Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

요약

이 연구 murine 마음 공부 광 청소와 함께 양면 조명 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 기법을 사용 합니다.

초록

빛 시트 형광 현미경 검사 법은 축 고해상도 마이크로미터에서 밀리미터 규모와 빠른 이미지 수집을 위해 널리 사용 되었습니다. 전통적인 빛 시트 기술 샘플 조직에서 기가 감독 단일 조명 광속의 사용을 포함 한다. 단일 조명 광선을 사용 하 여 생성 되는 큰 샘플의 이미지 줄무늬 또는 아티팩트를 포함 하 고는 조직에 의해 빛의 흡수와 산란 감소 해상도에서 고통. 이 연구 양면 조명 광속 및 단순화 된 선명도 광학 기술 murine 마음에 대 한 삭제를 사용 합니다. 이러한 기술은 마음에서 지질을 제거 하 여 깊은 이미징에 대 한 허용 하 고 영상, 10 x 10 x 10 m m³보다 더 큰 분야를 생산. 결과적으로,이 전략을 수 있습니다 계량 실의 크기, 심장 계보를 추적 하 고 심장 특정 단백질 및 충분 한 대비와 성인 쥐 심 혼에는 출생에서 이온 채널의 공간 분포를 지역화 하 고 해상도입니다.

서론

빛-시트 형광 현미경 검사 법 1903 년에 처음 개발 하는 기술 이었고, 유전자 발현을 연구 하 고 조직 샘플^1,2,3또는 4 차원 3 차원 모델을 생성 하는 방법으로 오늘 사용 된다. 이 이미징 방법만 그 비행기는 검출기에 의해 캡처 있도록 샘플의 단일 면을 밝히는 빛의 얇은 시트를 사용 합니다. 샘플 다음 이동할 수 있습니다 축 방향으로 각각 캡처 레이어, 한 번에 하나의 섹션 및 인수 이미지⁴의 후 처리 후 3 차원 모델을 렌더링. 그러나, 흡수 및 산란 광자의 LSFM 되었습니다 샘플 중 몇 미크론 두께 또는 광학 투명¹을 제한.

LSFM의 한계는 제 브라 같은 광학 투명 한 조직 있는 생물의 광범위 한 연구를이 끌고있다. 심장 개발 및 차별화는 종종 연구 zebrafish에 있기 때문에 인간과 zebrafish^5,6보존된 유전자. 이러한 연구는 cardiomyopathies

프로토콜

동물의 사용을 포함 하는 모든 절차는 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스, 캘리포니아에서 기관 검토 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다.

1. 영상 시스템 설치

주: 그림 1 과 그림 2를 참조 하십시오.

1. 3 파장 연속파 (CW) 레이저 검색: 405 nm, 473 nm와 532 nm. 장소 2 거울 (M1 및 M2) 150 mm 떨어져와 45 ° 광속에 그들의 거울 비행기와 그들을 맞춥니다.
   참고:이 단계는 양면 조명 설치에서 레이저를 수행 됩니다. 결과 빔 초기 광속과 같은 방향에 있을 것입니다.
2. 0-광학 밀도 범위는 25 m m 직경 홍 채 격 막/핀 홀 (PH), 직경 50 mm 중립 밀도 필터 (NDF)을 통해 서 광선 통과 4.0, 빔 익 스팬 더 (BE)의 폭 30 mm 슬릿 (S) ~ 0-6 m m, 그리고 거울 (M3) 모두 서로에서 150 m m 위치. 45 ° 광속의 거울 평면 거울을 놓습니다.
3. 150 m m m 3에서 배치 하는 50: 50 빔 스플리터를 통해 광속을 전달 합니다. 거울 (M6) 빔 스플....

