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방법 논문

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

7.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57796

⸱

2018년 7월 3일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

이 논문에서

요약

이 문서에는 분 광 분석에 대 한 세제 solubilized TRPV1의 생 화 확 적인 수량을 얻기 위해 특정 방법을 설명 합니다. 결합 된 프로토콜 막 제어 환경에서 포유류 이온 채널에 대 한 구조 및 기능 연구를 촉진 하기 위하여 적응 시킬 수 있다 생 화 확 및 생물 도구를 제공 합니다.

초록

Polymodal 이온 채널 transduce 다른 성격의 여러 자극에 allosteric 변화; 이러한 동적 conformations 확인 하 고 크게 불명 하 게 남아 도전입니다. 주 작동 근 바인딩 사이트의 구조적 특징 및 여러 이온 채널의 활성화 메커니즘에 단일 입자 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM) 발산 빛의 최근 발전, 무대는 그들의 게이팅의 깊이 있는 동적 분석에 대 한 설정 분 광 방법을 사용 하 여 기계 장치입니다. 이중 전자-전자 공명 (사슴)와 전자 상자성 공명 (EPR) 분 광 기술을 대량으로 순화 될 수 있는 간결한 이온 채널 연구에 주로 제한 되었습니다. 대량의 기능과 안정적인 막 단백질에 대 한 요구 사항을 이러한 방법을 사용 하 여 포유류 이온 채널 연구를 방해 했다. EPR 및 사슴 이기는 하지만 낮은 해상도에서 엑스레이 결정학 또는 곳을 알아내는-EM 얻으려면 어려울 수 있습니다, 구조 결정 및 모바일 단백질 영역의 동적 변화를 포함 하 여 및 가역 게이팅 모니터링 많은 장점을 제공합니다 (즉, 폐쇄, 오픈, 응, 그리고 desensitized) 전환. 여기, 우리는 기능성 세제 solubilized 일시적 수용 체 잠재적인 양이온 채널 인도의 V 회원 1 (TRPV1) 사슴 및 EPR 분광학에 대 한 분류 수 밀리 그램을 얻기 위한 프로토콜을 제공 합니다.

서론

단일 입자 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)의 최근 발전, 포유류 이온 채널 구조는 특별 한 속도로 얻은 되었습니다. 특히, 일시적인 수용 체 잠재력 vanilloid 1 (TRPV1) 같은 polymodal 이온 채널의 구조 연구를 제공 추가 활성화 메커니즘1,2,3, 의 이해 4 , 그러나 5., 막 환경에 포함 된 이온 채널에 대 한 동적 정보는 그들의 polymodal 제어 및 약물-바인딩 메커니즘을 이해 하는 데 필요한.

전자 상자성 공명 (EPR) 및 이중 전자-전자 공명 (사슴) spectroscopies 이온 채널6,7,,89 에 대 한 가장 확실 한 기계적 모델의 일부를 제공합니다 , 10 , 11 , 12 , 13. 이러한 접근의 간결한 검사에 주로 제한 되었습니다 및 archeal 이온 채널을 때 박테리아에 overexpressed 세제 정화 단백질 많은 양의 얻을. 곤충과 포유류 세포 기능 및 구조 특성화14,,1516진 핵 막 단백질 생산의 개발, 그것은 지금 생화학 얻을 수 분 광 연구에 대 한 세제 정화 단백질의 금액.

EPR 및 사슴 신호 단백질에서 단일-시스테인 잔류물에 연결 된 paramagneticspin 레이블 (SL) (즉, methanethiosulfonate)에서 발생 한다. 스핀-레이블을 보고 세 가지 유형의 구조 정보: 모션, 각, 및 거리. 이 정보는 잔류물 단백질 내 매장 하거나 막 또는 apo에 ligand 바인딩 상태13,17,,1819수성 환경에 노출 되는 수 있습니다. 고해상도 구조 (사용 가능한 경우)의 맥락에서 EPR 및 사슴 데이터 제공 가역 제어 전환 (즉, 폐쇄, 오픈, 모니터링 하는 동안 그들의 네이티브 환경에서 동적 모델을 파생에 대 한 제약 조건의 컬렉션 응, 그리고 desensitized). 또한, 엑스레이 결정학 또는 곳을 알아내는-그들 확인 하기 어려울 수 있습니다 유연한 지역 2 차 구조는 단백질20내의 위치 할당을 이러한 환경 데이터 집합을 사용 하 여 얻을 수 수 있습니다. 이온의 게이팅에 대 한 귀중 한 정보 채널3,,2122,,2324, 를 제공 하는 곳을 알아내는-EM 구조 지질 nanodiscs에서 25; 그러나, 분 광 방법 구조적 하는 상태에서 (예를 들어, 열 변경) 곳을 알아내는-그들을 사용 하 여 결정 하기 어려울 수 있습니다 동적 정보를 제공할 수 있습니다.

