깨어 있는 쥐에 유리 Optrode 신경 형식의 Optogenetics 식별

요약

이 작품은 optogenetic 단일-단위 맞춤 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 안정적으로 녹화를 수행 하는 방법을 소개 합니다.

초록

그것은 어떻게 다른 신경 과학에서 중요 한 관심사 종류 뉴런의 신경 회로에서 작동. Optogenetics의 최근 발전은 광범위 한 뇌 영역에 vivo에서 electrophysiological 실험에서 신경 유형 식별을 활성화 했습니다. Optogenetics 실험, 그것이 기록 사이트에 빛을 전달 하기 위해 중요 합니다. 그러나, 그것은 종종 뇌의 표면에서 깊은 두뇌 영역을 자극 빛을 제공 어렵다입니다. 특히, 그것은 종종 깨어 있는 동물에서 녹음의 경우 뇌 표면의 광 투명성은 낮은, 깊은 두뇌 지역 도달 자극 빛 어렵습니다. 여기, 우리는 주문 품 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 빛을 스파이크 응답 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법에서는, 빛은 안정적으로 깊은 두뇌 지구에서 빛으로 기록 된 신경 자극 수 있도록 녹음 유리 전극을 통해 배달 됩니다. 이 주문 품 optrode 시스템 접근 가능 하 고 저렴 한 재료를 이루어져 있고 조립 하기 쉽습니다.

서론

다양 한 종류의 다른 기능을 하는 신경 중추에 의하여 이루어져 있다. 이러한 서로 다른 유형의 신경 신경 회로 내에서 작동 하는 어떻게 신경 과학에서 중요 한 관심사 중 하나입니다. 그러나, 많은 두뇌 지구에서 그것은 되었습니다 하지 몇 가지 예외와 함께 전기 스파이크 신호 자체에 분명 차이가 있기 때문에 전기 활동의 비보에 녹음에 신경 종류를 구별 하는 것. Optogenetics의 최근 발전 돌파구^1,2를 만들었습니다. 빛에 민감한 opsin (예를 들어, channelrhodopsin-2) 특정 신경 종류에 표현 하는 유전자 변형 동물을 사용 하 여, 그것은 되었다 vivo에서 녹음^3, 에서 효율적으로 신경 종류를 구별할 수 ^4,,56. 이 동물에 빛에 민감한 opsin와 뉴런 전기 녹음 하는 동안 가벼운 자극을 제공 하 여 흥분 하지만 다른 신경 있습니다. Opsin 양성 신경, 따라서 쉽게 구별 된다 다른 신경 종류에서 빛에 대 한 답변으로.

Optogenetics 실험, 그것이 기록 사이트에 빛을 전달 하기 위해 중요 합니다. 비-침략 적 방법으로 빛은 종종 뇌의 표면에서 감독. 그러나, 빛의 강도 감소 뇌 조직 속으로, 때문에 두뇌의 표면에서 깊은 두뇌 지구를 자극 하기 어렵다. 특히, 그것은 종종 깨어 있는 동물에서 녹음의 경우 뇌 표면의 광 투명성은 낮은, 깊은 두뇌 지역 도달 자극 빛 어렵습니다. 마 취 동물에 electrophysiological 실험 자주 수행 되었습니다 몸 움직임 녹음에 잡음을 발생 하기 때문에. 그러나 잘 설명 된 대로, 마 취 신경 응답^7,8,,910변경으로 알려져 있다. 따라서, 그것은 깨어 있는 동물을 사용 하 여 마 취의 인공 효과 없이 신경 응답을 공부 하기 위하여 필요가 있다. 마 취 동물 실험, 달리 electrophysiological 녹음 깨어 동물 실험에서 수술에서 회복 후 수행 됩니다. 수술과 기록 사이 간격 동안 조직 exudate 자주 뇌 표면에 축적 하 고 낮은 뇌 표면의 광 투명성을 만든다.

여기, 우리는 주문 품 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 단일 단위 기록 기록 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법에서는, 빛은 안정적으로 깊은 두뇌 지구에서 빛으로 기록 된 신경 자극 수 있도록 녹음 유리 전극을 통해 배달 됩니다. 이 주문 품 optrode 시스템 접근 가능 하 고 저렴 한 재료를 이루어져 있고 조립 하기 쉽습니다.

프로토콜

모든 절차는 동물 관리 위원회의 가나자와 의과대학의 승인와 일본의 생리 사회의 원칙에 따라 수행 됩니다.

