폭. 프라이 머는 pHA-glmS DNA 결 찰 반응 또는 SLIC16HindIII와 NheI 소화 된로이 amplicon의 삽입에 대 한 디자인.
      참고: P. falciparum 게놈의 내용에서 높은 증폭 Utr 등 지역의 어려운 만들 수 있습니다. PCR를 사용 하 여 다른 접근 방법 상 동 지역 합성 이다.

4. 수리 플라스 미드로 상 동 영역 복제

  1. PHA-glmS에 ORF 상 동 영역을 삽입 합니다.
    1. 효소 제조 업체의 지침에 따라는 pHA-glmS SacII와 AfeI, 소화. SLIC16를 사용 하 여 소화 플라스 미드에 ORF homology 지역 PCR 제품을 삽입 합니다.
    2. 2.3.4, 2.3.5 단계에서 유능한 대장균 에 변환.
  2. 3'-UTR homology 지역 ORF 상 동 지역에 이미 있는 pHA glmS 플라스 미드에 삽입 (단계 4.1 참조).
    1. 효소 제조 업체의 지침에 따라 HindIII와 NheI 플라스 미드를 소화. 3'-UTR homology 지역 amplicon SLIC16를 사용 하 여 소화 플라스 미드에 삽입 합니다.
    2. 유능한 대장균 으로 변환 하 고 플라스 미드 DNA (2.3.4 단계와 단계 2.3.5) 추출.

5. 계기 DNA Transfection에 대 한

  1. 추가 40 μ g 각 pMK U6, pUF1-Cas9, 그리고 pHAglmS DNA (DNA의 120 μ g의 총)에 대 한 살 균 1.5 mL microcentrifuge 관에의 합니다.
  2. 1/10을 추가 물 (pH 5.2) 튜브에 3m 나트륨 아세테이트의 DNA의 소용돌이 사용 하 여 잘 섞는다 (예를 들어, 단계 5.1에서에서 볼륨은 100 μ, 추가 나트륨 아세테이트의 10 μ).
  3. 튜브를 2.5 배 100% 에탄올의 볼륨을 추가 하 고 적어도 30에 대 한 소용돌이 사용 하 여 잘 섞어 s (예: 5.1에서 볼륨은 100 μ, 추가 100% 에탄올의 250 μ).
  4. 얼음에 또는 30 분 동안-20 ° C에서 튜브를 놓습니다.
  5. 18,300 x g 4 ° c.에 30 분 동안에 관을 원심
  6. 튜브에서는 상쾌한을 조심 스럽게 제거. 펠 릿을 방해 하지 마십시오.
  7. 튜브를 3 번 70% 에탄올의 볼륨을 추가 하 고 간단히 소용돌이 사용 하 여 그것을 혼합 (예. 5.1에서 볼륨 100 μ, 있었다면, 70% 에탄올의 300 μ 추가).
  8. 18,300 x g 4 ° c.에 30 분 동안에 관을 원심
    참고:이 단계는 생물 안전 캐비닛에 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.
  9. 튜브에서는 상쾌한을 조심 스럽게 제거. 펠 릿을 방해 하지 마십시오. 튜브를 열어두고 고 15 분 동안 건조를 펠 릿.
  10. Transfection를 위해 필요한 때까지-20 ° C에서 침전 된 DNA를 저장 합니다.

6. 인간의 Rbc Transfection에 대 한 준비의 전체 혈액에서 분리

  1. Aliquot 살 균 50 mL 원뿔 튜브 (튜브 당 약 25 mL) 신선한 혈액.
  2. 4로 설정 하는 원심 브레이크와 함께 1,088 x g 12 분에 튜브를 원심.
  3. 표면에 뜨는 버 피 코트에서 발음. 불완전 한 RPMI의 동등한 양으로 RBC 펠 릿 resuspend
    참고: 불완전 한 RPMI 10.32 μ M 티 미 딘와 110.2 μ M hypoxanthine, 1mm 나트륨 pyruvate, 30 mM 나트륨 중 탄산염, 5 mM HEPES, 포도 당 11.1 m m, 0.02% (v/v) gentamicin RPMI 1640을 보완 하 여 준비 된다.
  4. 6.2-6.3 단계를 두 번 반복 합니다. 마지막 세척 후 불완전 RPMI의 동일 볼륨에 있는 Rbc를 resuspend 및 4 ° c.에 튜브를 저장