결과

설명 하는 기술은 여기 깊은 이미징 깊이 및 충분 한 이미지 해상도 (그림 1) 더 큰 이미징 볼륨 마우스 심장 조직 샘플의 광학 청소와 함께 양면 조명 광선을 사용. 시스템 보정, 형광 구슬 유리 튜브 내부와 이미징 시스템 내에서 배치 했다. 구슬에 몇 군데 했다 그리고 x y 평면, y z 평면, 시각 그리고 포인트를 x-z 평면에서 시스템⁸기능 (PSF)를 확산. 시스템 보정 d_측면 ≈의 측면 방향에서 해결 생산 2.8 µ m 및 d_XZ ≈ 17.4 µ m 및 d_YZ ≈ 17.9 µ m 포함 중간⁸로 글리세롤을 사용 하는 경우의 축 방향에서 해결.

형광 구슬 캘리.......

토론

LSFM 시스템 및 여기에 설명 된 기술 개발의 출생 및 성인 단계에서 이미지 마우스 마음에 광 청소와 함께 양면 조명 광속을 이용 한다. 전통적인 단일 조명 광선은 광자 산란 및 흡수 두꺼운 및 더 큰 조직 샘플^1,3에서 겪고 있다. 양면 보 샘플, 스트라이핑 및 종종 한 면 조명에 의해 생산 하는 이미지에 표시 되는 다른 아티팩트 효과 최소화의 더 심지어 조명을 제공 합니다. 이 기술은 또한 듀얼 가우스 빔⁸의 위치를 조정 하 여 몇 군데 수 샘플의 크기를 증가 시킵니다. 단일 조명 제 브라와 초파리 의 마음 같은 작은 마음에 샘플의 크기를 제한 하는 반면이 광선의 최대 분리 조직 샘플 성인 마우스 마음 처럼 크기가 몇 밀리미터 이미징에 대 한 허용 .

형광 이미징 광학 투명 하지 않은 조직에 더 도전 산란 조직 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CW Laser	Laserglow Technologies	LMM-GBV1-PF3-00300-05	형광단의 여기
중성 밀도 필터	Thorlabs	NDC-50C-4M	시스템에 들어가는 빛의 양 제어
무채색 빔 확장기	Thorlabs	GBE05-A	광선 확장
기계식 슬릿	Thorlabs	VA100C	빔
빔 스플리터	Thorlabs	BS013	형태 이중 조명 빔
1X 대물 렌즈가 있는 실체 현미경	Olympus	MVX10	샘플 관찰에 사용
ORCA-Flash4.0 LT sCMOS 카메라	Hamamatsu Photonics	C11440-42U	이미지 캡처에 사용
아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS),	Stratasys	uPrint	, 샘플 홀더를 3D 프린팅하는 데 사용되는 재료
형광 폴리스티렌 비드	Spherotech Inc	PP-05-10	이미징 시스템 보정에 사용
붕규산 유리 튜브	Corning	Pyrex 7740	샘플 임베딩용 튜빙
글리세롤	Fisher Scientific	BP229-4	샘플 챔버 채우기
인산염 완충 식염수	Fisher Scientific	BP39920	마우스 심장용 헹굼 용액
파라포름알데히드	전자 현미경 과학	RT-15700	첫 번째 배양 용액
아크릴아미드	Wako Chemicals	AAL-107	마우스 심장용 두 번째 배양 용액을 위해 2,2'-Azobis dihydrochloride와 혼합
2,2'-Azobis dihydrochloride	Wako Chemicals	VA-044	마우스 심장
용 두 번째 배양 용액을 위해 아크릴아미드와 혼합소듐 도데실 설페이트	Sigma Aldrich	71725	마우스 심장용 3차 배양 용액을 위해 붕
Boric acid	Fischer Scientific	A74-1	마우스 심장용 3차 배양 용액을 위해 도데실황산나트륨과 혼합
Sigma D2158	Sigma Aldrich	D2158	굴절률 정합 용액으로 PB, Tween-20 및 아지드화나트륨과 혼합
Tween-20	Sigma Aldrich	11332465001	굴절률 정합 용액으로 Sigma D2158, PB 및 Sodium azide와 혼합
azide	Sigma Aldrich	S2002	굴절률 정합 용액으로 Sigma D2158, PB 및 Tween-20과 혼합
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