Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과

Summary

이 보고서 mRNA 표적 세포 miRNAs의 유효성 검사에 대 한 신속 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다. 잠겨 핵 산 LNA 기반 miRNA 합성 biotinylated 캡처를 모방한 메서드 사용 대상 mRNA. 그 후, 자석 구슬 streptavidin 입히는 풀 다운 고용 되어 대상 mRNA 정량 연쇄 반응에 의해 정량화에 대 한.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) post-transcriptionally 세포 유전자 발현을 조절 하는 작은 noncoding RNAs의 클래스는. 3' 번역된 (UTR)의 지역에 MiRNAs 바인딩 대상 mRNA 단백질 번역 억제 또는 어떤 경우에 mRNA 저하 될. 하는 3' UTR mRNA miRNA의 5' 끝에 2-8 뉴클레오티드 시드 순서에 의해 중재 대상의 miRNA의 바인딩. 세포질 규제 분자 miRNAs의 역할은 잘 설립, 기능적 관련성 대상 mRNAs의 식별 도전 남아 있다. Bioinformatic 도구 미르 바인딩에 대 한 잠재적인 대상으로 내는 3' UTR mRNAs의 시퀀스 예측 하 고용 있다. 이러한 도구는 또한 관련된 종 중에서 같은 시퀀스의 진화 보존 기능 역할을 예측 하려고 결정 하 활용 되었습니다. 그러나, 이러한 계산 방법을 종종 거짓 긍정적인 결과 생성 하 고 미르와 mRNA 간의 정식 상호 작용을 예측으로 제한 됩니다. 따라서, 그것의 mRNA 표적에 미르의 직접 바인딩을 측정 실험 절차는 상호 작용 기능을 설정 하는 데 필요한. 이 보고서에서 우리는 셀룰러 미르 미르 125b와 3' UTR의 PARP-1 mRNA 간의 직접적인 상호 작용의 유효성을 검사 하는 민감한 방법을 설명 합니다. 우리 정교한 프로토콜 있는 합성 biotinylated-미르 모방 되었다 포유류 세포로 페 하 고 미르 mRNA 복잡 한 세포 lysate에서 자석 구슬 streptavidin 입히는 내려 오게 되었다. 마지막으로, 대상 복잡 한 뽑아 다운 핵 산에서 mRNA 정량 기반 전략을 사용 하 여 계량 했다.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs)는 작은 비 코딩 RNAs 단백질 식¹부정적인 통제. 미르의 선구자 단백질 코딩 유전자^2,3의 introns 그리고 intergenic 지역 내 가장 자주 게놈의 많은 영역을 통해 클러스터에 상주합니다. MiRNA 인코딩에서 pri miRNAs의 전사를 포함 하는 miRNAs의 속 유전자⁴. Pri miRNAs는 순차 처리를, 그리고 단일 좌초 성숙한 miRNAs^4,5를 생성 하는 세포질에서 핵에서 처음 받 다. 그 후, 성숙한 miRNAs RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC)에 통합 하는: 대상 인식^{4,5, 단백질의 Argonaute 제품군의 구성원을 포함 하는 multimeric 단백질-RNA 복잡 6,7}. 복잡 한 RISC에 성숙한 miRNAs는 주로 바인딩할는 3' UTR 대상 mRNAs^8,,910 의 하지만 가끔 코딩 및 mRNA^{10,11의 5' UTR 영역에 바인딩할 수도 있습니다.} . MiRNA에는 mRNA의 바인딩을 변환 입을^12,,1314 및 일부 경우 mRNA 불안¹⁵결과 시퀀스. 하나의 miRNA는 많은 mRNAs를 타겟팅 할 수 있습니다, 이후 이러한 규제 분자 거의 모든 세포질 프로세스에 참여 하 고 다양 한 질병 상태^16,,1718에 연루 되었습니다.

MiRNAs 세포 경로 조절 하는 방법의 자세한 이해 필요 대상 mRNAs의 식별을 합니다. 여러 생물 정보학 플랫폼 putative miRNA:mRNA 상호 작용^19,20을 예측할 수 있습니다. 이러한 예측은 miRNA의 2-8 뉴클레오티드 시드 순서와 대상 mRNA^4,21내 보완 시퀀스 사이의 완벽 한는 왓슨 크릭 기본 쌍에 의존 합니다. 또한, 이러한 도구 miRNA:mRNA 이중의 이차 구조를 생성,이 분자 상호 작용의 열역학 매개 변수를 계산 하 고 대상의 기능적 관련성을 향상 시키기 위해 종에 걸쳐 바인딩 사이트의 보존을 보여 예측입니다. 불행히도,이 도구는 또한 매우 높은 속도 (~ 27-70%)^15,22거짓 긍정적인 목표를 예측의 한계가 있다. 가장 중요 한 것은, 이러한 철에 플랫폼 그들의 대상²³miRNAs의 정식이 아닌 상호 작용을 인식 실패. 따라서, 이러한 예측 분석 기능 관련 목표를 확인 하는 실험 방법 종종 결합 됩니다.