EPR와 사슴, 단백질 기능의 부족을 포함 하 여 모든 시스테인 잔류물 (특히 풍부한 포유류 채널에서), 낮은 단백질 수확량, 단백질 불안정성을 제거 하는 정화 동안 고 스핀 라벨링 후 구현 하 많은 어려움을 극복 한다 그리고 단백질 집계 세제 또는 리. 여기, 우리는 이러한 중요 한 장벽을 극복 하 여 포유류 감각 수용 체에 대 한 사슴 및 EPR 스펙트럼 정보를 얻은 프로토콜 설계. 여기 목적은 식, 정화, 라벨, 및 기능 최소화 시스테인-덜 쥐 TRPV1의 재구성 (eTRPV1) 분 광 분석에 대 한 구성에 대 한 방법론을 설명 하는 것입니다. 이 방법론은 그 막 단백질 이황화 결합을 형성 하는 시스테인을 포함 하는 또는 시스테인 잔류물의 제거에도 불구 하 고 그들의 기능을 유지 하는 것에 적합 합니다. 프로토콜의이 컬렉션은 다른 포유류 이온 채널의 분 광 분석에 대 한 적응 수 있습니다.

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프로토콜

1. TRPV1 Mutagenesis

참고: 분 광 분석26 에 대 한 최소한의 TRPV1 구문 전체 길이 시스테인-덜 채널 TRPV127 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 방법 (그림 1)를 사용 하 여에서 건축 되었다. 110-603, 627-764 잔류물이 시스테인 없는 최소한의 TRPV1 구문 (라고도 함 eTRPV1 이후)에 의하여 이루어져 있다. eTRPV1와 히스티딘 맥 아당 의무적인 단백질 (MBP) x 8을 포함 하는 재조합 기증자 벡터28 pMO (pcDNA3.1 기반 벡터) 기능 분석에서에서 복제 했다-담배 엣지 표현과 정화 (그림 2A)에 대 한 바이러스 (TEV). eTRPV1-단일 시스테인 돌연변이 사이트 지시 된 mutagenesis를 사용 하 여 생성 된. 벡터 및 채널 시퀀스에 지정 된 보조 파일 1: 보충 방법.

  1. 온라인 도구29와 mutagenesis 뇌관 디자인.
  2. 0.2 mL 튜브에 혼합: 반응 버퍼, dNTP 믹스 (100 mM)의 1 μ, μ M 정방향 및 역방향 oligonucleotides 10, 100 ng/μ eTRPV1 서식 파일 DNA26의 1 μ, DMSO, mutagenesis 효소의 1 μ의 1.5 μ의 각 1 μ x 10의 5 μ 그리고 이온된 수의 38.5 μ. 튜브는 thermocycler에 배치 하기 전에 혼합물을 회전 합니다.
  3. PCR mutagenesis를 수행 합니다.
    1. 2 분 동안 95 ° C에서 변성 (a), (b) 20 95 ° C에서 변성 수행 s, (c) 10 s, 및 (d) 신장 4 분 동안 68 ° C에서 60 ° C에서 어 닐 링 (30 1 kb / s). 18 주기 위한 단계 b d 반복 다음 5 분, 68 ° C에서 신장 수행 하 고 추가 사용 때까지 4 ° C에서 반응 유지.
  4. Dpn의 2 μ 추가 나 효소 반응; 믹스와 다음 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
  5. 변환 수행
    1. 대장균 유능한 세포 얼음에 녹여
    2. 사전 냉각된 14 mL 무 균 튜브에 유능한 세포의 75 μ와 10 μ DpnI 치료 PCR 혼합물의 추가 합니다. 부드럽게 혼합.
    3. 30 분 유지 45 42 ° C에서 튜브에 대 한 얼음에 반응을 품 어 s 다음 즉시 제자리에 2 분 접시에 얼음 혼합물에 Luria 국물 (파운드)-carbenicillin (0.2 mg/mL)를 포함 하는 한 천 배지. 37 ° c.에 하룻밤 접시를 품 어
    4. 플레이트에서 최소한 3 개의 단일 식민지를 수확 하 고 각각 carbenicillin (0.2 mg/mL) 14 mL 살 균 튜브를 사용 하 여 포함 된 파운드의 4 mL에 접종. 37 ° C에서 하룻밤 문화를 품 어 고 250 rpm에 흔들.
    5. 10 분 동안 8000 x g에서 하룻밤 문화 아래로 회전 시키십시오 그리고 상업적으로 사용 가능한 미니 준비 키트의 지침에 따라 DNA를 추출.
    6. 표준 자동화 된 DNA 시퀀싱에 의해 단일-시스테인 돌연변이의 존재를 확인 ( 재료의 표참조).

