제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화

요약

여기, 우리는 공간 및 일시적으로 틱 용기 수정된 전체 마운트 제자리 교 잡 방법을 사용 하 여 가능한 microbiota의 존재를 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.

초록

Arthropod 벡터 전송한 전염병 전세계 인간의 건강에 중요 한 위협 계속. 그들은 벡터; 식민지 때 이러한 질병을 일으키는 병원 균 격리에 존재 하지 않는 오히려, 그들은 가능성이 창 자 루멘에 상주 미생물과 상호 작용에 관여. 벡터 microbiota 여러 벡터 품 어진 질병을 위한 병원 체 전송에 중요 한 역할을 증명 되었습니다. 보렐 리아 burgdorferi 를 포함 하 여 여러 가지 인간 병원 체의 벡터 Ixodes scapularis 진드기의 용기에 거주 박테리아 틱 전송 병원 체의 영향 여부는 결정 되지 않습니다. 특성화 틱 용기에 잠재적인 interspecies 상호 작용의 더 나은 이해를 촉진 하기 위하여 틱 용기와 관련 된 박테리아의 구성에 대 한 방법을 요구 합니다. 제자리에 전체-마운트를 사용 하 여 특정 세균 종족과 관련 된 RNA 사본 시각화 하 교 잡 풍부에 관한 질적 데이터의 수집과 microbiota 그대로 조직에의 분포에 대 한 수 있습니다. 이 기술은 틱 먹이의 과정을 통해 본질적인 microbiota 환경에 변화를 검사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 틱 유전자의 표현 분석에 적용 될 수 있습니다. 3 차원 개조를 위한 필요 없이 조직에 대상 RNA의 총 공간 분포에 대 한 수익률 정보를 내장 전체 눈금의 얼룩이 지 고 덜 자주 confounds 시퀀싱 기반 환경 오염에 의해 영향을 자주 복잡 한 미생물 지역 사회를 공부 하는 데 사용 하는 방법. 전반적으로,이 기술은 벡터-병원 체-microbiota 상호 작용 및 질병 전송에 있는 그들의 역할을 이해 하는 더 나은 하는 데 사용할 수 있는 유용한 도구입니다.

서론

Arthropod 벡터에 의해 전송 하는 인간과 가축 병원 체 전세계 발견 된다¹, 하지만 효과적인 세계적으로 전염 성 질환의 약 20% 차지 하 고이 병원 균의 대부분에 대 한 안전한 백신은 사용할 수 없습니다. 공생, 공생 그리고 병원 성 미생물, 미생물², 변조 및 형성 하는 거의 모든 metazoans³ 의 상태에서 통칭의 중요 한 역할에 대 한 우리의 이해를 확대 하고있다. 그것은 이제 분명 병원 체의 arthropod 벡터는 또한 본질적인 microbiota 항구 및 이러한 벡터 관련 microbiota 다양 한 벡터 매개로 병원 균^4,5에 영향을 보여왔다. Arthropod 미생물 eubacteria, archaea, 바이러스 및 원생 동물, 선 충, 곰 팡이⁶등 진 핵 미생물의 구성 됩니다. 그러나, 주된 연구 초점에 왔다 eubacteria 인해, 부분적으로, 마커 유전자와 특정 세균 회원을 식별 하기 위해 참조 데이터베이스의 가용성에.

Ixodes scapularis, 보렐 리아 burgdorferi⁷, 을 포함 한 여러 인간 병원 체의 진드기 벡터에 초점을 맞춘 Lyme 질병의 원인이 되는 대리인의 미생물 시각화 기술 최적화 겨냥 했다 벡터-병원 체 상호 작용의 맥락에서 틱 본질적인 microbiota의 우리의 이해를 향상. 틱 미생물 분야에 답변을 몇 가지 질문에 남아 있다. 용기는 진드기와 가로 옮겨진된 병원 체;의 맥락에서 들어오는 병원 체 사이 첫 번째 확장된 발생의 사이트 따라서, 벡터 본질적인 microbiota 변조 벡터-병원 체 상호 작용에서의 역할을 이해 하는 것은 의미 있는 통찰력 발표할 예정 이다. 진드기는 혈액 식사 소화, 혈액 식사 구성 요소 소요의 처리 장소⁸침의 독특한 모드. 창 자 루멘 겉보기 틱 피드로 혈액 식사를 포함 하는 그릇 역할 및 영양소 소화 및 동화 먹이의 몇 일 내내 찾다 후 반복 계속. 수 유 기간 동안 틱 인수 병원 균은 bloodmeal 함께 창 자 루멘을 입력 하 고 따라서 루멘 틱, 병원 체, 주민 microbiota 간의 상호 작용의 주 사이트 된다. 소화는 투입 및 Ixodid 틱 탈피를 통해 진행, 용기 구조 및 기능 변경⁹를 겪 습. 구성과 창 자가 박테리아의 공간 조직 변화 창 환경 콘서트에 다 것입니다. 그것은, 그러므로, 진드기, 병원 체, 본질적인 microbiota의 상호 작용을 완전히 이해 하 틱 용기에 있는 박테리아의 아키텍처를 이해 하는 것이 중요.