7. CRISPR/Cas9 플라스 미드와 transfecting Rbc (해야 할 Aseptically)

참고: P. falciparum 문화는 다른 보고서17에 설명 된 대로 유지 됩니다. 달리 명시 하지 않는 한 3% O2, 3%의 CO2및 94% N2 에서 37 ° C에서 모든 문화를 유지 합니다. 혈액이 프로토콜에서을 사용할 때마다 순수한 적혈구 단계 6에서에서 준비 참조입니다. 일반적으로 오래 된 혈액에서 기생충 확산 감소는 혈액 사용 6 주 이상 수 없습니다. 다음 단계는 DNA와 transfected 세포에 기생 문화를 추가 사전 로드 Rbc를 설명 합니다. 다른 설립된 transfection 프로토콜 이러한 구문을18,19transfecting와 호환 됩니다.

  1. 준비 물 (120 m m KCl, 0.15 m m CaCl2, 2mm EGTA, 5 m MgCl2, 10 m m K2HPO4, 25mm HEPES, pH 7.6 m)에 1 x cytomix 버퍼. 필터-0.22 μ m 필터를 사용 하 여 버퍼를 소독.
  2. DNA에 1 x cytomix의 380 μ 침전 단계에서 5, 그리고 해산 하는 소용돌이 추가 합니다. 1 x cytomix에서 10 분, vortexing 10 매 3 분에 대 한 해산 DNA 수 s.
  3. 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 결합 RBCs의 300 μ (50% 보통, 단계 6에서에서) 1 개의 x cytomix의 4 mL와 불완전 RPMI에.
  4. 3 분, 870 x g 에서 7.3 단계에서 Rbc 원심 고는 상쾌한 RBC 펠 릿에서 제거.
  5. 6.2 단계에서 DNA/cytomix 혼합과 펠 릿 RBC 및 0.2 cm electroporation 베트에 resuspend.
  6. Electroporate 다음 조건을 사용 하 여 Rbc: 0.32 kV, 925 µ F, "높은 모자", 그리고 저항을 설정 "무한"로 설정.
  7. Electroporation, 다음 완전 한 RPMI (cRPMI)의 15 mL 원뿔 포함 5 mL에는 베트에서 내용을 전송. 870 x g 20 ° C에서 3 분에 튜브 원심 고는 상쾌한을 가만히 따르다.
    참고: cRPMI는 0.25% (w/v) 지질이 풍부한 소 혈 청 알 부 민 추가 불완전 RPMI로 동일한 방법을 통해 준비 하 고 있습니다.
  8. CRPMI 및 6 잘 조직 문화 접시에 하나 잘 전송 4 mL에 펠 릿을 resuspend. 높은 schizont 문화의 400 μ 추가 (7-10% schizont parasitemia 이상적 이다) transfected RBCs를.
    참고: Parasitemia 기생충에 감염 된 RBCs의 백분율로 정의 됩니다.
  9. 다음 날, cRPMI의 4 mL와 함께 문화를 씻어. 원심 870 x g 3 분에 문화 하 고는 상쾌한 발음. CRPMI의 4 mL에 문화를 resuspend.
  10. 7.6, 단계를 완료 한 후 48 h cRPMI의 4 mL와 함께 문화를 씻어. 다음 문화 1 μ M를 포함 하는 cRPMI에서 resuspend DSM1 Cas9 플라스 미드에 대 한 선택.
  11. 세탁 문화 cRPMI와 함께 매일 기생충은 더 이상 혈액 얼룩으로 표시 될 때까지 계속 합니다. 이 시점 이후 바꿉니다 문화 매체 신선한 cRPMI 플러스 1 μ M DSM1 모든 48 h.
    1. 혈액 얼룩, 0.6 mL 원심 분리기 관으로 문화의 150 μ를 플라스틱을 확인 하십시오. 1700 x g 30에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 s.
    2. 상쾌한에서 발음. 수송과 세포를 유리 슬라이드에 전송 하는 피 펫을 사용 합니다. 첫 번째 슬라이드에 45 ° 각도에서 열린 두 번째 유리 슬라이드를 사용 하 여, 혈액 방울 얼룩. 제조 업체의 프로토콜에 따라 상용 얼룩 키트를 사용 하 여 슬라이드를 얼룩.
    3. 기름 침수 목표 X 100을 사용 하 여 기생충을 볼.
  12. 5 일 후 transfection (7.6 단계) Rbc 문화 매체에서 resuspended와 문화의 2 개 mL를 제거 합니다. 다시 2 mL 신선한 매체 추가 (cRPMI 1 μ M 플러스 DSM1)과 2%가 혈액. 추가 신선한 혈액이 방식에서까지 주 기생충 다시 한 번 얇은 혈액 얼룩 (스텝 7.11)에 의해 결정으로.
    참고: 통합에 성공할 경우 기생충 일반적으로 다시 문화에 한 달 후 transfection에 의해.
  13. 기생충 reemerge DSM1 마약 압력 제거. 기생충으로 복제 된 후에 또는 마약 압력을 제거 합니다.