2. eTRPV1 및 단일-시스테인 돌연변이의 기능 분석

  1. HEK293 세포 transfection 라인 30
    1. 잘 당 2 ml 높은 포도 당 매체 (DMEM)의 6-잘 접시에서 HEK293 세포 문화 (37 ° C, 5% CO2, 95% 습도). 70 \u2012 80% 합칠 HEK293 세포를 준비 합니다.
    2. 두 개의 별도 1.5 mL 마이크로 원심 튜브에 transfection 혼합물을 준비 합니다.
      1. A 반응, 최소한의 필수 매체 (예: Opti 메모리)의 250 µ L를 0.5 µ g eTRPV1 또는 시스테인 돌연변이 포함 된 pMO를 추가 합니다. B 반응에 대 한 최소한의 필수적인 매체의 250 µ L를 transfection 시 약의 3 µ L를 추가 합니다. 각 반응 실내 온도 (RT)에서 5 분 동안 품 어.
      2. 1 mL 피 펫과 반응 A와 B를 혼합. 실시간에서 45 분을 위한 혼합물을 품 어
    3. 70-80% 합칠에서 문화 미디어의 500 µ L를 잘 제거 하 고 반응 혼합물의 500 µ L을 추가. 하룻밤 위한 캘리포니아2 + (37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도) 이미지를 저장 합니다.
  2. 캘리포니아2 + HEK293 세포 이미징 30
    1. 12 m m 직경 유리 coverslips 에탄올과 물으로 청소 하 고 24-잘 접시에 그들을 배치.
    2. 각 coverslip의 센터에서의 폴 리-l-리 신 75 µ L을 추가 하 고 (37 ° C, 5% CO2, 95% 습도) 45 분 동안 접시를 저장.
    3. 인산 염 버퍼 염 분 제거 어떤 남은 하 (PBS)와 세 번 초과 폴 리-l-라이 신 및 세척 coverslips를 제거 합니다.
    4. coverslips 준비가 되 면, 일단 6 잘 플레이트 세포 분리를 진행 합니다.
    5. 미디어를 제거 하 고 세척에 대 한 따뜻한 PBS (37 ° C)의 500 µ L를 추가 합니다.
    6. PBS를 제거, 트립 신의 500 µ L을 추가 하 고 1 분 동안 품 어.
    7. 따뜻한 문화 (37 ° C) 및 미디어를 소화 반응을 중지 피펫으로; 혼합의 500 µ L을 추가 거품을 형성 하지 마십시오. 필요한 경우 더 많은 문화 미디어와이 물의 resuspension diluting 셀 농도 조정 합니다.
    8. 문화 미디어 (500 µ L 최종 볼륨 잘 당) 전 대우 coverslips의 250 µ L 플러스 transfected HEK293 세포 (70% 합칠)의 250 µ L 씨와 인큐베이터 (37 ° C, 5 %CO2, 95% 습도)에 1-2 h (첨부 파일)에 대 한 진정 하자.
    9. 한편, 0.02 %pluronic 산과 1 µ M를 추가 하 여 로드 솔루션 준비 Fluo-4-오전 벨의 버퍼를. 솔루션을 잘 섞는다.
    10. 우물에서 HEK293 문화 미디어를 제거 하 고 로드 솔루션의 500 µ L를 추가 합니다. 1 시간 (37 ° C, 5% CO2, 95% 습도)에 대 한 셀을 품 어. 씻어 따뜻한 벨의 버퍼와 두 번 Fluo-4 로드 셀.
    11. 세포내 캘리포니아2 + 측정을 수행 (를 사용 하 여 목표; 494 nm 여기 및 506 nm 방출 X 10) 현미경 스테이지에 10 mm 페 트리 접시에 로드 셀 coverslip을 놓습니다.
    12. (예를 들어, 10 μ M capsaicin) 각각 ligands perfusing 후 형광 강도에 변화를 측정 상용 소프트웨어를 사용 하 여 ( 재료의 표참조).
  3. mRNA와 Xenopus laevis oocytes 준비 30
    1. ETRPV1 및 단일-시스테인 돌연변이 포함 된 pMO Pme로 선형화 37 ° c.에 1 시간을 위한 나 DNA 상용 정화 키트의 지침에 따라 청소.
    2. 사용 선형화 및 상용 키트 T7 RNA 중 합 효소와 호환와 함께 출장된 RNAs를 합성 하는 DNAs를 청소.
    3. 상업적으로 이용 가능한 정화 키트에 따라 출장된 RNAs를 청소. 260 nm 파장에서 흡 광도 측정 하 여 RNA의 양을 계량.
    4. 전송 5 \u2012 포함 하는 ND96 솔루션의 20 mL 50 mL 원뿔 튜브에 X. laevis oocytes (상용)의 10 mL (96 m NaCl, KCl, 5 mM HEPES, 2mm m 1 m m MgCl2, pH 7.4) 1 mg/mL 콜라와 실시간에 50 분 nutate
    5. 린스는 oocytes ND96에까지 솔루션은 분명 하다. 신선한 콜라를 추가 하 고 스테레오 현미경 oocytes 실시간 검사에서 30 분 동안 흔들어 외부 follicular 레이어 (광택 레이어 붉은 혈관)는 결 석 때 소화를 중지 대부분 oocytes (90%)에서. 솔루션은 분명 때까지 ND96에 oocytes를 씻어.
    6. ND96 플러스 1 m m CaCl2 와 쉐이크 1 헤-소화 oocytes에 대 한 폴리스 티 렌 50 mL 튜브에 전송 oocytes는 폴리스 티 렌 튜브에 충실 합니다.
    7. ND96 플러스 1 mM gentamicin의 50 µ g/mL와 항생물질의 50 µ g/mL CaCl2 와 보충 솔루션 oocytes를 씻어.
      참고: 가벼운 노출에서 항생물질을 포함 하는 솔루션을 보호 합니다.
    8. 손상 된 막과 동물과 야채 기둥 사이의 명확한 분리 표시 없이 큰 oocytes를 선택 합니다. Oocytes 16 ° c.에 microinjection 전에 4 h에 대 한 복구를 하자합니다
    9. 유리 펫을 사용 하 여 (마약: 1.11 m m, 아이디: 0.5, 그리고 길이 8.8 cm) oocytes nanoliter 인젝터 시스템 (46 nL/s)와 스테레오 현미경 (2 배 확대)를 사용 하 여 eTRPV1 및 단일-시스테인 돌연변이 체에서 mRNA의 1-5 ng 주입 하. 항생제와 CaCl2 보충 하는 ND96에 16 ° C에 oocytes를 저장 (gentamycin/항생물질 1 x).
    10. 72 h 후 거시적인 전류 2 전극 전압 클램프 (TEVC) 수집 시스템31를 사용 하 여 측정 합니다.
    11. 붕 규 산 유리 펫 (0.3 m ω)을 당겨 하 고 3m KCl 그들을 채우십시오.
    12. 전송 피 펫을 사용 하 여 녹음 실에는 oocyte 놓고 낮은 속도로 목욕 솔루션 (120 mM NaCl, KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 그리고 10 mM HEPES 솔루션 2mm, pH 7.4) perfuse.
    13. 그들의 피 펫 오프셋 조정 목욕 솔루션에 두 전극을 담가. 부드럽게 밀어 피 펫 전극 (붕 규 산 유리 펫; 마약: 1.5 m m, 아이디: 1.10, 및 길이 10 cm) oocyte 막 잠재력에 있는 변화 뿐만 아니라 작은 들여쓰기 (2 배 확대), 스테레오 현미경 관찰 될 때까지에.
    14. 80-80에서 전압 클램프 램프를 적용 하는 동안 모드 및 측정 거시적인 전류를 기록 앰프 설정 변경 1 s. 부하 관류 시스템에서 사용 하는 솔루션에 대 한 mV 2.3.12 pH 7.4 (컨트롤로)와 pH eTRPV1 활동을 확인 하는 5 단계.