정기적으로 호스트 관련 microbiota를 설명 하기 위해 분자 기술을 높은 처리량 병렬 시퀀싱 전략¹⁰ 증폭 하 고 세균의 16S ribosomal DNA (rDNA) 시퀀스를 사용 합니다. 이 시퀀싱 전략 포위 axenic 문화 특정 박테리아의 샘플에 표시 하는 모든 세균성 회원에 대 한 깊이 있는 설명을 제공 하는 필요. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 전략은 진실 fide 주민에서 환경 오염을 구별 하는 무 능력에 의해 혼동 됩니다. 또한, 수익률 샘플 크기가 작은 고 따라서 낮은 microbiota 특정 DNA를 포함 하는 틱 같은 평가 때 환경 오염 물질의 확대의 가능성 증가¹¹ 이며의 모호한 해석 결과 미생물 구성입니다. 특정 실행 가능한 박테리아의 시각화와 함께에서 기능적 특성, 따라서 것입니다 정의 하 고 일시적으로 그리고 공간에 진드기의 미생물을 분별 하는 중요 한. 이 목표를 향해 우리는 교 잡 제자리에 전체 산 RNA의 이용을 했다. 이 기술은 정기적으로 기관과 배아^12,,1314 유전자 표현 패턴을 평가 하는 데 사용 되 고 관심의 전체 샘플에 식의 semiquantitative 분석을 허용 한다. 이 전통적인 제자리에서 교 잡 기술을 조직 단면도 활용 하 고 종종 전체 기관¹⁵식 예측 계산 어셈블리와 sectioned 물자의 광범위 한 분석을 필요로에서 다릅니다. 전체-마운트는 일반적으로 전체 유기 체¹²말합니다, 여기 전체 마운트 전체 용기 또는 장기를 말합니다. 틱 본질적인 microbiota의 아키텍처를 평가 하기 위해 교 잡 접근 제자리에 전체 산 RNA를 사용 하 여 장점은 가지각색입니다. 틱 용기 diverticula의 7 쌍 각 쌍 크기¹⁶에 다양 한 구성 되어 있습니다. 기능적 차이 하나이 diverticula 중 틱 생물학의 맥락에서 이해 되지 않는다 경우 틱 microbiota 또는 틱-병원 체 상호 작용. 용기 diverticula 파열 용기의 조작 microbiota 창 자 루멘 또는 느슨하게와 관련 된 본질적인 microbiota 공간 지 방화의 오해에 결과 치환 것 이다. 형광 표시 된 RNA 제자리에서 하이브리드는 이전 틱 용기 증명서¹⁷ 고정 하 고 개별 용기 diverticula 프로브 교 잡 보장 B. burgdorferi 지역화 하 고 개방 하 여 검사 이용 되어 단면 전체 틱 파라핀 포함¹⁸녹취 록. 이러한 두 방법 모두 본질적인 microbiota 아키텍처에 영향을 미칠 것 이라고 교 잡 이전 틱 조직의 조작이 필요로 합니다.

이 보고서에서 우리가 자세히 설명 가능한 틱 본질적인 microbiota 제자리에 전체 산 교 잡 (WMISH)를 사용 하 여 검사 하는 프로토콜. 전체 산 RNA 제자리에서 교 잡의 사용 존재의 세계 이해 및 소화 관의 다른 지역에서 특정 창 자가 박테리아의 풍부 및 틱 용기 생물학 병원 체 식민의 맥락에서 새로운 통찰력을 박차 수 있습니다. 그리고 전송입니다. 또한, RNA 프로브 특정 세균 RNA에 대 한 감독의 사용 틱 용기에 실행 가능한 박테리아의 수 있습니다.

