Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과

Sabyasachi Dash; Muthukumar Balasubramaniam; Chandravanu Dash; Jui Pandhare

doi:10.3791/57786

방법 논문

Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과

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DOI:

10.3791/57786

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2018년 6월 12일

Sabyasachi Dash¹^,²^,³ , Muthukumar Balasubramaniam² , Chandravanu Dash² , Jui Pandhare²

¹School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, ²1. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, ³Kalinga Institute of Industrial Technology University

이 논문에서

요약

이 보고서 mRNA 표적 세포 miRNAs의 유효성 검사에 대 한 신속 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다. 잠겨 핵 산 LNA 기반 miRNA 합성 biotinylated 캡처를 모방한 메서드 사용 대상 mRNA. 그 후, 자석 구슬 streptavidin 입히는 풀 다운 고용 되어 대상 mRNA 정량 연쇄 반응에 의해 정량화에 대 한.

초록

MicroRNAs (miRNAs) post-transcriptionally 세포 유전자 발현을 조절 하는 작은 noncoding RNAs의 클래스는. 3' 번역된 (UTR)의 지역에 MiRNAs 바인딩 대상 mRNA 단백질 번역 억제 또는 어떤 경우에 mRNA 저하 될. 하는 3' UTR mRNA miRNA의 5' 끝에 2-8 뉴클레오티드 시드 순서에 의해 중재 대상의 miRNA의 바인딩. 세포질 규제 분자 miRNAs의 역할은 잘 설립, 기능적 관련성 대상 mRNAs의 식별 도전 남아 있다. Bioinformatic 도구 미르 바인딩에 대 한 잠재적인 대상으로 내는 3' UTR mRNAs의 시퀀스 예측 하 고용 있다. 이러한 도구는 또한 관련된 종 중에서 같은 시퀀스의 진화 보존 기능 역할을 예측 하려고 결정 하 활용 되었습니다. 그러나, 이러한 계산 방법을 종종 거짓 긍정적인 결과 생성 하 고 미르와 mRNA 간의 정식 상호 작용을 예측으로 제한 됩니다. 따라서, 그것의 mRNA 표적에 미르의 직접 바인딩을 측정 실험 절차는 상호 작용 기능을 설정 하는 데 필요한. 이 보고서에서 우리는 셀룰러 미르 미르 125b와 3' UTR의 PARP-1 mRNA 간의 직접적인 상호 작용의 유효성을 검사 하는 민감한 방법을 설명 합니다. 우리 정교한 프로토콜 있는 합성 biotinylated-미르 모방 되었다 포유류 세포로 페 하 고 미르 mRNA 복잡 한 세포 lysate에서 자석 구슬 streptavidin 입히는 내려 오게 되었다. 마지막으로, 대상 복잡 한 뽑아 다운 핵 산에서 mRNA 정량 기반 전략을 사용 하 여 계량 했다.

서론

MicroRNAs (miRNAs)는 작은 비 코딩 RNAs 단백질 식¹부정적인 통제. 미르의 선구자 단백질 코딩 유전자²^,³의 introns 그리고 intergenic 지역 내 가장 자주 게놈의 많은 영역을 통해 클러스터에 상주합니다. MiRNA 인코딩에서 pri miRNAs의 전사를 포함 하는 miRNAs의 속 유전자⁴. Pri miRNAs는 순차 처리를, 그리고 단일 좌초 성숙한 miRNAs⁴^,⁵를 생성 하는 세포질에서 핵에서 처음 받 다. 그 후, 성숙한 miRNAs RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC)에 통합 하는: 대상 인식⁴^,⁵^{, 단백질의 Argonaute 제품군의 구성원을 포함 하는 multimeric 단백질-RNA 복잡} ⁶^,⁷. 복잡 한 RISC에 성숙한 ....