3. 단백질 표정을 위한 재조합 Bacmid 및 잠재 생성

  1. Bacmid
    1. 7.5와 DH10Bac 대장균 유능한 세포의 100 μ 변환 eTRPV1 또는 단일-시스테인 돌연변이 포함 하는 재조합 기증자 벡터의 ng.
    2. SOC 미디어의 900 μ 추가 (20 mg/mL Tryptone, 5 mg/mL 효 모 추출, 2.5 m m KCl, 10mm MgCl2, 10 m m MgSO4및 20 m m 포도 당)과 6-7 h 37 ° C에서와 225 rpm에 품 어.
    3. 혼합물에서 직접 및 직렬 희석에서 100 µ L 씨 (1/10과 1/100)에 파운드-한 천 배지 100 μ g/mL X-여자, 40 μ g/mL IPTG, 포함 7 μ g/mL gentamicin, 10 μ g/mL 항생물질 및 50 μ g/mL 대. 37 ° c.에 적어도 48 h에 대 한 번호판을 품 어
    4. 백색 식민지는 직경에서 2 mm 블루 식민지 부족의 삽입을 선택 합니다. 스테레오 현미경을 사용 하 여 백색 식민지 어떤 푸른 반점 든 지를 포함 하지 않는 확인 하십시오.
    5. 적어도 3 개의 단일 식민지를 수확 하 고 파운드 미디어 7 μ g/mL gentamicin, 10 μ g/mL 항생물질 및 50 μ g/mL 대 보충의 4 mL를 포함 하는 14 mL 무 균 튜브에 그들을 전송. 셀 하룻밤 (~ 16 h) 37 ° C, 250 rpm에서 품 어.
    6. 야간 문화 및 격리 재조합 bacmid DNA (자세한 프로토콜에 대 한 보충 파일 1 참조)의 1.5 mL를 가져가 라. 최대 2 개월까지 4 ° C에서 bacmid를 저장 합니다.
      참고: bacmid DNA를 포함 하는 DH10Bac 대장균 의 글리세롤 주식 준비. 문화의 300 μ 고 200 μ 글리세롤의 50% (최종 글리세롤 농도 20%의) 추가. 추가 사용까지-80 ° C에서 약 수를 저장 합니다.
    7. PCR를 사용 하 여 재조합 bacmid에서 eTRPV1의 존재를 확인 (자세한 프로토콜에 대 한 보충 파일 1 참조).
  2. 잠재
    참고:이 절차에 대 한 6-잘 형식에서 Sf9 곤충 세포 transfect. 모든 금액과 볼륨 당 잘으로 받는다. 항생제의 사용을 하지 마십시오.
    1. 곤충 세포 미디어의 2 mL에 1 x 106 Sf9 세포를 플레이트. 적어도 45 분 동안 연결할 셀 수 있습니다.
    2. 곤충 세포 미디어의 100 μ에 재조합 bacmid DNA의 1 μ g을 희석. 부드럽게 혼합.
    3. 곤충 세포 미디어의 100 μ에 transfection 시 약 (TR)의 6 μ를 희석. 부드럽게 혼합.
    4. DNA와 TR 솔루션을 결합 (에서 단계 3.2.2, 3.2.3, 각각). 부드럽게 혼합 하 고 실시간에 30 분 동안 품 어
    5. DNA/TR 혼합물;에 곤충 세포 미디어의 0.8 mL을 추가 부드럽게 혼합.
    6. Sf9 세포에서 곤충 세포 미디어를 제거 하 고 신선한 매체의 1 mL로 한 번 씻어.
    7. 세척 매체를 제거 하 고 DNA/TR 혼합물 추가 (3.2.2 \u2012 3.2.5) 셀에. 셀 (동요) 없이 5 h 27 ° C에서 품 어.
    8. Transfection 혼합물을 제거 하 고 0.5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 포함 하는 곤충 세포 미디어의 2 개 mL를 바꿉니다. 5 일 동안 셀 27 ° c를 품 어.
      주의: 미디어 빈 우물을 작성 하 고 파라핀 영화의 2 개의 층으로 6 잘 플레이트를 취재 하 여 셀 미디어의 증발을 방지.
    9. 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 배양을 전송. 4 ° c.에 15 분 동안 8000 x g에서 튜브를 회전 시켜 바이러스 성 주식의 첫 대목 (P1)을 분리 깨끗 한 15 mL 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송 및 즉시 4 ° c.에 그것을 저장합니다
      참고: 알루미늄 호 일을 가진 관을 취재 하 여 가벼운 노출에서 바이러스를 보호 합니다.
    10. 바이러스 성 주식의 2 세대 (P2), 1 x 106 Sf9 셀/mL 2% 포함에 곤충 세포 미디어의 현 탁 액 25 mL 문화 넣어 125 mL 플라스 크에 FBS (일반 바닥 및 배기). 25 mL 문화에 P1 바이러스의 25 μ를 추가 합니다.
    11. 72 h 27 ° C에서 문화를 품 어.
    12. P2 바이러스 성 주식을 수확, 새로운 50 mL 튜브에 문화를 전송 및 4 ° c.에 15 분 동안 8000 x g에서 원심
    13. 새로운 50 mL 튜브에는 상쾌한 전송 및 즉시 4 ° c.에 그것을 저장합니다
      참고: 알루미늄 호 일을 가진 관을 취재 하 여 가벼운 노출에서 바이러스를 보호 합니다. 최적의 TRPV1 식 P2 바이러스/Sf9 비율을 적정 하는 소규모 실험 수행 (자세한 프로토콜에 대 한 보충 파일 1 참조, 섹션 4 라는 "P2 바이러스에 대 한 소규모 실험.")
    14. 곤충 세포 미디어 0.5%와 보충에 2 x 106 셀/mL에서 대규모 단백질 표정, 설정 1-L Sf9 세포 현 탁 액 문화 FBS 2.8 L 붕 규 산 유리 플라스 크에.
    15. 1 L 문화에 P2 바이러스 주식의 1 mL을 추가 하 고 72 h 27 ° C에서 품 어.
      참고: 세번째 날에 셀 밀도 약 1.5 ~ 2.5 x 106 셀/mL에 있어야 합니다.