프로토콜

1입니다. DNA 템플렛 준비

1. 다운로드 16S rRNA 순서 특정 세균 장군 각 하는 NCBI 데이터베이스 디자인과 연쇄 반응 (PCR) 호환에서 앞으로 역 앞에서 설명한 대로 속 특정 영역 (200 ~ 250 기본 쌍 롱)를 증폭 뇌관 ¹⁹. 또한 리소스를 참조 오픈 소스 데이터베이스 실바^20,21 , probeBase²² 온라인 rRNA 타겟 oligonucleotide 조사 및 뇌관, RNA 프로브 일부 세균 속에 대 한 상업적으로 있을 수 있습니다 사용할 수 있습니다.
   참고: 특정 특정 속 유전자 영역을 선택 하 여 설계 된 뇌관 관련된 세균 속을 증폭 하지 않습니다 확인 중요 하다. 이것은 교 잡 유전자/장군 전용 프로브를 중요입니다.
2. 마우스에 24, 48 또는 72 h 틱 용기를 해 부하 고 RNA와 기술된 이전²³으로 틱 용기에서 cDNA 준비 진드기 피드. PCR 템플릿으로 사용 cDNA 증폭 속 특정 amplicons thermocycler는을 사용 하 여. 1.5 %agarose 젤에 PCR-제품/amplicon의 약 수를 실행 하 고는 amplicon 젤 이미징 시스템을 사용 하 여 자외선 (UV) 빛에서 시각화 하 여 예상 되는 크기에 해당 함을 확인 합니다.
3. 살 균 소 polymerases (SP6, T7 또는 T3)에 대 한 적합 한 RNA 중 합 효소 발기인을 포함 하는 상용 따 벡터 (자료 테이블)에 박테리아 16S ribosomal RNA amplicon의 클론. 시퀀스는 amplicon의 정체성과 발기인의 각각에 관하여 클론의 방향을 확인 하 클론. 이에 따라, 감각 또는 센스 RNA를 생성 하는 선택의 발기인 프로브 (그림 1)을 결정 합니다.
4. 1 mg 최대 30 µLfor 제조업체에서 권장 하는 온도에서 2 h 양의 반응에 적절 한 제한 효소로 플라스 미드의 선형화 제한 효소 감 또는 센스 프로브 (그림 1)을 생성 하기 위해 사용 됩니다 발기인에 따라 선택 합니다. 1 %agarose 젤에 다이제스트 반응의 2 µ L의 시각화 하 여 선형화를 확인 합니다.
5. 상업적으로 이용 가능한 PCR 제품 열 정화 키트를 사용 하 여 소화 DNA의 나머지 28 µ L를 정화 하 고 분 광 광도 계에 의해 DNA 농도 계량.
   참고: 일부 감각 프로브 배경 해당 센스 프로브 보다 훨씬 높은 얼룩이 발생할 수 있습니다 그리고 다른 옵션을 탐험 할 수 있습니다. 대체 부정적인 컨트롤 샘플 또는 교 잡의 독특한 패턴을 생성 하는 다른 검색에 나타나지 하는 시퀀스를 인코딩 하는 플라스 미드를 포함 됩니다.