1입니다. 건설 유리 Optrode 홀더

참고: 유리 optrode 홀더를 구축 하는 상업 전극 홀더 사용 됩니다 (그림 1A).

1. 부드럽게 소유자의 배럴에서 압력 제어를 위해 스틸 튜브 밖으로 당겨.
2. 드릴링에 의해 소유자의 배럴에서 핀 좌석 쪽의 구멍을 확대. 깊이 3 m m 직경에서 그리고 12mm 구멍을 확인 합니다.
3. 스테인리스 강 관 (직경에서 3 m m, 두께, 0.5 m m 그리고 길이; 8 m m를 넣어 그림 1A 2) 구멍에.
4. 구멍에 ⌀2.5 m m 깃 봉 (그림 1A1)에 대 한 짝짓기 소매를 분할 하는 세라믹을 삽입 합니다.
5. 에폭시 접착제는 L 자 모양의 사 개에 전극 홀더의 배럴을 수정 합니다.
6. 사 개에 구멍 (직경에서 3 m m)를 확인 하 고 나사와 조작에 첨부.

2. 머리 포스트 설치

1. 회로 보드 스페이서의 만든 맞춤식 머리 게시물을 준비. 열 회로 보드 스페이서 밀링 커터 cuboidal 모양으로 만들고 (그림 1B) 톱으로 2 머리 게시물에 그것을 잘라. 밀링 커터 헤드 게시물의 하단에 평평 하 게.
2. 빛에 민감한 opsin 연구에 대 한 특정 뉴런 형식에 표현 하는 유전자 변형 동물을 준비 합니다. 이 작품에는 억제 신경 channelrhodopsin-2 (ChR2)¹¹ 을 표현 하는 유전자 변형 마우스 (VGAT-ChR2 마우스) 사용 됩니다.
3. 복 관리에 의해 medetomidine의 0.3 mg/kg, 4.0 mg/kg, midazolam의 및 butorphanol의 5.0 mg/kg의 혼합물으로 동물을 anesthetize. 동물 마 취 완벽 하 게 확인, 곤란 꼬리의 반응을 테스트 합니다.
4. 생리대에 stereotaxic 프레임에 마우스를 놓습니다. 청소 stereotaxic 프레임 및 난방 패드 70% 알코올로 미리. 치아를 물린 바의 구멍에 놓고 가볍게 코 클램프를 조여. 귀 막대를 사용 하 여 머리의 양쪽 모두를 수정 합니다. 머리 귀 막대로 고정 올바르게 때 코 클램프를 조입니다. 눈에 눈 연 고를 적용 합니다.
5. 작은 위로 머리 피부를 면도 하 고 액체 글 루 콘 산의 면봉으로 두 피를 청소. 수술 하기 전에 수술 도구와 머리 압력솥 (121 ° C, 15 분)와 게시 모든 소독 합니다.
6. 두 피 중간 선 따라가 위로 잘라 고 옆으로 밀어. 눈 (약 20 m m)를 머리 뒤쪽에서 절 개를 확인 합니다. 70% 알코올에 담근 면봉으로 여과 제거 하 고 건조 한 두개골.
7. 조작자를 머리 게시물을 연결 합니다. 머리 게시물 두개골 bregma 조작자를 사용 하 여 주위에 배치 합니다.
8. 단위체 (4 정), 촉매 (1 방울), 및 냉장고에 미리 냉장은 작은 접시에 치과 시멘트의 폴리머 (1 작은 스푼) 섞는다. 정면에 해골 머리 게시물 수정 두개골의 정수 리 뼈 (1 g) 아래 치과 시멘트를 넣어.
9. 치과 시멘트 하드 후, stereotaxic 프레임에서 마우스를 제거 합니다. 노출 된 피부에 항생제 연 고를 넣어. Medetomidine 길 항 제 (0.3 mg/kg)과 항생제 (oxytetracycline; 20 mg/kg) 주사. 깨우 고, 주택 케이지를 반환 때까지 장소와 모니터에 마우스에에서 패드.
10. 하우스 몇 가지 농축 장치 개별 주택 장에 동물. 케이지를 청결 한 유지 하 고 감염을 방지 하기 위해 매일 침구 동물 종이 변경 합니다. 신중 하 게 모니터링 동물 표시 불편의 어떤 표시 든 지. 상처에 적용 lidocaine 통증이 의심 되는 경우. 관리 meloxicam 또는 carprofen 두 머리 포스트 설치 및 craniotomy 수술 후 48 h 한 번 모든 24 h. 로컬 lidocaine 주어질 수 있다 또한 경우에 NSAID 적합 하지 않습니다.