4. eTRPV1 및 단일-시스테인 돌연변이 정화

  1. 막 분리28
    1. 4500 x g, 4 ° C, 20 분에 회전에 의해 1 L 곤충 세포 현 탁 액 문화 무게 (약 6-9 g을 될 것으로 예상) 셀 펠 릿 추수.
    2. 25 mL의 얼음 처럼 차가운 버퍼 A에 셀 펠 릿 resuspend (36.5 m m 자당, 2 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP), 및 50 mM Tris; pH 7.4) protease 억제제 (1 m m phenylmethyl sulfonyl 불 소 (PMSF), 3 μ g/mL leupeptin, 3 μ g/mL aprotinin 존재 그리고 1 μ g/mL pepstatin). 균질 정지를 20 분 동안 4 ° C에서 회전 셀 덩어리 세분화
    3. 설명서 (dounce 조직 분쇄기) 또는 고압 균질 화기를 사용 하 여 셀을 휴식. 4 ° c.에 20 분 동안 8000 x g에서 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거
      참고: 전체 프로세스 중 lysed 세포와 얼음에 튜브를 유지.
    4. 상쾌한 및 4 ° c.에 30 분 동안 100000 x g에서 원심 분리기를 수집 상쾌한 무시 하 고 막 펠 릿 (4.1.2 단계)에서 프로 테아 제 억제제와 보충 (150 mM NaCl, 2mm TCEP, 50 mM HEPES 10% 글리세롤, pH 7.4), 얼음 처럼 차가운 버퍼 B의 20 mL의 총 볼륨에 resuspend.
    5. Aliquot 20 mL 50 mL 튜브에 막 펜션과 플래시-동결 액체 질소에서의. 추가 사용까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
  2. 단백질 정화26,28
    1. 멤브레인 aliquots 얼음에 녹여 고 n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) 튜브 (200 m m 재고) 당 3 mL를 추가 합니다. 2 h 4 ° c.에 대 한 튜브를 회전
    2. 4 ° c.에 30 분 동안 100000 x g에서 샘플을 원심 수집 하는 상쾌한 고 깨끗 한 젖은 amylose 수 지의 1 mL를 추가 합니다. 2 h 4 ° c.에 대 한 혼합물을 회전 단백질/amylose 혼합물 중력 흐름 크로마토그래피 열에 로드 합니다.
      주의: 세척 중 건조 수 지를 허용 하지 않습니다.
    3. 10 배 얼음 처럼 차가운 버퍼 C (150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 0.5 m m DDM, 0.1 μ g/mL asolectin, 0.5 m m TCEP 10% 글리세롤, pH 7.4)의 침대 볼륨 단백질 바인딩 amylose 수 지를 세척. 얼음 처럼 차가운 버퍼 D (150 m m NaCl, 10% 글리세롤, 50 mM HEPES, 0.5 m m DDM, 0.1 μ g/mL asolectin, pH 7.4)의 10 침대 볼륨 씻어.
      참고: 이전에 세척, 세제 또는 지질, 질소 제거 없이 버퍼 D를 드. Degasification, 후 DDM와 asolectin를 추가 합니다.
    4. 0.5 mL 분수와 eTRPV1 단백질을 elute, 얼음의 5 mL, 최대 degassed 버퍼 D, 20 mM 糖 보충. 만약에 가능 하다 면, 세척 및 4 ° c.에서 차입을 수행
    5. 280 nm 파장에서 흡 광도 측정 하 여 단백질 양을 계량.
      참고:이 프로토콜 문화의 리터 당 단백질의 0.5 ~ 1.0 mg을 생성합니다. 각 eTRPV1 단일-시스테인 돌연변이 단백질 수확량이 다 수 있습니다. EPR 및 사슴 실험, 성장 4 \u2012 6 L 문화.