2. 건설 Digoxygenin UTP RNA의 프로브

1. 100 mM UTP, UTP-10 m m digoxygenin의 25 µ L 및 10 µ L 각 100 m m ATP와 GTP, CTP 1.5 mL 원심 분리기 튜브에서의 7.5 µ L를 결합 하 여 뉴클레오티드 혼합을 준비 합니다.
2. 녹음 방송 생체 외에서 수행 상용 T7 또는 Sp6 RNA 중 합 효소 키트를 사용 하 여, 1 µ L의 뉴클레오티드 혼합 (단계 2.1)를 사용 하 여 0.25-1 µ g 템플릿 DNA의. 물으로 20 µ L까지 볼륨을 가져와. 결합 하 고 스핀을 펄스 튜브를 터치 합니다. 2.5-3 h 37 ° C에서 품 어.
   참고: 프로브 건설 소화 플라스 미드 농도 7 ng / µ L, 낮은 하지만 전형적인 농도 15-25 ng / µ L에서이 단계에서 성공 했다. 녹음 방송 반응 또한 37 ° C에서 하룻밤 incubated 수 있습니다 하지만이 RNA 생산량을 크게 증가 하지 않습니다.
3. 1 µ L의 DNase 추가 (2, 000 단위 / µ L)와 10 분 동안 37 ° C에서 품 어. 10 분을 초과 하지 마십시오 또는 효소 RNA 타락을 시작할 수 있습니다.
4. 얼음 처럼 차가운 7.5-8 M 리튬 염화의 30 µ L 냉장 nuclease 무료 물에 RNA 침전을 30 µ L를 추가 합니다. 믹스에 튜브를 터치 합니다. -20 ° c.에 하룻밤 사이 진행 하는 RNA의 강 수를 허용
5. 4 ° c.에 20 분 동안 17000 x g에서 원심 분리 하 여 RNA를 수집 한번 Diethyl pyrocarbonate (DEPC) 물에서 갓된 75% 에탄올의 1 mL와 펠 릿을 세척 한 다음 원심 분리를 반복 합니다.
6. 제거 하 고 삭제는 상쾌한, 깨끗 한 종이 타월에 튜브를 반전 10 분 Resuspend nuclease 무료 물 속에서 펠 릿에 대 한 건조 허용. 쉽게 볼 수 있는 펠 릿 이면 25 µ L에서 resuspend. 펠 릿 매우 작은 또는 표시 되지 않는 경우에 15-20 µ L. resuspend 분 광 광도 계에 의해 RNA 농도의 견적을 얻을.
   참고: 일반적인 RNA 농도 범위 200-500 ng / µ L에서.

3. 시각화 RNA의 RNA의 순도 평가 하기 위해 포름알데히드 RNA 젤 전기 이동 법에 의해 조사

주의: 포름알데히드 포즈 흡입 위험; 따라서, 증기 두건에서 RNA 젤 분석에 필요한 솔루션을 생성 합니다. Ethidium 평범한 사람은 의심된 발암 물질; 관심을가지고 처리 합니다.

1. 앞서 설명한²⁴ 고 캐스팅 RNases의 무료 젤 상자에서 젤 1% 포름알데히드 agarose 젤을 준비 합니다. 일단, 젤 상자를 버퍼 (1 x MOPS pH 7.0, 5% 포름알데히드에서)를 실행 하는 x 1을 채우십시오.
2. (5 µ L 400 mg/mL ethidium 평범한 사람, MOPS, 35 µ L 포름알데히드, 및 100 µ L formamide x 20 µ L 10) 샘플 버퍼를 준비 합니다. 샘플 버퍼의 8 µ L에 2 µ L RNA 프로브 (단계 2.6)의 결합. 10 분 동안 70 ° C에서 품 어.
3. 5 mL 50% 글리세롤, 1 mL 10% 포름알데히드, 40 mg bromophenol 블루, 40 mg 자일 렌 cyanol, 0.5 M EDTA (pH 7.5)의 20 µ L를 결합 하 여 RNA 선적 버퍼를 준비 합니다. 사용 후-20 ° c.에이 버퍼 저장
4. 3.2 단계에서에서 RNA 샘플을 로딩 버퍼의 3 µ L을 추가 하 고 섞으십시오. 얼음에 샘플 튜브를 유지.
5. 젤으로 단계 3.4에서 전체 샘플 볼륨을 로드 합니다. RNA의 크기를 확인 하려면 함께 단일 가닥 RNA 사다리의 약 수를 로드 합니다. 100 V에서 젤을 실행 하거나 파란색 염료 마이그레이션합니다 젤 아래에 있는 방법의 약 75% 될 때까지. 자외선 젤 이미징 시스템을 사용 하 여에서 RNA를 시각화 한다.
   참고: 좋은 품질 RNA 프로브 프로브 (그림 2, 1 레인)의 예상된 크기에 이동성 이산 대역으로 나타나야 합니다. 경우 조사 무마 하 고 더럽혀진 밴드 (그림 22 차선)이 사용할 수 없는 나타납니다.

