여기 우리가 전체 마우스 배아 초기에 β-galactosidase 활동의 검출을 위한 표준 프로토콜 및 파라핀 단면화 및 counterstaining에 대 한 방법을 설명 합니다. 이것은 개발 조직 단면도에 또한 적용 될 수 있는 유전자 발현을 모니터링 하는 간단 하 고 빠른 절차 기관 또는 배양된 세포.
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방법 논문
전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활동의 감지를 통해 유전자 발현 추적
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Β-galactosidase, 인코딩 대장균 LacZ 유전자, 유전자 발현에 대 한 기자로 서 고 세포 계보 연구에서 추적 프로그램으로 크게 사용 된다. 클래식 조직화 학적인 반응은 쉽게 시각화 하는 불용 성 푸른 침전을 생성 하 고 철 제 2 철 이온, 함께에서 기판 X gal의 가수분해를 기반으로 합니다. 따라서, β-galactosidase 활동은 관심사의 유전자의 표현 패턴에 대 한 표식으로 개발 진행 있습니다. 여기 우리가 전체 마우스 배아 초기에 β-galactosidase 활동의 검출을 위한 표준 프로토콜 및 파라핀 단면화 및 counterstaining에 대 한 후속 방법 설명. 또한, 전체 배아를 명확히 하는 절차는 더 나은 X-여자 태아의 더 깊은 영역에 얼룩을 시각화 하 제공 됩니다. 반응 조건의 최적화 백그라운드 작업을 최소화 하는 데 필요한 있지만 일관 된 결과이 절차를 수행 하 여 얻을 수 있습니다. 분석 결과에 한계 고려 되어야 한다 또한, 특히 전체 마운트 얼룩에서 태아의 크기에 관한. 우리의 프로토콜 민감하고 cryostat 섹션 뿐만 아니라 모든 장기에 더 적용할 수 있는 마우스 개발 중 β-galactosidase 탐지에 대 한 신뢰할 수 있는 메서드를 제공 합니다. 따라서, 개발에 걸쳐 동적 유전자 표현 패턴 전체 태아에서이 프로토콜을 사용 하 여 쉽게 분석 될 수 있다 그러나 또한 세포 수준에서 상세한 식 파라핀 단면 후 평가 될 수 있다.
서론
특정 유전자 표현 패턴을 설명 하기 위해 기자 유전자 마커로 사용 초파리 에서 포유동물에 최고 되었습니다. 유전자 변형 및 녹아웃 동물 관련 된 실험, 대장균 (대장균)의 세균 β-galactosidase 유전자 (LacZ) 가장 널리 사용 되는1,2,3, 중 하나입니다. 4. β-galactosidase (β-gal)의 단 (포도 당 그리고 갈 락 토스)5에 β-galactosides (유 당) 등의 가수분해를 catalyzes. 가장 일반적으로 사용 되는 기판은 X-여자 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), β-galactosidase 주는 상승 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole 그리고 갈 락 토스로 분해 glycoside 했다. 첫 번째는 이합체에 산화, 사용 하는 경우 칼륨 ferri 결합-및 페로 시안 화물 생산 특성 불용 성, 파란색 침전 (
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프로토콜
모든 실험 절차는 최소한의 동물의 고통을 CNIC (센트로 나시오날 드 Investigaciones Cardiovasculares)과 지방의 Autónoma 드 마드리드의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. (E12.5에 E8.5)에서 임신 쥐에서 배아의 수집
- 자 궁 경관 탈 구 또는 CO2 흡입에 의해 임신 쥐를 희생. 첫 번째의 하루 질 플러그 배아 여겨졌다 관찰 하루 0.5 (E0.5).
- 흡수 성 패드에 부정사 위치에 동물을 70% 에탄올과 마우스의 복 부 피부를 청소.
참고: 무 균 다음 단계에는 필요 하지 않습니다. - 꼬 집 고 마우스 이빨 집게를 사용 하 여 복 부 피부.
- 피부와 복 부 벽, 수술가 위를 사용 하 여 복 부의 중간에 걸쳐 수직으로 2 ~ 4 cm을 통해 절 개를 확인 합니다.
