여기, 우리 유도 대 한 프로토콜의 시리즈 및 경작된 한 세포에 세포 노화의 유효성 검사를 설명합니다. 우리는 다른 노화 유도 자극에 집중 하 고 일반적인 노화 관련 마커의 정량화를 설명. 우리 모델, 섬유 아 세포를 사용 하 여 기술 정보를 제공 하지만 프로토콜은 다양 한 휴대 전화 모델에 적용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포 노화의 영구 세포 주기 검거 다른 손상 자극에 반응에서 활성화 상태입니다. 세포 노화의 활성화는 다양 한 병 태 생리 조건 종양 억제, 조직 리 모델링 및 노화 등의 특징입니다. Vivo에서 세포 노화의 inducers는 아직도 가난 하 게 특징 이다. 그러나, 자극의 수 ex vivo세포 노화 촉진 사용할 수 있습니다. 그 중 가장 일반적인 노화-inducers 일차 피로, 이온화 및 비 이온화 방사선, 차적인 약물, 산화 스트레스, 그리고 demethylating와 acetylating 대리인 있습니다. 여기, 우리가 노화에 섬유 아 세포를 유도 하는 것이 자극을 사용 하는 방법에 자세한 지침을 제공 합니다. 이 프로토콜은 쉽게 1 차 셀 및 셀 라인, 암 세포를 포함 하 여 다른 유형의 적용할 수 있습니다. 우리는 또한 노화 유도의 유효성 검사를 위해 다른 방법을 설명합니다. 특히, 우리는 lysosomal 효소 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-gal), 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (듀) 합동 분석 결과, 세포 주기 식의 레벨을 사용 하 여 DNA 합성의 속도의 활동을 측정에 초점 억제제 p16, p21, 식 그리고의 Senescence-Associated 분 비 형 (SASP)의 분 비. 마지막으로, 우리 예제에서는 결과 제공 하 고 이러한 프로토콜의 응용 프로그램을 추가 논의.
서론
1961 년, Hayflick와 무어 헤드 문화에 기본 fibroblasts 연속 구절1후 그들의 증식 잠재력을 잃고 보고. 이 프로세스는 각 세포 분열 후 telomeres의 순차 단축에 의해 발생 합니다. Telomeres 비판적으로 짧은 길이 도달, 그들은 활성화 확산의 돌이킬 수 없는 체포 하는 DNA 손상 응답 (DDR)에 의해 인식 됩니다-또한 일차 노 쇠로 정의. 일차 노화 현재 구분 mitogens와 apoptotic 신호2,3셀을 렌더링 하는 영구 세포 주기 검거의 상태를 유도 하는 것으로 알려져 있습니다 많은 자극 중 하나입니다. 노화 프로그램은 일반적으로 높은 lysosomal 활동, 미토 콘 드 리아 기능 장애, 핵 변화, chromatin 재배열, 바인딩과 그물 스트레스, DNA 손상 및 노화 관련을 포함 하 여 추가 기능 특징 분 비 형 (SASP)3,4. 노화 세포는 신체에 여러 기능을가지고: 개발, 상처 치유 및 종양 억제2. 똑같이, 그들은 노화와, 역설적으로, 종양 진....
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프로토콜
1. 일반 준비
- D 10 매체를 준비 합니다. DMEM 매체-Glutamax 10 %FBS 1% 페니실린/스와 보충 (최종 농도: 100 U/mL).
- 살 균 PBS를 준비 합니다. 제조업체의 지침에 따라 물에 정제 분해. 압력솥에 의해 소독.
- 1 x 트립 신을 준비 합니다. 트립 신-Versene EDTA/10의 5 mL를 희석 1:10 살 균 PBS의 45 mL에 x.
참고: 프로토콜을 통해 우리가 사용 하 여 가까이 있는 셀 문화 조건에 생리 적인 기본 fibroblasts에 대 한 조건. 이 의미는 우리가 품 어 37 ° C, 5% CO2 셀 5% O2 "표준" 20 %O 일반적으로 수행 하지만 사용은2. - 층 류 흐름 후드, 실험실 코트와 장갑을 사용 하 여 메 마른 조건에서 모든 샘플을 처리 합니다. 처리 되는 동안에 20% O2 (룸 조건)에서 세포를 유지.
2입니다. 노화의 유도
- 일차 노화
- 셀 또는 그들과 접촉 될 모든 자료를 처리 하는 동안 (pipets, 플라스 크, 미디....
