방법 논문

제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화

DOI:

10.3791/57758

⸱

2018년 6월 1일

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine, 2Program in Vertebrate Developmental Biology, Departments of Pediatrics and Genetics, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine

이 논문에서

요약

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여기, 우리는 공간 및 일시적으로 틱 용기 수정된 전체 마운트 제자리 교 잡 방법을 사용 하 여 가능한 microbiota의 존재를 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.

초록

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Arthropod 벡터 전송한 전염병 전세계 인간의 건강에 중요 한 위협 계속. 그들은 벡터; 식민지 때 이러한 질병을 일으키는 병원 균 격리에 존재 하지 않는 오히려, 그들은 가능성이 창 자 루멘에 상주 미생물과 상호 작용에 관여. 벡터 microbiota 여러 벡터 품 어진 질병을 위한 병원 체 전송에 중요 한 역할을 증명 되었습니다. 보렐 리아 burgdorferi 를 포함 하 여 여러 가지 인간 병원 체의 벡터 Ixodes scapularis 진드기의 용기에 거주 박테리아 틱 전송 병원 체의 영향 여부는 결정 되지 않습니다. 특성화 틱 용기에 잠재적인 interspecies 상호 작용의 더 나은 이해를 촉진 하기 위하여 틱 용기와 관련 된 박테리아의 구성에 대 한 방법을 요구 합니다. 제자리에 전체-마운트를 사용 하 여 특정 세균 종족과 관련 된 RNA 사본 시각화 하 교 잡 풍부에 관한 질적 데이터의 수집과 microbiota 그대로 조직에의 분포에 대 한 수 있습니다. 이 기술은 틱 먹이의 과정을 통해 본질적인 microbiota 환경에 변화를 검사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 틱 유전자의 표현 분석에 적용 될 수 있습니다. 3 차원 개조를 위한 필요 없이 조직에 대상 RNA의 총 공간 분포에 대 한 수익률 정보를 내장 전체 눈금의 얼룩이 지 고 덜 자주 confounds 시퀀싱 기반 환경 오염에 의해 영향을 자주 복잡 한 미생물 지역 사회를 공부 하는 데 사용 하는 방법. 전반적으로,이 기술은 벡터-병원 체-microbiota 상호 작용 및 질병 전송에 있는 그들의 역할을 이해 하는 더 나은 하는 데 사용할 수 있는 유용한 도구입니다.

서론

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Arthropod 벡터에 의해 전송 하는 인간과 가축 병원 체 전세계 발견 된다1, 하지만 효과적인 세계적으로 전염 성 질환의 약 20% 차지 하 고이 병원 균의 대부분에 대 한 안전한 백신은 사용할 수 없습니다. 공생, 공생 그리고 병원 성 미생물, 미생물2, 변조 및 형성 하는 거의 모든 metazoans3 의 상태에서 통칭의 중요 한 역할에 대 한 우리의 이해를 확대 하고있다. 그것은 이제 분명 병원 체의 arthropod 벡터는 또한 본질적인 microbiota 항구 및 이러한 벡터 관련 microbiota 다양 한 벡터 매개로 병원 균4,5에 영향을 보여왔다. Arthropod 미생물 eubacteria, archaea, 바이러스 및 원생 동물, 선 충, 곰 팡이6등 진 핵 미생물의 구성 됩니다. 그러나, 주된 연구 초점에 왔다 eubacteria 인해, 부분적으로, 마커 유전자와 특정 세균 회원을 식별 하기 위해 참조 데이터베이스의 가용성에.

Ixode....

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프로토콜

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1입니다. DNA 템플렛 준비

  1. 다운로드 16S rRNA 순서 특정 세균 장군 각 하는 NCBI 데이터베이스 디자인과 연쇄 반응 (PCR) 호환에서 앞으로 역 앞에서 설명한 대로 속 특정 영역 (200 ~ 250 기본 쌍 롱)를 증폭 뇌관 19. 또한 리소스를 참조 오픈 소스 데이터베이스 실바20,21 , probeBase22 온라인 rRNA 타겟 oligonucleotide 조사 및 뇌관, RNA 프로브 일부 세균 속에 대 한 상업적으로 있을 수 있습니다 사용할 수 있습니다.
    참고: 특정 특정 속 유전자 영역을 선택 하 여 설계 된 뇌관 관련된 세균 속을 증폭 하지 않습니다 확인 중요 하다. 이것은 교 잡 유전자/장군 전용 프로브를 중요입니다.
  2. 마우스에 24, 48 또는 72 h 틱 용기를 해 부하 고 RNA와 기술된 이전23으로 틱 용기에서 cDNA 준비 진드기 피드. PCR 템플릿으로 사용 cDNA 증폭 속 특정 amplicons thermocycler는을 사용 하 여. 1.5 %agarose 젤에 PCR-제품/amp....

