Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 Mechanobiology 연구에 대 한 부드러운 실리콘 기판의 강성 측정

요약

Kilopascal 범위에 있는 강성과 기판은 순수 관련 마이크로 환경 강성을 세포의 반응을 유용 합니다. Widefield 형광 현미경을 사용 하 여, 소프트 실리콘 젤의 영의 계수는 들여쓰기를 사용 하 여 적합 한 영역을 확인할 수 있습니다.

초록

인간의 신체에서 부드러운 조직 일반적으로 kilopascal (kPa) 범위에 강성을 있다. 따라서, 실리콘 및 히드로 유연한 기판 경작 조건 비보에 부분적으로 모방 하는 실제 microenvironment에서 셀에 대 한 유용한 기판 될 입증 되었습니다. 여기, 우리가 영의 계수 등방성 선형 탄성 기판 mechanobiology 연구에 일반적으로 사용의 특성화에 대 한 간단한 프로토콜 제시. 준비 하는 페 트리 접시 또는 뻣 뻣 한 실리콘에 부드러운 실리콘 기판, 형광 구슬 실리콘 기판의 윗 표면 코팅,는 형광 이미징 (중력)에 의해 상면을 밀리미터 단위 구체를 사용 하 여 프로토콜 구성 들여쓰기 실리콘에 구슬 표면 형광 현미경을 사용 하 여 및 실리콘 기판의 영의 계수 계산 결과 이미지를 분석 합니다. 기판의 상면 (형광 구슬) 뿐만 아니라 응용 세포 외 기질 단백질 커플링 실리콘 기판을 셀 도금 및 견인 힘 현미경 실험을 사용 하 여 후속 연구에 쉽게 사용할 수 있습니다. 부드러운 실리콘 베이스로 페 트리 접시 대신 뻣 뻣 한 실리콘의 사용을 외부 뻗 기를 포함 하는 mechanobiology 연구를 사용 하 여 수 있습니다. 이 프로토콜의 구체적인 장점은 많은 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 widefield 형광 현미경,이 절차에 필요한 주요 장비입니다. 우리는 다른 탄성 계수의 부드러운 실리콘 기판의 영의 계수를 측정 하 여이 프로토콜을 보여 줍니다.

서론

부드러운 조직에 세포의 강성은 kilopascal 범위¹, 누구의 강성은 몇 배나 더 높은 조직 문화 요리 달리 마이크로-환경에 거주. 세포 외 기질 단백질 코팅 부드러운 기판에 초기 실험 기판 강성 영향 어떻게 세포 이동으로^2,3아래 기질을 보여주었다. 사실, 기판 강성 근본적으로 영향을 퍼지는 생 화 확 적인 신호를 유사한 방식으로 셀 기능⁴ . (세포 외 기질 단백질 코팅) polyacrylamide 젤은 (물 permeating) hydrogels mechanobiology 연구⁵대 문화 기질 세포로 광범위 하 게 사용 되었습니다. 입니다 (PDMS), 가장 일반적인 실리콘 (polysiloxane), 널리 사용 되었습니다 뻣 뻣 한 실리콘으로 megapascal 범위 강성과 마이크론 스케일 제조⁶. 더 최근에, 소프트 실리콘 기판 더 순수 관련 kilopascal 범위에서 경직 된 mechanobiology 연구^7,8....