4. 틱 용기 수집 및 고정

1. 관심의 시간 포인트 마우스에 먹이 Ixodes scapularis 님프를 수집 합니다.
   참고:이 기술을 위해 틱 먹이 48 또는 72 h 일을 위한 최고의.
2. 해 부 현미경, 가능 한 한 많은 기관에 손상을 피하는 유리 슬라이드에 MEMFA (표 1)에 틱에서 용기를 해 부. MEMFA의 20-30 µ L에서 깨끗 한 현미경 슬라이드에 진드기를 놓습니다. 진드기의 시체를 떠나 틱의 연골에서 살 균 높은 탄소 철강 면도기 블레이드 #11 조각 머리 지역의 쌍을 사용 하 여. 부드럽게 용기 diverticula 및 침 샘 몸 표 피 밖으로 시체를 누릅니다. 침 샘 및 용기 고 면도날에 용기를 꺼내서 합니다.
3. 500 µ L MEMFA를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 배 짱을 수집 합니다. 부드러운 락을 1 시간으로 실내 온도에 튜브를 품 어 또는 4 ° c.에서 하룻밤
   참고: 진드기 침 샘 수 있습니다 또한 해 부와 마찬가지로 고정 되며 스테인드.
4. 부드럽게 1 mL 얼음 100% 에탄올으로 3 회 세척 하 여 조직을 탈수. 하자 각 씻어 사이의 튜브의 아래쪽에 자연스럽 게 침 몰 하는 배 짱으로 원심 분리는 조직 손상 될 수 있습니다. 장기 저장에 대 한 샘플에서에서 계속 100% 에탄올-20 ° c.

5. 건설의 메쉬 샘플 바구니와 24-잘 바구니 홀더

1. 바닥 2 mL 또는 5 mL 메스에 온수는 단일 양 날 면도날을 사용 하 여 스냅인 가기 원심 분리기 튜브를 잘라.
   주의: 블레이드의 컷이 완료 되기 전에 여러 번 재가 열 될 필요가 있습니다.
2. 새로운 튜브 오프닝 보다 약간 더 큰 110 µ m 나일론 메시의 사각형 컷. 눌러 그들 함께 가볍게 뜨거운 접시에 매체 낮은 열에 좋은 물개 때까지 튜브의 하단에 메쉬를 본드. 식, 메쉬 튜브 사이의 틈새가 없는지 확인 하 고 초과 메쉬 가장자리 주위를 잘라.
3. 잘라 구멍 24-잘 접시의 표지에는 단계 5.2에서 만든 샘플 바구니의 입술은 구멍에 앉아 되지가을 통해, 저조한 때 그들은에 배치 됩니다 샘플 바구니의 바닥 줄곧 우물에서에서 앉을 것 이다 설정 합니다 덮개에 있는 구멍.
4. 이 장착된 바구니 홀더를 사용 하 여 상대적으로 쉽게에 제자리 교 잡 프로토콜의 전체에 대 한 다른 한 접시에서 바구니를 전송. 2 개의 24-잘 접시를 사용 하 여 한 부 화 수행 하는 동안 다른 접시 다음 세척에 대 한 준비가 되어 있도록.

6. 제자리에서 교 잡: 하루 1 (타이밍: 4-5 h)

1. 전송 용기를 샘플 바구니를 분류, 실험 조건으로 구분 하며 RNA 프로브.
   참고: 조건 복제 중 자연 변화에 대 한 계정 당 최소 5 배 짱 얼룩.
2. 부드럽게 점차적으로 0.1% 비 이온 계면 활성 제 (PTw;와 인산 염 버퍼 염 분의 비율을 증가 시켜 조직에 기포를 소개 하지 않으려면 샘플 리하이드레이션 표 1) 세척에서의 에탄올
   참고: 별도로 명시 하지 않는 한 부드러운 동요와 주위 온도에 24-잘 바구니 홀더 모든 세척 완료. 각 바구니에 용기가 완전히 빠져들 것 같은 소유자의 각 잘으로 세척 솔루션의 aliquot 500-600 µ L. DEPC 처리 물 RNA 저하를 방지 하기 위해 모든 솔루션을 준비 합니다.
   1. 500 µ L 100% 에탄올에 5 분에 대 한 샘플을 씻으십시오.
   2. 75%의 샘플 바구니 당 적어도 500 µ L를 준비, 50% 및 25% 에탄올 PTw. 가장 낮은 가장 높은 에탄올 농도에서 이동 각 에탄올 용액에 5 분 동안 세척 하 여 샘플을 Rehydrate.
   3. PTw에 4 시간 5 분 대 한 샘플을 씻으십시오.
3. 가수분해 k 샘플 permeabilize (10 µ g/mL) 5 분 PTw에.
4. RNA 프로브와 교 잡 조직 준비.
   1. 6.2 500 µ L triethanolamine 버퍼 (0.1 m M, pH 7.0-8.0)에서 각 5 분 부드러운 동요와 주위 온도에 24-잘 바구니 홀더 아민 없는 환경에서 샘플을 유지 하기 위해 (표 1)에 설명 된 대로 두 번 샘플을 씻으십시오.
   2. Triethanolamine 버퍼 (0.1 m M, pH 7.0-8.0) 각, 5 분 동안에 500 µ L 0.25%의 아세트산 무수 물으로 두 번 샘플 처리 후 샘플 PTw 5 분에 두 번 세척.
      참고: 아세트산 무수 물 acetylates 프로브를 mRNA의 특정 바인딩 일반적인 정전기 상호 작용을 방지 하는 중요 한 포지티브 차지 무력화 무료 아민.
   3. PTw에 500 µ L 4 %paraformaldehyde 20 분에 대 한 용기를 수정 후 5 분 동안 PTw에 5 번을 씻어.
   4. 500 µ L 교 잡 버퍼 /in 떨고 물 욕조에 부드러운 동요와 60 ° C에서 1.5-2.5 h 24 잘 플레이트 (표 1)에 24-잘 바구니 홀더에에서 샘플을 배양 하 여 prehybridize. 주 2 프로토콜 (단계 7.1)에 재사용 prehybridization 단계에 사용 되는 교 잡 버퍼를 저장 합니다.
   5. 1 µ g/mL의 최종 농도에 교 잡 버퍼에서 RNA 프로브를 diluting 하 여 프로브 교 잡 솔루션을 준비 합니다.  솔루션과 프로브 교 잡에 60 ° C에서 24-잘 바구니 홀더 떨고 물 목욕 (표 2)에서 하룻밤 부드러운 동요와 함께 샘플을 품 어. 하이브리드 솔루션의 증발을 방지 하기 위해 알루미늄 호 일을 가진 석판 바구니 홀더를 들고 접시 커버.