여러 방법은 실험적으로 miRNA:mRNA 상호 작용을 확인 하기 위해 개발 되었습니다. 유전자 실험 미르 모방을 사용 하 여 스폰지와 억제제 셀에서 miRNAs의 레벨을 변경 하는 대상 유전자 식^24,,2526에 규제의 효과 대 한 단서를 제공 합니다. 또한, 기자 대상 mRNA와 미르 모방의 3' UTR 영역을 포함 하는 복제의 공동 transfection 통해 분석을 기반으로 또는 세포에 억제제 miRNAs²⁶의 규제 기능의 증거를 제공. 이러한 방법은 miRNAs에 의해 유전자 발현의 post-transcriptional 레 귤 레이 션을 공부 하는 중요 한 동안, 셀룰러 미르 레벨에서 변경의 transfection 효율 및 pleotropic 효과 이러한 유전 접근^{23의 주요 한계 26}. 따라서, miRNA와 표적 간의 직접적인 상호 작용을 조사 하는 보완 생화학 방법은 miRNAs의 세포질 기능을 더 나은 이해를 채용 합니다.

하나 널리 사용 되 miRNA와 표적 간의 직접적인 상호 작용을 공부 하 방법은 뒤에 복잡 한^{27,,2829,30 내 mRNA 대상의 검색 복잡 한 RISC의 immunoprecipitation} . 최근, 향상 된 RISC 트랩 방법 또한 미르 대상;을 식별 하기 위해 이용 되었다 그것은 mRNA 대상의 정화와 RISC-미르-mRNA 중간체 내의 대상의 안정화 커플. 그러나,이 methodsface 일반적으로 세포질 구획^31,32에 의해 차별 하는 RNA와 RNA 바인딩 단백질 사이 일반적인 상호 작용의 내재 도전. 또한, 이러한 분석 RISC 복잡 한³³의 immunoprecipitation에 대 한 AGO2 단백질의 존재에 의존 하고있다. AGO2는 효율적인 miRNA:mRNA 상호 작용을 중재 하는 유일한 argonaute 하지, 다른 argonautes의 한쪽으로 치우친된 결과³⁴발생할 수 있습니다. 따라서, 대체 전략 mRNA에 미르의 직접 바인딩 공부 필요 합니다.

이 보고서에서 우리는 miRNA 및 그 대상 간의 직접적인 상호 작용을 프로 빙에 대 한 1 단계 접근 정교한 mRNA. 첫째, 3' biotinylated 잠겨 핵 산 (LNA) 미르 모방 포유류 세포로 페는. 그런 다음, 세포 lysate에 복잡 한 miRNA:mRNA 코팅 streptavidin 자석 비즈를 사용 하 여 캡처됩니다. 상호 보완적인 miRNA에 바인딩된 mRNA 대상 정량 Pcr를 사용 하 여 정량 이다.

Protocol

1.의 3'-biotinylated 미르 transfection

참고: 살 균 층 흐름 후드 안에 다음 단계를 수행 합니다.

1. 2 mL에 잘 당 종자 4 x 10⁵–5 x 10⁵ HEK 293T 세포 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) [10% 소 태아 혈 청 (FBS)와 펜 strep 항생제 x 1 보충 DMEM] 완료. 37 ° C, 5% CO₂ 하룻밤에 인큐베이터에 셀 문화.
2. 다음 날, 건강 및 가벼운 현미경 도금된 세포의 부착을 확인 합니다.
   참고: 셀 준수 하 고 다음 단계로 진행 하기 전에 적절 한 형태를 달성 할 다는 것을 확인 하십시오. HEK 293T 세포 transfection 18-24 h에 대 한 일반적으로 준비가 도금 게시.
3. 살 균 1.7 mL microfuge 관에서 최소한의 필수 미디어의 200 µ L에서 biotinylated 미르의 75 picomoles 희석. 또 다른 1.7 mL microfuge 관 포함 Liposome 근거한 transfection 시 약 (8 µ L/잘) 최소한의 필수 미디어의 200 µ L에 희석이 혼합 전송. Pipetting으로 철저 하 게, 하지만, 부드럽게 혼합 하 고 transfection 단지의 형성 수 있도록 실 온에서 20-25 분 동안 품 어.
4. 부드러운 pipetting으로 6 잘 문화 판에서 오래 된 미디어를 제거 하 고 (펜 strep 항생제 x 1) 없이 갓된 완전 한 DMEM의 1.6 mL 각 잘 보충.
5. (1.3)에서 transfection 단지 추가 drop-wise 6 잘 플레이트 잘 보정 피 펫을 사용 하 여 셀에. 접시에 걸쳐 그들의 균일 한 분포를 보장 하기 위해 단지를 추가 하는 동안 접시를 부드럽게 소용돌이 친다.
   참고:이 단계는 transfection 효율을 달성 하기 위한 매우 중요 하 고 관심과 인 내와 수행 합니다.
6. 적어도 36 h에 대 한 37 ° C, 5% CO₂ 셀 문화.