5. eTRPV1 단일-시스테인 Mutant Site-Directed 레이블 회전

  1. 원심 필터 단위를 사용 하 여 포함 하는 eTRPV1 분수 집중 (컷오프 = 100 kDa) 최대 2 \u2012 2.5 mg/mL (4 ° C에서 2 분 동안 7000 x g의 주기)를 라벨에 대 한.
  2. DMSO에 100 m m 재고 솔루션에서 집중된 단백질 (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) 메 틸 methanethiosulfonate (MTSSL) 스핀 라벨의 사진 어 금 니 과잉 (3 번, 매 30 분)를 추가 (eTRPV1 모노 머: MTSSL 1시 10분에 어 금 니 비율) 17. 1 h 30 분, 야간 보육 4 ° c.에 의해 다음에 대 한 실시간 반응 어둠 속에서 계속
    참고:이 단계에서 MBP는 하룻밤 스핀 라벨 인큐베이션 기간 동안 TEV 프로 테아 제를 추가 하 여 제거할 수 수 있습니다.
  3. 크기 배제 크로마토그래피 열 부하 회전 표시 eTRPV1 equilibrated 버퍼 e (150 m m NaCl, 20 mM HEPES, 0.5 m m DDM, pH 7.4), 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템에 의해 제어. 포함 하는 eTRPV1 tetramer 분수를 수집 합니다.
    주: 재구성 효율성을 줄일 수로이 단계에서 10% 글리세롤을 포함 하지 마십시오.
  4. 280 nm 파장에서 흡 광도 측정 하 여 단백질 양을 계량.
  5. SDS 페이지 젤 (젤 얼룩-무료, 4 \u2012 20%)를 실행 하 여 샘플의 순도 평가 합니다. 이 예제는 이제 솔루션 및/또는 proteoliposomes 분 광 측정에 대 한 준비.

6. eTRPV1 단일 시스테인 돌연변이 재구성 회전 표시

  1. 10 mg 1 h 40 ° c.에 대 한 진공 (≤100 mbar)에서 회전 증발 기를 사용 하 여 asolectin의 건조 Asolectin 리를 하려면 버퍼 F (200 m m NaCl, 5mm MOPS, pH 7.4)의 1 mL을 추가 하 고 15 분 또는 때까지 샘플은 균질 혼합물을 sonicate.
  2. 2mm의 최종 농도에 DDM을 추가 하 여에 리를 불안정 하 게 하 고 실시간에 30 분 동안 품 어
  3. 2 mg/mL에서 레이블이 지정 된 단백질을 집중 하 고 1:5 단백질/지질 비율 (질량: 질량)을 사용 하 여 리에 추가.
    주의: 그것은 스핀 라벨 효율 높은 단백질 침전 수와 낮은 농도에 감소 이후 앞서 언급 한 단백질 농도 유지 하는 것이 중요.
  4. DDM 임계 micelle 농도 (CMC)에 단백질/Liposome 혼합물을 조정 하 여 부드러운 동요와 4 ° C에서 밤새 품 어 버퍼 F를 추가 합니다.
  5. 이중 버퍼 F와 순차적으로 실시간에 부드러운 동요와 1 h 간격 비 극성 폴리스 티 렌 adsorbent 구슬 (30mg, 50mg, 및 80 mg)의 3 개의 aliquots를 추가 하 여 제거 세제 단백질/Liposome 혼합물의 볼륨
  6. 비즈를 제거 하는 ultracentrifuge 튜브에 proteoliposomes 혼합물을 전송 열 필터 (중력 흐름 크로마토그래피 칼럼)에 혼합물을 로드 합니다. 1 h 4 ° c.에 대 한 100000 x g에서 샘플을 원심 상쾌한 무시 하 고 버퍼 f.의 30 μ에 펠 릿 resuspend
    참고: 샘플은 분 광 분석 및 Xenopus oocytes에 주입에 대 한 준비. 샘플 같은 날 사용할 수 없습니다, 플래시 동결 그들 액체 질소와-80 ° c.에 게
  7. Proteoliposomes-Xenopus oocyte 전기 생리학26,32
    1. 50 주사 Xenopus oocytes 섹션 2.2에에서 설명 된 대로에 스핀 표시 된 proteoliposomes의 다른 희석의 nL.
    2. 2.3.10 섹션에 설명 된 대로 주입의 12 h 후 TEVC 측정을 수행 합니다.
  8. 분 광 측정 및 분석 (섹션 7)로 이동 합니다.