8. 복구 서식 파일의 통합에 대 한 기생충 검사

  1. 기생충 얇은 혈액 얼룩에 의해 다시 표시 될 때, 적절 한 키트를 사용 하 여 문화에서 DNA를 분리.
  2. PCR를 사용 하 여 대상된 로커 스 성공적으로 변경 되었습니다 및 수정 되지 않은 야생-타입 로커 스 (야생 형 기생충의 지표)는 감지 하는 경우 결정 하는 게놈의 수정 된 영역을 증폭.
    1. 복구 템플릿 통합 기생충 검출, ORF, 복제 된 상 동 지역 외부의 시작 부분에 위치 하 고 앞으로 뇌관을 사용 합니다. 3'-UTR에 앉아 역방향 뇌관을 사용 합니다.
      참고:이 증폭 하 태그와 glmS ribozyme의 시퀀스를 포함, 통합된 기생충에서 amplicons 될 것입니다 야생 형 기생충에 증폭 같은 지역 보다.

9. 희석을 제한 하 여 기생충 복제

  1. 기생충 문화의 직렬 희석 단계의 7.13 0.5 기생충/200 μ의 최종 농도 달성 하기 위해 수행 합니다. 96-잘 조직 배양 접시의 우물에 희석 문화의 200 μ를 추가 합니다.
    참고: parasitemia 감염 된 RBCs의 백분율로 정의가 정의 수 (2%) 이기도 하기 때문에, 단위 부피 당 기생충의 수는 쉽게 유추.
    1. 5 %parasitemia 및 2%가 cRPMI에서 문화의 1 mL를 준비 (이러한 parasitemia 및 보통 수준의 문화 포함 1 x 107 기생충/mL).
    2. CRPMI와이 문화 1: 100 희석. 다시 cRPMI와 1: 100 희석.
    3. 1:400 희석. 이 희석 문화의 62.5 μ 25 mL cRPMI의 및 혈액의 1 mL에 추가 하 여 수행 합니다. 이 희석 0.5 기생충/200 μ의 원하는 농도에서 발생합니다.
  2. 기생충은 우물에서 감지 될 때까지 복제 접시를 유지 합니다.
    1. 모든 48 h 신선한 매체 96 잘 접시에 매체를 바꿉니다.
    2. 일주일에 한 번 복제 판 (단계 9.1) 시작 후 5 일 부터는 각 우물에서 100 μ를 제거 하 고 다시 100 μ 신선한 매체 + 혈액 (보통 2%)의 추가.
  3. 기생충을 포함 하는 어떤 우물을 식별 합니다.
    1. 약 20 분, 접시 내 각도에서 정착 혈액 수 있도록 45 ° 각도로 96 잘 접시를 놓습니다.
    2. 라이트 박스에 96 잘 접시를 놓습니다. 기생충을 포함 하는 우물 기생충에 의해 매체의 산성화로 인해 기생충 무료 웰 스의 핑크 미디어에 비해 색상에서 노란색은 미디어를 포함을 확인 합니다.
    3. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하는 parasitemia의 확장 있도록 24-잘 조직 문화 접시에 기생충을 포함 하는 웰 스의 내용을 이동 합니다.
    4. 를 사용 하 여 PCR 분석 8 단계에 설명 된 대로 올바른 통합이 클론 기생충 라인 확인 합니다.