2. 준비 Streptavidin의 코팅 자석 구슬-난

1. Vortexing에 의해 철저 하 게 streptavidin 자석 구슬을 resuspend. 2 mL nuclease 무료 microfuge 관 30 µ L (샘플) 당 비드 서 스 펜 션의 전송.
2. 마그네틱 비드 구분 스탠드 ("자석"이) 2 분 동안에 구슬 정지를 포함 하는 튜브를 놓습니다. 구슬 자석 접촉 튜브의 측면에 그려진는 확인 한 후 조심 스럽게 제거는 micropipette를 사용 하 여 상쾌한.
3. 구슬에 구슬 워시 버퍼 (10 mM Tris Cl pH 7.5, 0.5 m m EDTA, 1 M NaCl) 100 µ L를 추가 합니다. 자석에서 튜브를 제거 합니다. 15 소용돌이 구슬 씻어 실 온에서 s.
4. 구슬 2 분에 대 한 자석에 포함 된 튜브를 배치 하 고 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
5. 3 세척 총 2.3-2.4 단계를 반복 합니다. 마지막 세척 단계 후 자석에서 튜브를 제거 합니다.
6. 구슬에 (0.1 M NaOH, 0.05 M NaCl) 솔루션을 자유롭게 RNase의 100 µ L를 추가, 15에 대 한 vortexing에 의해 잘 섞어 s, 그리고 5 분 장소 2 분에 대 한 자석에 구슬 포함 된 튜브에 대 한 실 온에서 품 어 조심 스럽게 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
7. 세 번의 총 2.6 단계를 반복 합니다.
8. 구슬, 소용돌이 15 s에 구슬 물의 resuspension 솔루션 (0.5 M NaCl)을 추가 하 고 5 분 resuspended 구슬 2 분에 대 한 자석에 놓고는 상쾌한을 조심 스럽게 제거에 대 한 실 온에서 품 어.
9. 구슬에 구슬 차단 솔루션 (1 µ g / µ L BSA, 2 µ g / µ L 효 모 tRNA)의 200 µ L를 추가 합니다. 15에 대 한 부드러운 vortexing에 의해 혼합 실 온에서 s. 멀티 관 회전에 16 h (오버 나이트) 4 ° C에서 품 어.

3입니다. 세포 Lysates의 준비

1. 층 류 후드 내부 살 균 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 부드러운 된다고 하 여 transfected HEK 293T 세포를 수확 한 다음 살 균 2 mL microfuge 관으로 각 샘플을 전송.
2. 1500 x g 에서 원심 분리 하 여 작은 긁힌 것된 셀 공의 5 분 Resuspend 펠 릿 살 균 PBS (인산 염 버퍼 염 분), pH 7.2 x 1에 대 한. 펠 릿 잔여 미디어의 자유를 얻기 위해 5 분 동안 1500 x g 에서 원심 분리기 다시. 바로 얼음으로 펠 릿을 포함 하는 관 급락.
3. 신선한 완전 한 세포 세포의 용 해 버퍼를 준비 (150 mM NaCl, 25mm Tris-Cl, pH 7.5, 5 mM DTT, 0.5 %IGEPAL, 60 U/mL Superase, Protease 억제제 x 1).
   참고: IGEPAL, Superase, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일 부족 세포 세포의 용 해 버퍼의 재고 미리 준비 고 실내 온도에 저장 될 수 있습니다. 재고 세포 세포의 용 해 버퍼에 권장된 최종 농도에서 위의 보충을 추가 하 고 얼음에 저장 하 여 완전 한 세포 세포의 용 해 버퍼의 신선한 배치를 준비 합니다.
4. 얼음 처럼 차가운 완벽 한 세포 세포의 용 해 버퍼의 260 µ L microfuge 관 (즉, 각 microfuge 관 6-잘 접시의 한 우물에서 수확 하는 셀이 포함)에서 각 샘플을 추가 하 고 pipetting으로 동질적인 서 스 펜 션으로 셀 펠 릿을 resuspend.
5. 동결-해 동 방법을 사용 하 여 세포를 lyse: 10-15 분-80 ° C에서 튜브를 품 어. 다음, 얼음에 밖으로 해 동을 셀 수 있습니다.
6. 원심 결과 세포 lysate 16000 x g 냉장된 벤치탑 원심 분리기 4 ° c.에 설정에서 5 분에서
7. 얼음에 살 균 1.7 mL microfuge 관에 지운된 세포 lysate를 전송. 펠 릿을 삭제 합니다.
   참고: 마지막 양의 lysate 삭제 해야 합니다 ~ 240-250 µ L.
8. 1 M의 최종 농도에 5 M NaCl를에서 지운 lysate를 추가 하 고 얼음에 샘플을 유지.