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결과

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측정 및 RNA 프로브의 품질의 평가 얼룩이 지기 전에 중요 하다. 생체 외에서 전사 효율 높은 양과 DNA 템플렛의 품질에 따라 달라 집니다. 우리는 정기적으로 RNA 프로브 프로브 녹음 방송 반응에 의해 생성 된의 양과 순도 확인 하는 포름알데히드 젤에 시각. 프로브는 밝은, 개별 밴드 (그림 2)으로 표시 되어야 합니다. RNA 농도의 spectrophotometric 측정 되었고 높은 검색 품질을 나타내는 상관 젤에 악대의 외관을 잘. 따라서, 젤 시각화 단계 프로토콜 친숙 달성 되었습니다 일단 원하는 경우 누락 될 수도 있습니다. 어느 쪽이 든, 모든 다운스트림 단계 시험의 견고성에 따라 높은 품질의 충분 한 RNA 생성 되도록 중요 하다.

이 기술은의 힘은 세균성 종, 틱 피드로 시간.......

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토론

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이것은 병원 체의 arthropod 벡터의 microbiota 공부를 제자리에 전체 산 교 잡 (WMISH) 기술 처음으로 사용. 우리의 프로토콜 개발 개구리 배아25,26와 초파리 에서 공부 하는 데 사용 하나에서 적응 시켰다. 공간적 유전자 성적표를 지역화 하 전체 산 RNA 제자리에서 교 잡 일상적으로 사용 하 고 밝은 필드 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 일시적으로27 및 증명서의 시각화 할 수 있습니다. 우리는 틱 용기에 microbiota의 검색으로 전을 채택 했습니다. 그것은 제자리에 전체 산 교 잡 머리 지역 정착 액 및 교 잡 솔루션의 침투 하지 못했습니다 수 있도록 제거 되었습니다 전체 틱을 사용 하 여 수행을 시도 하는 것이 중요. 여기에 설명 된 프로토콜 해 부 용기를 활용 하 고 midgut

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공개 사항

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저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

감사의 글

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우리는 진심으 그의 실험실 자원의 사용을 제공 하기 위한 닥터 무스타파 Khokha, 예일 대학, 감사 합니다. 우리는 우수한 기술 지원 씨 밍-지 우에 게 감사입니다. EF는 HHMI 탐정입니다. 이 작품은 존 Monsky와 제니퍼 Weis Monsky 라임 병 연구 기금에서 선물에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Sefar NITEX 나일론 메시, 110 마이크론아마존03-110/47
pGEM-T 이지 벡터 시스템PromegaA1360
Digoxygenin-11-UTPRoche1209256910
dNTPNew England Biolabs N0447S
DNAse I(RNAse-free)New England BiolabsM0303S
HiScribe SP6 RNA 합성 키트New England BiolabsE2070S
HiScribe T7 High Yield RNA 합성 키트New England BiolabsE2040S
물, RNase-free, DEPC 처리된American BioanalyticalAB02128-00500
EDTA, 0.5M, pH 8.0American BioanalyticalAB00502-01000
포름알데히드, 37%JT Baker2106-01
포름아미드American BioanalyticalAB00600-00500
EGTASigma AldrichE-4378
DPBS, 10XGibco14300-075
Tween-20Sigma AldrichP1379-25ML
Proteinase KSigma Aldrich3115879001
Triethanolamine HClSigma AldrichT1502-100G
무수아세트산Sigma Aldrich320102-100ML
파라포름알데히드ThermoScientific/Pierce28906
RNASigma AldrichR3629-5G
헤파린, 나트륨소금 Sigma AldrichH3393-10KU
Denhardt's Solution, 50XSigma AldrichD2532-5ML
CHAPS 수화물Sigma AldrichC3023-1G
RNase ASigma Aldrich10109142001
RNase T1ThermoScientific EN0541
말레산시그마 AldrichM0375-100G
차단 시약Sigma Aldrich11096176001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentsSigma Aldrich11093274910
Levamisol hydrochlorideSigma Aldrich31742-250MG
알칼리성 인산가수분해효소 용 발색 기질Sigma Aldrich
Bouin의 솔루션Sigma AldrichHT10132-1L
과산화수소Mallinkrodt Baker, Inc2186-01
단일 가닥 RNA 사다리Ambion -MilleniumAM7151
 #11 고탄소강 블레이드 C and A Scientific Premiere#11-9411
ThermocyclerBioRad, CA1851148
분광광도계ThermoScientific NanoDrop 2000C
오비탈 쉐이커VWRDS-500E 디지털 오비탈 쉐이커
쉐이킹 워터 배스BELLCO Glass, Inc핫 쉐이커-7746-12110
젤  문서화 시스템BioRadGel Doc XR+ 젤 문서화 시스템
명시장 현미경 NikonNikonSM2745T
명시야 현미경 ZeissAXIO Scope.A1
해부 현미경 자이스STEMI 2000-C
  라이트 박스VWR102097-658
PCR 정제 키트 Qiagen28104
이미지 캡처 소프트웨어ZeissZen lite
이미지 편집 소프트웨어 어도비 Adobe Photoshop CS4 버전 11.0
이미지 분석 소프트웨어National Institutes of HealthImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
Automation compatible instrumentationIntavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). 인타비스, 바이올레인 HT1.16v
SSC, 토룰라 효모 에서 추출한 20X American Bioanalytical AB13156-01000 11442074001

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107(2015).
  2. Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science

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