10. 글루코사민과 서쪽 오 점 분석을 통해 확인 된 기생충을 치료 하 여 단백질의 분해

  1. 0.5 M GlcN (글루코사민) 재고 솔루션,-20 ° c.에 저장 될 수 있는 준비
  2. GlmS 기생충 문화에 GlcN를 추가 하 고 GlcN의 면 전에 서 성장 하도록 허용.
    참고: 최종 농도 및 GlcN 치료의 타이밍 실험 및 기생충 라인에 따라 다릅니다. GlcN 부모의 기생충 스트레인 화합물에 그것의 감도 결정 하는 범위의 GlcN 농도에 노출 되어야 합니다 그래서 기생충 성장 영향을 줄 수 있습니다. 종종, 2.0-7.5 m m GlcN의 농도 사용된13,,1420입니다.
  3. 13GlcN 처리 기생충 단백질 견본을 격리 합니다.
  4. 서쪽 오 점 분석을 위한 단백질 견본을 사용 하 여 단백질13감소를 감지.
    1. 제조업체의 지침에 따라 안티-HA 항 체를 사용 하 여 HA glmS 태그 단백질을 검출 하기 위하여. PfEF1α 같은 로드 제어 하 밴드를 비교 합니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

방패 돌연변이의 예가이 방법에서 사용 되는 플라스 미드의 회로도 그림 1에 나와 있습니다. Transfection 후 돌연변이 기생충을 식별 하는 방법의 예를 들어, HA-glmS 구문의 통합 검사 PCRs에서 결과 그림 2에 표시 됩니다. 복제 판의 대표 이미지 기생충의 매체의 색상 변화를 설명 하기 위해 그림 3 에 표시 됩니다. 면역 형광 분석 결과 및 서쪽 더 럽 히 실험 결과 HA 태그 glmS기능을 보여 주기 위해 그림 4 에 표시 됩니다-기생충에서 단백질의 감소를 기반으로. 그림 5 에서는 기생충 게놈 수정 가능한 돌연변이 얻을을 PCR 제품에 짧은 상 동 팔의 ...

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토론

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CRISPR/Cas9 P. falciparum 에 구현은 모두의 효율성을 증가 하 고 기생충의 게놈, 유전자 조작의 이전 방법에 비해 수정에 필요한 시간을 감소. 이 포괄적인 프로토콜 P. falciparum에 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 조건부 돌연변이 생성에 필요한 단계를 설명 합니다. 여기 방법은 하-glmS 돌연변이의 발생을 위해 특별히 기어 드,이 전략의 다양 한 요구, 유전자, 유전자 녹아웃 그리고 점 돌연변이의 소개의 태그를 포함 하 여에 대 한 적응 될 수 있습니다.

이 프로토콜의 중요 한 초기 단계는 gRNA 시퀀스의 선택 이다. gRNA를 선택할 때에 gRNA 앉아, 그것은 얼마나 효율적 오프 대상 효과 대 한 잠재력을가지고 여부 등 고려해 야 할 몇 가지 포인트 있다. GRNA 시퀀스 수정, 200의 기본적인 쌍 이내의 사이트에 가능한 한 가까이 있어야 합니다. 이 태그를 통합 하지 않고 그들의 게놈을 해...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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우리 조지아 대학 (UGA) 생물 현미경 핵심 기술 지원 Muthugapatti Kandasamy와 호세 후안 로페즈-루비 오 pUF1 Cas9 및 pL6 플라스 미드를 공유 하기 위한 감사. 이 작품 호 재단 수상 D.W.C. 하 고 H.M.K.에 의해 지원 되었다 UGA 시작 자금 V.M., V.M., 그리고 미국 국립 보건원에 천 재단 (바 질 오 코너 스타터 학술 연구 상)의 3 월에서에서 보조금을 부여 (R00AI099156 및 R01AI130139) V.M. 하 고 (T32AI060546) H.M.K.를