4. Streptavidin 자석 구슬의 준비-II

1. 신선한 완전 한 풀-다운 워시 버퍼 (10mm KCl, 1.5 m m MgCl₂, 10 mM Tris Cl pH 7.5, 5 mM DTT, 1 M NaCl, 0.5 %IGEPAL, 60U/mL Superase, 및 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일)를 준비
   참고: 풀-다운 워시 버퍼 IGEPAL, Superase, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일 부족 재고 미리 준비 고 실내 온도에 저장 될 수 있습니다. 재고 세포 세포의 용 해 버퍼에 권장된 최종 농도에서 위의 보충을 추가 하 고 얼음에 저장 하 여 완전 한 세포 세포의 용 해 버퍼의 신선한 배치를 준비 합니다.
2. 장소는 튜브를 포함 하는 준비 된 구슬 (2.9 단계) 2 분에 대 한 자석에 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
3. 구슬에 얼음 처럼 차가운 완벽 풀 다운 워시 버퍼의 150 µ L를 추가 합니다. 15 소용돌이 s 고 30-60 미 위 2 분에 대 한 자석에 튜브는 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한 실내 온도에서 품 어.
4. 3 번의 4.3 총에 대 한 단계를 반복 합니다.
5. 완전 한 풀-다운 워시 버퍼의 300 µ L에 구슬 resuspend.

5. 대상 mRNA-미르 단지의 풀 다운

1. (단계 3.8)에서 세포 lysate의 300 µ L를 전송 (4.5 단계)에서 구슬의 300 µ L를 포함 microfuge 관에.
2. 실 온에서 1 h nutating 믹서에 혼합물을 품 어.
3. 5 분에 대 한 자석에 튜브는 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한 장소.
4. 구슬에 얼음 처럼 차가운 완벽 풀 다운 워시 버퍼의 300 µ L를 추가 합니다. 15와 동 실내 온도 및 장소 5 분에 대 한 자석에 튜브는 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한 s.
5. 5.4 단계를 두 번 더 반복 합니다.
6. 구슬 nuclease 무료 물 100 µ L에 resuspend 그리고 얼음에 품 어.

6. 총 RNA 추출, cDNA 합성, 및 정량

1. (5.6 단계)에서 resuspended 구슬에서 총 RNA 추출 적절 한 메서드를 사용 하 여 ( 재료의 표참조). 25 µ L nuclease 무료 물에서 추출 된 총 RNA를 resuspend. RNA 농도 분 광 광도 계 (260/280에서 흡 광도)를 사용 하 여 품질을 확인 합니다. 50 ng / µ L에서 RNA의 작업 재고를 준비 합니다.
2. CDNA 합성, triplicates, 50를 사용 하 여 수행 (단계 6.1)에서 총 RNA의 ng ( 재료의 표참조) 키트는 적절 한 cDNA 합성을 사용 하 여 20 µ L (표 1)의 최종 볼륨 올리고 dT 프라이 머를 사용 하 여. 표 2에 설명 된 조건에 따라 열 사이클링을 수행 하기 위해 정량에 PCR 튜브, 로드.
3. (6.2 단계)에서 CDNA에 정량 수행 SYBR 녹색 화학을 사용 하 여 (재료의 표 참조):
   1. 무 균 조건에서 96 잘 명확한 아래 접시에 triplicates 모든 정량 Pcr 반응을 수행 합니다.
   2. 정량 마스터에서 반응 혼합물의 aliquot 9 µ L 믹스 ( 표 3참조)는 격판덮개의 각 음에. 다음, 1 µ L 10 µ L의 최종 볼륨을 달성 하기 위해 각 잘에 cDNA의 밀봉 내열성 PCR 플레이트 마감재를 사용 하 여 PCR 플레이트를 추가 하 고 정량에 로드
   3. 표 4에 설명 된 조건에 따라 열 사이클링을 수행 합니다.
   4. 스크램블된 제어의 식 수준에 각 샘플의 식 수준 (Ct 값)를 정상화. 이 값을 사용 하 여 계산 식에서 배 변화.