프로토콜

1입니다. 부드러운 실리콘 기판의 제작

1. 1.75 g A 구성 요소 및 B 구성 요소의 1.75 g으로 무게 (A:B = 1:1) 부드러운 실리콘 엘라 스토 머 키트 (폴리스 티 렌)를 사용 하 여 트레이 무게.
2. A 구성 요소 무게 트레이에 B 구성 요소에 추가 하 고 적절 한 주걱 스틱을 사용 하 여 5 분 동안 함께 그들을 섞는다.
3. 35 mm 페 트리 접시 위의 혼합물을 추가 합니다. 몇 분 동안 배양 접시에 걸쳐 균등 하 게 확산 혼합물을 허용 한다.
   참고: 페 트리 접시 지름과 부드러운 실리콘의 양을 부드러운 실리콘 두께 결정 합니다. 여기, 두께 약 3.5 m m; 될 것입니다. 토론 섹션에서 고무 두께 선택 하는 것에 대 한 더 많은.
4. 모든 기포를 제거 하려면 15 분 동안 진공 챔버에, 뚜껑 실리콘 혼합물으로 페 트리 접시를 놓습니다. 이 시간 동안 미리 70 ° c 뜨거운 접시가 열
5. 핫 플레이트에는 70 ° C에 도달 하면, 유리 슬라이드에 놓고 유리 슬라이드에 실리콘 혼합물으로 페 트리 접시를 놓습니다. 실리콘을 하자 30 분 동안 70 ° C에서 치료. 로 페 트리 접시 녹아 있습니다 핫 플레이트에 직접 폴리스 티 렌 접시를 배치 하지 마십시오.

결과

위에서 자세히 설명 하는 프로토콜을 사용 하 여, 우리 준비 35 mm 페 트리 접시에에서 부드러운 실리콘, 30 분 동안 70 ° C에서 그것을 치료 하 고 형광 microbeads 결합 (및 콜라겐 나) 개요로 서 그림 1에 표시 된 위쪽 표면에. 깊은 UV 기판¹³커플링 최종 단백질에 대 한 이전 사용 되었습니다. (나) 경화 조건 여기에 사용 되는이 부드러운 실리콘 및 (II) 들여쓰기 측정 관련 소프트 실리콘 하루의 과정을 통해 조금 더 치료 예상 대로 다음날에 수행 됩니다.

실리콘 표면의 구형 들여쓰기를 특성화 하는 다양 한 매개 변수는 그림 2A에 표시 됩.......

토론

영역 들여쓰기 메서드는 쉽게 구현할 수, indentor의 선택과 부드러운 실리콘 샘플의 두께에 주의 지불 한다. 영의 계수를 계산 하는 데 사용 하는 방정식 조건¹¹의 세트에서 유효 하 고 이들은 일반적으로 실리콘 샘플의 두께 indentor 반지름의 > 10% 일 때 만족 하 고 < indentor 반지름 x 13 ~. 우리는 발견 실리콘 두께 5-10 x의 indentor 반경 했다 좋은 선택, 어떤 점에서 샘플 두께 너무 높은 (즉, 객관적인 작동 거리 되지 않는다 제한) 계산된 강성 했다 또한 너무 민감한는 실리콘 두께의 정확한 값입니다. 구형 indentor의 선택 또한 들여쓰기 깊이 δ indentor 반지름의 < 10%로 서 실리콘 두께의 < 10% 되도록 해야 합니다. 염두에 두고 이러한 고려 하 여 다른 물자 및 직경의 indentors 부드럽고 엄격한 실리콘의 강성을 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 들여쓰기 깊이의 결정이이 프로토콜의 가장 중요 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CY 52-276 A/B 실리콘 엘라스토머 키트	Dow Corning	CY 52-276	실온에서 보관
Thermo Scientific Pierce EDC	Fisher Scientific	PI22980	-20°C에서 보관; C
써모 사이언티픽  Pierce Sulfo-NHS crosslinker	Fisher Scientific	PI-24510	4°에 보관; C
카르복실 형광 분홍색 입자, 0.4-0.6 &마이크로; m, 2mL	스페로텍, Inc.	CFP-0558-2	4°C에 보관; C,
1.0mm 산성 세척 지르코늄 비드	OPS Diagnostics LLC	BAWZ 1000-250-33
오존 진공 청소기가 있는 딥 UV 챔버	Novascan Technologies, Inc.를	PSD-UV4, OES-1000D
광시야 형광 현미경	Leica Microsystems	DMi8
콜라겐 I, 쥐 꼬리	Corning	354236	재고 농도 = 4 mg/ml; 4°C에서 보관; C
ImageJ-NIH	N/A	공용	도메인 소프트웨어

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