7. 제자리에서 교 잡: 하루 2 (타이밍: 4.5-5.5 h)

1. 프로브 교 잡 솔루션에서 샘플을 제거 하 고 전날에서 예약된 교 잡 버퍼에 그들을 배치. 3 분에 대 한 부드러운 동요와 60 ° C에서 품 어.
   참고: 프로브 솔루션 저장 될 수 있습니다 다시-20 ° C에서 최대 3 번 교 잡.
2. Diluting 20 염 분 나트륨 구 연산 염 버퍼 (SSC) x 2를 준비 DEPC 처리 물 (표 1)에서 x SSC. 샘플 두 번 SSC, x 2와 3 분 후 3 번 2 20 분 동안 씻어 프로브와 교 잡 버퍼의 모든 흔적을 제거 하려면 60 ° C에서 x SSC.
3. RNase A (20 µ g/mL)와 RNase T 치료 단일 제거를 37 ° C에서 30 분 동안 SSC 좌초 RNA 프로브 무료 대표 2 x에서₁ (10 µ g/mL) 비-때 교배 RNA.
4. 2와 함께 한 번 세척 실 온에서 10 분 동안 x SSC. 0.2 준비 diluting 2 x SSC x SSC DEPC 처리 물에 다음 0.2로 두 번 씻어 제거 초과 RNases를 60 ° C에서 30 분 동안 x SSC.
5. 두 번의 maleic 산 버퍼 (MAB; 500 µ L로 씻어 표 1) 10 분 각각에 대 한
6. 차단 솔루션 (2% 차단 시 약에서 MAB) 1.5-2 h와 함께 샘플을 품 어.
   참고: 차단 시 수 분해; 부드러운 난방 해산 에이즈.
7. 안티 digoxigenin 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활용 500 µ L 차단 솔루션 1:3,000 희석에 항 체의와 차단 솔루션을 장착 하 고 약 4 시간 실내 온도에 또는 4 ° C에서 밤새 품 어.

8. 현장에서 교 잡: 3 일 (타이밍: 하룻밤에 6 h)