Results

MiRNAs 규제 대상 mRNAs에 바인딩하여 세포 프로세스. 따라서, 식별 mRNA 표적 miRNA의 기능을 이해 하는 열쇠입니다. 여기 우리 정교한 셀룰러 miRNA의 mRNA 표적을 식별 하는 방법. 이 프로토콜은 Wani 외. 에서 적응 ³⁵ biotinylated LNA 기반 미르 모방 풀 다운을 활용의 수정 대상 mRNA. LNA 기반 oligonucleotide 모방의 사용 없이 독성 효과^36,,3738수정된 ribose 링의 높은 안정성으로 인하여 대상 바인딩의 특이성을 향상 시킵니다. 우리 셀룰러 미르 미르 125b의 대상으로 PARP 1 mRNA 아래로 끌어이 방법 채택. 미르-125b 식의 최고 수준의 신경 기능

Discussion

세포질 miRNAs의 mRNA 표적 식별이 그들의 규제 기능을 이해 중요 합니다. 여러 계산 도구는 씨앗 시퀀스 complementarity 및 대상 시퀀스^19,20의 보존에 따라 목표를 예측 하 고용 된다. 이 도구는 귀중 한, 비록 그들은 가양성 및 false 네거티브의 상부를 생성할 수 있습니다. 따라서, 이러한 예측은 복잡 하 고 복잡 한 miRNA:mRNA의 풀 다운 RISC 그들의 각각 목표^27,31miRNAs의 직접 바인딩 확인의 immunoprecipitation 같은 실험 방법으로 결합 됩니다. Biotinylated 미르를 이용 하는 실험적인 전략 풀 다운에 모방이 보고서 세부 정보는 mRNA를 대상. Biotin 풀 다운 높은 감도와 낮은 거짓 긍정적인 평가³⁵

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
세포주- HEK293T	ATCC	CRL-3216
Heat-inactivated bovine serum (Hi-FBS)	GIBCO/Thermofisher	10438-026
Dulbecco' s 변형 된 독수리' s medium (DMEM)	GIBCO/Thermofisher	11995-065
인산염 완충 식염수 (PBS) (1x)	GIBCO/Thermofisher	20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)	GIBCO/Thermofisher	25200-056
페니실린-스트렙토마이신 용액 (100x)	Cellgro/Mediatech	30-002-CI
DNase	Ambion	AM2238
Opti-MEM 저축 혈청 매체	GIBCO/Thermofisher	3198-088
Liopfectamine 2000 형질주입 시약	Invitrogen/ Thermofisher	11668-019
Biotinylated has-miR-125b	Exiqon	339178/ID-27281622
Biotinylated 스크램블 제어	Exiqon	479997-671/ID-714884
IGEPAL	Sigma-Aldrich	18896
Streptavidin 마그네틱 비드	피어스	88816
효모 tRNA	Invitrogen/Thermofisher	15401-011
소 혈청 알부민(BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
염화칼륨(KCl) 용액	Sigma-Aldrich	60142
염화마그네슘(MgCl2) 용액	시그마-알드리치	M1028
수산화나트륨(NaOH)	시그마-알드리치	795429
에틸렌디아민 테트라아세트산, 디소듐염(EDTA) 용액, 0.5M, pH 8.0	시그마-알드리치	E7889
디티오트레이톨(DTT)	시그마-알드리치	43815
슈퍼아제	앰비온/써모피셔	AM2694
프로테아제 억제제 칵테일	Sigma-Aldrich	P8340
RNAse/DNAse 자유수	GIBCO/Thermofisher	10977-015
RNeasy 추출 키트	Qiagen	74104
iScript-Select cDNA 합성 키트	Biorad	170-8897
qPCR 프라이머	Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermix	Biorad	172-5120
DynaMag-Spin 자석	Invitrogen/Thermofisher	12320D