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결과
SA-β-gal 노화 섬유 아 세포에서 얼룩의 농축
Β-galactosidase (β-gal)는 모든 세포에 표현 되 고 4.025,26의 최적 pH는 lysosomal 효소 이다. 그러나, 노화, 동안 리소좀 크기가 증가 하 고, 따라서, 노화 세포 축적 β-gal. 이 효소의 증가 금액 차선 pH 6.025,27에서도 그 활동 감지를 가능 하 게. 그림 1A 대 노화 기본 섬유 아 세포 확산에 SA-β-gal 얼룩의 대표 이미지를 보여줍니다. 세포는 또한 확대 하 고 불규칙 한 셀 시체와 함께 보세요. 앞.......
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토론
여기 설명 하는 프로토콜은 인간의 기본 섬유 아 세포, 최적화 된 특히 BJ와 WI-38 셀. 일차 노화, 전리 방사선, 독 소 루비에 대 한 프로토콜을 성공적으로 다른 세포 유형 즉 신생아 melanocytes와 keratinocytes (iPSC 파생 cardiomyocytes)과 섬유 아 세포 (HCA2 및 IMR90)의 다른 종류에 적용 우리의 실험실. 그러나, 몇 가지 세부 사항을 시드 셀, 방법 및 플라스틱 지원에 연결/분리에 대 한 셀 수 있도록 화학 물질의 수 등의 독성을 피하기 위해 치료 복용량을 조정 하 여 추가 셀 형식에 대 한 적응을 최적화할 수 있습니다.
기본 섬유 아 세포의 사용에도 다양 한 도전 포즈. 노화 세포는 일반적으로 더 어려운 proliferating 들 보다 분리 하 고 그들은 종종 trypsinization에 더 민감한 또는 분리 메서드를 분리 후 생존의 것 보다 약간 낮은 의미의 다른 종류 확산 셀입니다. 다른 노화 유도 하는 방법에 대 .......
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감사의 글
우리는 유익한 토론에 대 한 관리자 실험실 및 데이터와 UV-유도 노화에 프로토콜을 공유 하기 위한 Thijmen 밴 Vliet의 회원을 감사 합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM 매체 - GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| 소 태아 혈청 | 하이클론 | SV30160.03 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 (P/s; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
| 디메틸 설폭사이드 (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| 뉴클레아제 무함유 정제수(DEPC 처리되지 않음) | Ambion | AM9937 | |
| T75 플라스크 | Sarstedt | 833911002 | |
| Trypsin/EDTA 솔루션 | Lonza | CC-5012 | |
| PBS 정제 | Gibco | 18912-014 | |
| 1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브 | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning 15mL 원심분리기 튜브 | : Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6웰 플레이트 | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24웰 플레이트 | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13mm 원형 커버슬립, | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cesium137-source | , IBL 637, Cesium-137γ-ray machine | ||
| UV 방사선 챔버 | Opsytec, Dr. Gö bel BS-02 | ||
| 독소루비신 디하이드로클로라이드 | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| 과산화수소 용액 | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2'-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| 나트륨 부티레이트 | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| 시트르산 일수화물 | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| 나트륨 이염기성 인산 | 염 Acros 유기물 | 7782-85-6 | |
| 칼륨 페로시아나이드 | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| 페리시안화칼 | 륨 Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| 염화나트륨 | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| 염화마그네슘 | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% 글루타르알데히드 | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% 포름알데히드(w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU(5-에티닐-2'-데옥시우리딘) | 루미프로브 | 10540 | |
| 설포-시아닌3 아지드(설포-Cy3-아지드) | 루미프로브 | D1330 | |
| 아스코르브산나트륨 | 시그마-알드리치 | A4034 | |
| 구리(II) 황산염 5수화물(Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros 유기물 | 215682500 | |
| TRIS 기반 | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, 화이트 | Roche | 4729749001 | |
| Lightcycler 480 밀봉 호일 | Roche | 4729757001 | |
| Sensifast 프로브 Lo-ROX 키트 | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL 프로브 라이브러리 | Sigma-Aldrich | 다양한 | |
| 인간 IL-6 DuoSet ELISA | R& D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| 카운팅 슬라이드 | Bio-Rad | 145-0017 | |
| 건식 인큐베이터 | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' 실험실 필름 | Bemis | ||
| 핀셋 | |||
| 바늘 |
참고문헌
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J.
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재인쇄 및 허가