1. 5 번 이상 각 500 µ L 초과 항 체를 제거 하는 MAB와 30 분 대 한 샘플을 씻으십시오.
   참고: 이러한 세척은 유연 하며 1-2 h, 연장 될 수 있습니다 또는 3-4 세척 효능에 최소한의 영향으로 4 ° C에서 한 하룻밤 세척에 대 한 대체 될 수 있습니다.
2. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 버퍼, pH 9.5 (AP 버퍼; 5 분 동안 두 번 씻어 표 1)입니다.
3. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (자료 테이블)에 대 한 비 기판의 500 µ L를 마지막 세척을 대체 하 여 발 색 반응을 시작 합니다. 알루미늄 호 일 샘플 접시를 커버 하 고 3-5 h 또는 4 ° c.에 하룻밤 실 온에서 진행 하는 얼룩 착 색 반응을 주기적으로 보고 모니터링할 overstaining 피하려고 해 현미경 조직.
   참고: 완료 되는 얼룩, 자주색 색조 antisense 조사 샘플, 현미경에서 눈으로 감지 하지만 매우 어두운 될 조직 수 없다는. 얼룩이 4 ° C에서 매우 느리게 진행 하 고 20-24 h까지 걸릴 수 있습니다.
4. 500 µ L MAB, 5 분 동안 세척 하 여 발 색 반응을 중지 한 후 하룻밤 Bouin의 솔루션에는 조직을 수정.
   주의: 처리 연기 후드; Bouin의 솔루션 그것은 부식성 발암 물질입니다.

9. 현장에서 교 잡: 하루 4 (타이밍: 3-3.5 h)

1. 적어도 7 mL 당 1의 샘플 바구니 준비 diluting 20 x SSC x SSC DEPC 처리 물에. 1에서 4 ~ 6 배 70% 에탄올과 샘플을 세척 하 여 제거 하는 Bouin의 솔루션 x SSC 조직 노란색 이상 될 때까지.
2. 준비 하는 1에서 75%, 50% 및 25% 에탄올 솔루션의 샘플 바구니 당 500 µ L x SSC. 높은 에탄올 농도에서 낮은 조직 rehydrate 하 이동 각 솔루션에 5 분에 대 한 샘플을 씻으십시오. 5 분 동안 두 번 씻어 각에 1 x SSC.
3. 증기 두건에서 라이트 박스에 90 분 동안 표 백제 해결책 (표 1)에서 샘플을 품 어.
   참고:이 단계 샘플 또는 제거할 Bouins 솔루션에서 채색에 어떤 염색을 허용 하 고 명확한 시각화에 대 한 프로브 신호를 향상 시킵니다.
4. 샘플 1의 500 µ L 두 번 씻어 5 분 x SSC.
5. 새로운 24-잘 접시의 우물에 샘플 바구니를 반전 하 여 최소한의 피해와 배 짱을 재배치 하 고 전송 피 펫을 사용 하 여 메쉬 바닥을 통해 70% 에탄올으로 씻어. 필요한 경우에-20 ° C에서 저장 합니다.
6. 그림 3, 와 같이 여러 샘플의 얼룩 패턴에 대 한 개요를 어떤 밝은 분야 현미경으로 24 잘 플레이트 및 보기에 70% 에탄올에 용기를 유지. 그림 4, 그림 5와 같이 개별 내장 밝은 분야 현미경 검사를, 및 그림 6, coverslips에서 100% 글리세롤에 배 짱을 탑재. 플라스틱 주걱을 사용 하 여 부드럽게 조작 하는 최소한의 손상으로 조직.
   참고: 글리세롤의 높은 점도 압축에 의해 조직 손상 으로부터 보호 하 고 있습니다 조직 더 높은 배율에서 최적으로 볼 수 있습니다 그런 diverticula의 주의 위치.
7. 현미경 현미경 특정 이미지 캡처 소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 이미지를 Tiff 이미지는 일반 이미지 편집 소프트웨어를 수출 합니다. 실험적 치료 상대 얼룩 차이 척도를 일반 이미지 분석 소프트웨어 (자료 테이블)를 다운로드 합니다. 분석 소프트웨어 내에서 이미지를 열고 소프트웨어 지침을 사용 하 여 픽셀은 얼룩의 강도 측정 하는 얼룩의 히스토그램 플롯을 계산 합니다.

결과

측정 및 RNA 프로브의 품질의 평가 얼룩이 지기 전에 중요 하다. 생체 외에서 전사 효율 높은 양과 DNA 템플렛의 품질에 따라 달라 집니다. 우리는 정기적으로 RNA 프로브 프로브 녹음 방송 반응에 의해 생성 된의 양과 순도 확인 하는 포름알데히드 젤에 시각. 프로브는 밝은, 개별 밴드 (그림 2)으로 표시 되어야 합니다. RNA 농도의 spectrophotometric 측정 되었고 높은 검색 품질을 나타내는 상관 젤에 악대의 외관을 잘. 따라서, 젤 시각화 단계 프로토콜 친숙 달성 되었습니다 일단 원하는 경우 누락 될 수도 있습니다. 어느 쪽이 든, 모든 다운스트림 단계 시험의 견고성에 따라 높은 품질의 충분 한 RNA 생성 되도록 중요 하다.