7. 사슴 및 EPR Spectroscopies

  1. 이중 전자-전자 공명 (사슴)의 분광학
    1. Q-밴드 주파수 (34 g h z)와 83 °33제조업체에서 제공한 소프트웨어 사용 하 여 데드 타임 무료 4 펄스 시퀀스는 10 W 앰프를 갖춘 펄스 EPR 분석기에서 사슴 측정을 수행 합니다.
    2. 곳을 알아내는-보호에 대 한 30% (v/v) 글리세롤과 버퍼 E (단계 5.5)에서 세제 정화 eTRPV1 스핀 표시 된 시스테인 돌연변이의 50 µ M를 보충 한다.
    3. 간단한 저속 원심 분리 (100 x g)에 의해 봉인된 석 영 모 세관 튜브와 튜브의 아래쪽 스핀으로 샘플을 로드 합니다.
    4. 샘플을 동결에 액체 질소로 모 세관 튜브를 놓습니다. 이 시점 이후 측정-80 ° C에서 샘플을 저장할 수 있습니다.
    5. 마이크로파 공 진 기에 직접 샘플을 놓고 다시 10 \u2012 위한-83 ° equilibrate 그것은 20 분.
    6. 표준 4 펄스 사슴 프로토콜, mw1 (π/2)를 사용 하 여 샘플 측정-τ1-(π) mw1-τ1-(π) mw2-τ2-(π) mw1-τ2-에코34. (Π/2) mw1 및 (π) mw1 펄스 길이 10와 20 ns, 각각, 그리고 40 (π) m w 2에 대 한 ns. 63 mhz 주파수 분리를 설정 합니다.
      참고: 기본 사슴 부패 데이터는 집에서 만든 소프트웨어 (예: Matlab에) 스핀 레이블을19,35간의 거리를 설명 하기 위해 가우스 분포의 합 가정 하 분석할 수 있습니다.
  2. 연속파 (CW) EPR 분광학
    1. 제조 업체 소프트웨어를 사용 하 여 X-밴드 (9.6 g h z) 분석기에 RT에서 CW EPR 실험을 수행 합니다.
    2. 물 냉각 장치, 콘솔, 그리고 자석 전원 공급 장치를 켜서 악기를 시작 합니다. 소프트웨어 악기를 연결, 악기 튜닝에 놓고 워밍업 악기에 대 일 분 이상 기다려야 합니다.
    3. 모 세관 동작을 사용 하 여 25 µ L 유리 모 세관 튜브로 5.5 단계에서 20 µ L의 샘플을 로드 하 고 실 란 트와 튜브의 끝 인감.
    4. 전자 레인지 강에 모 세관 튜브를 로드 하 고 비판적으로 부부는 소프트웨어의 자동 조정 기능을 사용 하 여 수동 또는 자동으로 공.
    5. 표준 계기 조건 하에서 첫 번째 파생 스펙트럼 수집: 100 kHz 마이크로파 변조, 1.6 G 자기장 변조, 그리고 10 mW 마이크로웨이브 파워.
    6. 데이터 분석 및 프레 젠 테이 션, 배경 스펙트럼을 수정 하 고 이중 적분의 피크-피크 값으로 스펙트럼을 나누어 정규화 합니다.
    7. 첫 번째 파생 흡수 스펙트럼 (ΔHo-1)36의 중앙 선 두께의 역함수 값을 측정 하 여 스핀 레이블 이동성을 결정 합니다.

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결과

최소한의 시스테인-덜 TRPV1 구성 (eTRPV1) 및 단일-시스테인 돌연변이의 기능 특성

분 광 연구 향한 첫 번째 단계 엔지니어 및 시스테인-덜 단백질 구조 (그림 2A) 기능 및 단백질의 생 화 확 적인 금액을 산출 하는 특성입니다. eTRPV1는 Ca2 + 이미징 및 TEVC (그림 2B-C)에 의해 결정 된 대로 작동 합니다. 또한, eTRPV1 EPR 및 사슴 실험 (0.5-1 mg Sf9 셀의 리터 당)에 대 한 세제 정화 단백질의 충분 한 양을 제공 한다26. 소개 하는 특정 단백질 영역에서 단일 시스테인 그들의 기능에 영향을 수 있습니다.

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토론

표현과 포유류 막 단백질의 정화에 대 한 현재 기술 분 광 연구14,15,,1642단백질의 충분 한 양을 얻을 수 만들었습니다. 여기, 우리 표현, 정화, 다시 구성, TRPV1에 분 광 분석을 수행 하는 이러한 기술을 적응 시켰다.