- 복 부를 노출 하 고 수술가 위는 자 궁의 안쪽 곡률에 따라 혈관 절단 집게 어머니 로부터 자 궁 뿔 제거.
- 배아의 문자열을 제거 하 고 10 mL 차가운 0.01 M 인산 염 버퍼 염 분 pH 7.4 (PBS)를 포함 하는 얼음의 페 트리 접시 전송.
- 신중 하 게 10 mL 신선한 ....
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결과
여기 우리는 X-gal을 사용 하 여 전체 마우스 배아 (그림 1 및 그림 2)에서 기판으로 β-galactosidase 조직화 학적인 반응에 대 한 표준 프로토콜을 적용 결과 보여줍니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 우리는 서로 다른 배아 발달 단계 (E9.5, E11.5, 및 E12.5)에 막 유형 4 매트릭스 metalloproteinase (Mt4-mmp) 식 검사 LacZ 기자는 내 생의 통제를 표현 하는 Mt4 mmp 돌연변이 마우스를 사용 하 여 Mt4 mmp 발기인 (그림 3, 그림 4및 그림 5)9,.......
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토론
대장균 LacZ 유전자 널리 사용 되었습니다 유전자 표현 패턴의 연구에 기자로 서의 높은 감도 및 검출의 용이성. 현재 프로토콜은 간단 하 고 저렴 한 뿐만 아니라 수행 하는 효소 반응에 따라 β-gal 식 탐지 하기 위한 고전적인 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 또한 전체 마운트 배아, 그대로 장기, cryostat 조직 섹션 또는 배양된 세포에서 중요 수정 없이 적용할 수 있습니다.
이 방법의 정확한 응용 프로그램 강력 하 고 해석할 얼룩이 발생합니다. 그러나, 동시 컨트롤 및 후속 확정 단계는 좋습니다. 이와 관련, 현재 프로토콜 일반적인 X-여자 얼룩 모니터링을 제공 하는 부정적인 컨트롤으로 사용 하는 야생 타입 littermate 배아에서 병렬로 수행 됩니다. 또한, 식 데이터 때 서쪽 오 점 그리고 양이 많은 PCR (Q-PCR)에 의해 확인 된다 β-gal 얼룩을 사용 하 여 얻은 분석 또는 β-gal에 의하여 immunohistochemistry .......
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공개 사항
저자 들은 경쟁 금융 관심 선언 합니다.
감사의 글
우리는 그들의 기술 지원에 대 한 Histopathological 서비스 센트 나시오날 드 Investigaciones Cardiovasculares (CNIC)에 감사 하 고 싶습니다. 지원 우리의 프로젝트 및 원고 그녀의 중요 한 독서에 대 한 우리는 또한 친절 하 게 제공 Mt4 mmpLacZ 마우스, 박사 전 部와 박사 엘리샤 G. 아로요를 감사. 피터 Bonney이이 문서를 교정 하는 것을 감사 하 길. 이 이는 그랜트 (# 2017UEM01) C.S.C.에 게 수 여에 의하여 대학 Europea 마드리드에 의해 지원 되었다
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재료
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| 수성 마운팅 매체 | VECTOR LABS | H-5501 | |
| 합성 마운팅 미디어 | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | ||
| 99.9% 에탄올 절대 | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% 글루타르알데히드 용액 | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% 글리세롤 | MERCK | 104094 | |
| 99.9% 글리세롤 | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| 염화마그네슘 육수화물 | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| 비이온성 계면활성제(Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| 고속 적색 대조염색 | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| 파라핀 파스틸, | MERCK | 111609 | |
| 파라포름알데히드 | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| 인산염 완충 식염수(정제) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| 페로시아 | 칼륨 MERCK | 1049840500 | |
| 페로시아나이드 칼 | MERCK | 1049731000 | |
| 아지드화 나트륨 | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| 데옥시콜레이트 | 나트륨 SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| 인산이수소나트륨 일수화물 | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| 인산나트륨 이염기성 이수화물 | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| 트리스 하이드로 클로라이드 (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
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| 광섬유 | Optech | PL2000 |
참고문헌
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J.
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재인쇄 및 허가