이 기술은의 힘은 세균성 종, 틱 피드로 시간...

토론

이것은 병원 체의 arthropod 벡터의 microbiota 공부를 제자리에 전체 산 교 잡 (WMISH) 기술 처음으로 사용. 우리의 프로토콜 개발 개구리 배아^25,26와 초파리 에서 공부 하는 데 사용 하나에서 적응 시켰다. 공간적 유전자 성적표를 지역화 하 전체 산 RNA 제자리에서 교 잡 일상적으로 사용 하 고 밝은 필드 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 일시적으로²⁷ 및 증명서의 시각화 할 수 있습니다. 우리는 틱 용기에 microbiota의 검색으로 전을 채택 했습니다. 그것은 제자리에 전체 산 교 잡 머리 지역 정착 액 및 교 잡 솔루션의 침투 하지 못했습니다 수 있도록 제거 되었습니다 전체 틱을 사용 하 여 수행을 시도 하는 것이 중요. 여기에 설명 된 프로토콜 해 부 용기를 활용 하 고 midgut

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Sefar NITEX 나일론 메시, 110 마이크론	아마존	03-110/47
pGEM-T 이지 벡터 시스템	Promega	A1360
Digoxygenin-11-UTP	Roche	1209256910
dNTP	New England Biolabs	N0447S
DNAse I(RNAse-free)	New England Biolabs	M0303S
HiScribe SP6 RNA 합성 키트	New England Biolabs	E2070S
HiScribe T7 High Yield RNA 합성 키트	New England Biolabs	E2040S
물, RNase-free, DEPC 처리된	American Bioanalytical	AB02128-00500
EDTA, 0.5M, pH 8.0	American Bioanalytical	AB00502-01000
포름알데히드, 37%	JT Baker	2106-01
포름아미드	American Bioanalytical	AB00600-00500
EGTA	Sigma Aldrich	E-4378
DPBS, 10X	Gibco	14300-075
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379-25ML
Proteinase K	Sigma Aldrich	3115879001
Triethanolamine HCl	Sigma Aldrich	T1502-100G
무수아세트산	Sigma Aldrich	320102-100ML
파라포름알데히드	ThermoScientific/Pierce	28906
RNA	Sigma Aldrich	R3629-5G
헤파린, 나트륨	소금 Sigma Aldrich	H3393-10KU
Denhardt's Solution, 50X	Sigma Aldrich	D2532-5ML
CHAPS 수화물	Sigma Aldrich	C3023-1G
RNase A	Sigma Aldrich	10109142001
RNase T1	ThermoScientific	EN0541
말레산	시그마 Aldrich	M0375-100G
차단 시약	Sigma Aldrich	11096176001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments	Sigma Aldrich	11093274910
Levamisol hydrochloride	Sigma Aldrich	31742-250MG
알칼리성 인산가수분해효소 용 발색 기질	Sigma Aldrich
Bouin의 솔루션	Sigma Aldrich	HT10132-1L
과산화수소	Mallinkrodt Baker, Inc	2186-01
단일 가닥 RNA 사다리	Ambion -Millenium	AM7151
#11 고탄소강 블레이드	C and A Scientific Premiere	#11-9411
Thermocycler	BioRad, CA	1851148
분광광도계	ThermoScientific	NanoDrop 2000C
오비탈 쉐이커	VWR	DS-500E 디지털 오비탈 쉐이커
쉐이킹 워터 배스	BELLCO Glass, Inc	핫 쉐이커-7746-12110
젤  문서화 시스템	BioRad	Gel Doc XR+ 젤 문서화 시스템
명시장 현미경	Nikon	NikonSM2745T
명시야 현미경	Zeiss	AXIO Scope.A1
해부 현미경	자이스	STEMI 2000-C
라이트 박스	VWR	102097-658
PCR 정제 키트	Qiagen	28104
이미지 캡처 소프트웨어	Zeiss	Zen lite
이미지 편집 소프트웨어	어도비	Adobe Photoshop CS4 버전 11.0
이미지 분석 소프트웨어	National Institutes of Health	ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
Automation compatible instrumentation	Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).	인타비스, 바이올레인 HT1.16v