3입니다. 새 환경 순응

1. 2 일 (최소), 마 취에서 회복 후 녹음 실에서 머리 고정 상태로 동물 적응. 적어도 5 일 동안 새 환경 순응 세션을 수행 합니다.
2. 새 환경 순응 세션 동안 사용자 클램프에 고정 머리 게시물 사용 녹음 실에서 동물을 놓습니다. 움직임을 제한 하기 위하여 세션 동안 커버 맞춤 수 지 반 튜브 (그림 1C), 시체 3 차원 프린터를 사용 하 여 만든.
   참고: 1 일, 새 환경 순응 세션 5 분 긴를 이어야 한다. 그것은 다음 증가 매일 10, 20, 40, 및 60 분 동안 2, 3, 4, 및 5, 각각.
3. 각 세션의 끝에, 동물을 음식 보상을 제공 합니다. 동물에 새 환경 순응 기간 동안 지속적으로 투쟁을 하는 경우는 세션을 중지 합니다.

4입니다. craniotomy

참고: 새 환경 순응, 후 한 craniotomy가 이루어집니다 녹음에 대 한 뇌 영역을 통해. craniotomy 마 취, 머리로 설치 게시물 stereotaxic 프레임에서 수행 됩니다. 사후 작업 절차는 머리 게시물 설치는 동일 합니다.

1. Craniotomy, 하기 전에 액체 글 루 콘 산 및 70% 알코올 면봉으로 두개골을 청소.
2. 조심 스럽게 치과 함께 녹음 사이트를 통해 두개골을 다쳤어요. 뼈를 충분히 얇은 되 면 메스의 팁으로 넘어가지 고 그것을 제거 합니다.
3. 두개골을 강화 노출 지역의 치과 시멘트를 넣어.
4. 치과 시멘트 하드 후 실리콘 접착제로 노출 된 뇌 영역을 커버. 수술 후 절차는 2.8 단계에서 설명한 대로.

5. electrophysiological 기록

1. 동물 electrophysiological 녹화를 수행 하기 전에 craniotomy 후 최소 1 일에 대 한 복구를 허용 합니다. 같은 방법으로 그것을 녹음 시작 될 때 새 환경 순응 세션 동안 한 녹음 실에서 동물을 놓습니다.
2. 붕 규 산 유리 모 세관에서 유리 펫 만들기 (OD = 1.5 m m, ID = 0.9 m m, 길이 90.0 m m) 전극 끌어당기는 사람에. 그들의 팁 직경은 2-3 µ m 이다, 그리고 그들의 저항에서 4-6 m ω가 때 그들은 10mm PBS로 가득. 전극의 길이 40-50 m m입니다. 일부 녹음에 2% neurobiotin 10 m m PBS에 추가 됩니다.
3. 주문 품 optrode 홀더를 채워진된 유리 피 펫을 연결 합니다.
4. 유리 피 펫에 Ag Cl 코팅 실버 와이어 (직경에서 0.2 m m)를 넣어. 실버 와이어를 핀을 통해 얇은 코팅된 전기 와이어를 연결 합니다. 녹음 앰프의 headstage에 핀을 연결 합니다.
5. 광섬유 패치 코드를 연결 (코어 = 960 µ m, 클 래 딩 1000 µ m, NA = = 0.63) 지 르 코니 아 깃 봉을 가진 (OD = 2.5 m m) optrode 홀더에 소매 짝짓기 분할. 아무의 팁 연락처 유리 피 펫의 뒷면까지 소매에 패치 코드를 밀어. 패치 코드 제공 빛 (파장 = 465 nm) LED에서. LED 빛은 단일 채널 LED 드라이버에 의해 제어 됩니다.
6. craniotomy 통해 실리콘 접착제를 제거 합니다. 넣어 예 열된 염 분 (38 ° C) 기록 세션 동안 건조에서 뇌 표면 방지 하기 위해 주기적으로 뇌 표면에. 필요한 경우 날카로운 핀셋으로 경질을 제거 합니다.
7. 유리 전극 조작자와 뇌 조직에 삽입 합니다. 이 삽입 될 때 전극 저항을 모니터링 합니다. 저항 되는 전극의 팁 손상 될 수 있습니다 때문에 예상 보다 낮은 전극을 교체 합니다. 관심의 깊이에서 검색 하 고 2 ~ 5 µ m 단계에 깊이 조정 하 여 단일 단위 스파이크를 분리 합니다.
8. 단일 단위 격리 된 후에, LED 빛을 전달 하 고 빛 자극에 응답을 관찰.
9. 세포 유형의 식별 후 신경 활동을 기록 합니다. 2-3 h에 대 한 녹음을 수행 합니다. 녹음에서 만든 연속 일 (최대 2 일의), 경우 실리콘 접착제 craniotomy 커버. 녹음을 완료 하 고 동물 희생, 머리 게시물을 검색 하 고 세척 하 고 그것을 다시 아세톤에 넣어.