프로토콜에 중요 한 단계 중 아래는 TRPV1에 대 한 트러블 슈팅을 수행한 우리 하 고는 다른 단백질을 위해 조정 될 수 있습니다. 0.5-1 mg/mL 단백질 세제 정화;의 생성 하는 템플릿을 생성 하려면 DNA 시퀀스 수정 미만 0.5 mg/mL 단백질의 생성 하는 템플릿, 돌연변이 당 해야 할 것 이다 곤충 세포 문화 6 리터 이상 성장 이후 도전적. 단백질 해야 집중 될, 이상 2 mg/mL, 스핀 라벨 효율 증가...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 EPR 및 사슴 분석기에 대 한 액세스를 제공 하기 위한 박사 H. Mchaourab와 박사 T. 로젠바움 전장 시스테인-덜 TRPV1 플라스 미드를 제공 하기 위한 매우 감사.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
QuikChange Lightning Site-Directed 돌연변이 유발 키트Agilent Technologies210519-5
2-프로판올(이소프로판올)Fisher ScientificA416
알부민 소 혈청(BSA)GoldBio.comA-420-10
아밀로스 수지NEBE8021L
아프로티닌GoldBio.comA-655-25
대두에서 아솔렉틴시그마11145
Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템Invitrogen Life Technologies10359016
Biobeads SM-2 흡착제 Bio-Rad152-3920
붕규산 유리 피펫(3.5'')(난모세포 삽입)Drummond Scientific3-000-203 G/X
붕규산 유리 피펫(난모세포 기록)Sutter InstrumentB150-110-10HP
CaCl2 2H2OFisher ScientificC79
카르베니실린(디소듐)GoldBio.comC-103-5
Cellfectin 시약Invitrogen Life Technologies10362-010
cellSensOlympus
클로로포름피셔 사이언티픽C606SK
콜라겐 분해 효소 타입 1Worthington-BiochemLS004196
CritisealVWR18000-299
D-(+)-GlucoseSigma G8270
D-(+)-말토오스 일수화물Fisher ScientificBP684
DDM(n-docecyl-B-D-말토피라노사이드)AnatraceD310S
고포도당 매체(Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 매체)시그마D0572 
일회용 PD-10 탈염 컬럼GE 헬스케어45-000-148
EGTA피셔 사이언티픽O2783
태아 소 혈청Invitrogen Life Technologies10082-147
Fluo-4 AMLife TechnologiesF-14201
GenCatch Plus 플라스미드 DNA 미니 준비 키트Epoch Life Science, Inc2160250
GenCatch PCR Cleanup KitEpoch Life Science, Inc2360050
Gentamicin SulfateLonza17-518Z
유리 모세관 (25 µ l)VWR53432-761
유리 플라스크 2800 mLPyrex USA4423-2XL
글리세롤피셔 바이오 시약BP229
HEK293S GnTl-ATCCCRL-3022
HEPESSigma H4034
IPTG(이소프로필-티오-B-갈락토시드)GoldBio.comI2481C25
카나마이신 설페이피셔 사이언티픽BP906-5
KCl피셔 케미컬P217
LB 육수, 밀러피셔 바이오 시약BP1426
루펩틴 헤미설페이트GoldBio.comL-010-5
Lipofectamine 2000Invitrogen Life Technologies11668-019
MgCl2 6H2OFisher ScientificBP214
MgSO4 7H2OFisher ScientificBP213
mMESSAGE mMACHINE T7 KitAmbionAM1344
MOPSFisher bioReagentsBP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) 메틸 MethanethiosulfonateToronto Research Chemicals, IncO873900
NaClFisher ChemicalS271
Opti-MEMLife Technologies31985-062
Pepstatin AGoldBio.comP-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%)PromoKine   CA707-59004
PMSFGoldBio.comP4170
폴리-L-라이신 용액Sigma-AldrichP4707
Rneasy 미니 키트Qiagen74104
밀폐형 모세관VitroCom특별 주문
SF-900 II SFM(곤충 세포 배지)Gibco, Life Technologies10902-088
Sf9 Invitrogen Life Technologies11496-015
대두 극성 지질 추출물Avanti Polar Lipids, Inc541602C
SucroseFisher ScientificS25590
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare29091596
TCEP HClGoldBio.comTCEP1
Tetracyclin HydrochlorideFisher ScientificBP912-100
트리스 베이스Fisher BioReagentsBP152
트립톤Difco0123-01
X-galGoldBio.comX4281C
Xenopus 난모세포NascoLM00935M
XL1 - Blue Competent CellsAgilent Technologies, Inc200249
효모 추출물Difco0127-01-7
Econo-Pack 크로마토그래피 컬럼Bio-Rad7321010
Mini-PROTEAN TGX 스테인 프리 캐스트 겔Bio-Rad17000436
pFastBac1 발현 벡터Invitrogen Life Technologies10360-014
DH10Bac 역량 세포Invitrogen Life Technologies10361-012
Critiseal 모세관 실란트Leica Microsystems02-676-20
ABI 모델 3130XL 유전자 분석기Applied Biosystems4359571
Transfer pipeteFishebrand13-711-9AM
Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
트

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