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652660
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad165-2086우리는 개별 포장 된 것들을 구입
테이나트륨 Sigma-AldrichS2889-250g
DSM1Akhil Vaidya labGanesan et al. Mol. Biochem. 기생충. 2011 177:29-34
TPP 조직 배양 6 웰 플레이트MIDSCITP92006
TPP 100mm 조직 배양 접시 (12 mL 플레이트)MIDSCITP93100
TPP 조직 배양 96 웰 플레이트MIDSCITP92096
TPP 조직 배양 24 웰 플레이트MIDSCITP92024
NEBuffer 2New England Biolabs#B7002S
NEBuffer 2.1뉴잉글랜드 바이오랩#B7202S
BtgZI뉴잉글랜드 바이오랩#R0703L
SacII뉴잉글랜드 바이오랩#R0157L
HindIII-HF뉴잉글랜드 바이오랩#R3104S
Afe1뉴잉글랜드 바이오랩#R0652S
Nhe1-HF뉴잉글랜드 바이오랩스
T4 DNA 중합효소New England Biolabs#M0203S
500 mL Steritop 병 상단 필터 유닛MilliporeSCGPU10RE당신의 필요에 맞는 어떤 크기든 사용할 수 있습니다
EGTASigmaE4378-100G
KClSigma-AldrichP9333-500g
CaCl2Sigma-AldrichC7902-500g
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100g
K2HPO4FisherP288-500
HEPESSigma-AldrichH4034-500g
pMK-U6Muralidharan Lab
pHA-glmS
pUF1-Cas9Jose-Juan Lopez-Rubio LabGhorbal et al. Nature Biotech 2014
포도당시그마-알드리치G7021-1KG
중탄산나트륨시그마-알드리치S5761-500G
피루브산나트륨시그마-알드리치P5280-100G
하이포잔틴시그마-알드리치H9636-25G
겐타마이신 시약Gibco15710-064
ThymidineSigma-AldrichT1895-1G
PL6-eGFP BSDMuralidharan Lab
Puf1-cas9 eGFP gRNAMuralidharan Lab
NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.250
Albumax ILife TechnologiesN/A에서 기생충이 자랄 것인지 알아내기 위해 몇 가지 배치를 시도하고 싶을 것입니다
Interstate Blood Bank, Inc이메일을 보내거나 주문을 위해 직접 전화하십시오우리는 일반적으로 O+ 혈액
3D7 기생충 라인을요청 시 사용 가능N/A
용원 국물(LB)FisherBP1426-2당신은 직접 만들 수 있습니다, 정확히 이
AmpicilinFisherBP1760-25우리는 물에 100mg/ml로 1000X 재고를 만들고 -20C
AmpicilinClonetechR050A
Anti-EF1alphaDr. Daniel Goldberg's LabWashington University in St. Louis에. 웨스턴 블로트에 대해 선호하는 로딩 컨트롤을 사용할 수 있습니다. 이것은 우리가 실험실에서 사용하는 것입니다
Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonalMade by Roche, sold by Sigma11867423001당신은 선호하는 anti-HA 항체
0.6 mL 튜브FisherAB0350
Fisher HealthCare* 프로토콜* Hema 3* 수동 염색 시스템(고정제+솔루션 I 및 II)Fisher22-122-911giemsa 염색
도 사용할 수 있습니다.Fisherfines 프리미엄 서리 현미경 슬라이드 - 크기: 3 x 1 in.피셔12-544-3
합니다 아세트 #R3131L해당 없음 해당 없음 최고의 인간 적혈구 사용합니다 를 사용할 필요는 없습니다. 보관합니다. 를 사용할 수 있습니다

참고문헌

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