결과

그림 2, 우리는 팁 크기의 효과 유리 펫 펫 (그림 2A-B)의 끝에 빛 파워에의 길이 검사합니다. 가벼운 힘 1 m m 팁에서 배치 하는 광 파워 미터에 의해 측정 되었다. 팁 크기 전체 길이 변화 때 2.5 µ m 팁 크기 설정 하는 동안, 변화 하는 때 전체 길이 50 ± 2 mm로 설정 되었습니다. 유리 피 펫의 샹 크 8 m m로 설정 되었습니다. 3-5 mW (평균 ± SD;에서 배열 하는 끝에 가벼운 힘 그림 2A: 3.77 ± 0.29 mW, n = 20; 그림 2B: 4.24 ± 0.31 mW, n = 21). 펫의 팁 크기 (그림 2A

토론

Optogenetics 신경 과학에 강력한 도구가 되고있다. 그것은 특정 신경 통로의 활동을 조작 뿐만 아니라 특정 신경 형식에서을 식별 비보에 이용 되었습니다. 신경 종류의 신경 활동의 명확한 신경 회로의 메커니즘의 이해를 촉진합니다. 여기, 우리는 깨어 VGAT ChR2 쥐의 IC에 유리 전극을 통해 녹음 사이트에 빛을 전달 하는 방법을 설명 했다.

설명 하는 방법을 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 그것은 동물 대상 신경에 있는 opsins의 충분 한 및 특정 식을 사용 하 여 요구입니다. Extracellular 녹음과 빛에 대 한 응답을 식별 하는 opsin 활성화 대상 신경에서 스파이크 끝이 필요 하다. 일부 유전자 변형 종자에 신경에 있는 transgene 식 수준 낮은 젊은 동물¹⁴, 그리고 실험에 대 한 최소 연령은 있을 가능 하다. 또한, 그것은 빛 자극에 응답 (예를 들어, imm...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
전극 홀더	분자 장치	1-HL-U	마이크로 전극 증폭기 용 피펫 홀더
세라믹 분할 결합 슬리브	Thorlabs	ADAF1	f2.5 mm 페룰
회로 기판 스페이서	Teishin Denki	SPA-320	f8.0 mm, 20.0 mm 길이
마우스 용 입체 프레임	Narishige	SR-6M-HT	마우스
용 입체 운동 기기매니퓰레이터	Narishige	NA	수동 매니퓰레이터
Superbond	Sun Medical	M: 204610557	치과용 접착제 수지 시멘트
Form2	Formlabs	NA	3D 프린터
Kwik-Sil	WPI	KWIK-SIL	저독성 실리콘 접착제
붕규산 유리 모세관	Narishige	GD-1.5	OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 길이 90.0 mm
광섬유 패치 코드	Doric 렌즈	MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5	단섬유 패치코드, OD, 2.5mm, 코어 = 960mm, 클래딩 = 1000mm, NA = 0.63
연결 LED	Doric 렌즈	LEDC-1B_FC	중심파 길이 = 465nm, 출력 전력 = 45mW(코어 960mm 0.63NA)
LED 드라이버	Doric 렌즈	LEDRV_1CH_1000	1채널 LED 드라이버, 최대 출력 = 1000mA
전극 풀러	Narishige	PB-7	2단 유리 마이크로피펫 풀러
붕규산 유리 모세관	Narishige	GD-1.5	볼로실리케이트 유리 모세관, OD, 1.5mm, ID, 0.9mm, 90.0mm 길이
GENTACIN	MSD CO., LTD	185711173	항생제 연고
Terramycin®-LA	Zoetis	G 333	Oxytetracycline
Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J	Jackson Labs	#14548	VGAT-ChR2 마우스
멀티클램프 700B	분자 장치	2500-0157	미세 전극 증폭기