단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

Tabitha A. Peterson; Mark A. Stamnes; Robert C. Piper

doi:10.3791/57801

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방법 논문

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

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DOI:

10.3791/57801

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2018년 6월 6일

Tabitha A. Peterson¹ , Mark A. Stamnes¹ , Robert C. Piper¹

¹Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

이 논문에서

요약

효 모 2 잡종 스크린의 일괄 처리 먹이 융해 단백질의 매우 복잡 한 세트로 여러 미끼 단백질의 상호 작용 프로필의 직접 비교 가능합니다. 여기, 우리는 새로운 시 약, 세련 된 방법과 같은 화면에 대 한 그들의 사용을 구현 하는 방법을 설명 합니다.

초록

효 모 2 잡종 분석 결과 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용에 대 한 심사는 긴 효과적인 도구, 하지만 사용 크게 상호 작용 후보자의 라이브러리에서 풍성 하 게 매우 높은 선호도 인터의 발견에 제한 되었습니다. 전통적인 형식에서 효 모 2 잡종 분석 결과 분석 낮은 엄중에서 실시 하는 경우에 낮은 선호도 인터를 찾을 수 있습니다 너무 많은 식민지를 얻을 수 있습니다. 또한, 다른 미끼 플라스 미드에 대 한 동일한 라이브러리의 포괄적이 고 완전 한 심문 없이 비교 분석 얻을 수 없다. 이러한 문제 중 일부 기준점과 먹이 라이브러리를 사용 하 여 해결할 수 있습니다, 있지만 비용과 같은 화면을 작동 하는 데 필요한 인프라는 금지 될 수 있습니다. 대신, 우리 동시에 과도의 수십을 밝히기 위해 효 모 2 잡종 분석 결과 적응 및 정적 단백질 상호 작용 전략을 활용 한 화면 내에서 불리 DEEPN (평가의 단백질 네트워크를 위한 동적 농축)을 통합 높 처리량 DNA 연속 그리고 상호 작용 파트너 인코딩할 플라스 미드의 인구의 진화에 따라 계산 합니다. 여기, 우리 사용자 지정된 시 약 및 DEEPN 화면 쉽고 비용 효율적으로 실행 될 수 있는 프로토콜을 설명 합니다.

서론

세포 생물학 과정의 완전 한 이해를 찾는 그들의 분자 메커니즘의 기반이 되는 단백질 상호 작용 네트워크에 의존 합니다. 단백질 상호 작용을 식별 하는 한 가지 방법은 효 모 2 잡종 (Y2H) 분석 결과, 관심의 두 단백질 도메인 바인딩할 다른¹일단 작동 공상 전사 요소를 조립 하 여 작동 하는. 전형적인 Y2H 화면 인코딩 상호 작용 단백질에 transcriptional 활성 제를 융합 하는 플라스 미드의 두 도서관 효의 인구를 생성 하 여 수행 됩니다 (예., '먹이' 퓨전 단백질)와 주어진된 '미끼' 플라스 미드 단백질의 구성 관심사의 DNA 바인딩 도메인 (예를 들면,에 Gal4 상류 활성화 순서 Gal4 DNA 바인딩 도메인)에 융합. Y2H 접근의 주요 장점 중 하나 그것은 상대적으로 쉽게 하 고 일상적인 분자 생물학 작업²에 대 한 일반적인 실험실에서 수행 하는 저렴 한 장비입니다. 그러나 때 전통적으로 수행, 사용자 긍정적인 Y2H 상호 작용에 대 한 선택 사항에 따라 발생 하는 개별 식민지를 샘플링 합니다. 이 심각 하 게 조사 될 수 있는 라이브러리 '먹이' 클론의 수를 제한 합니다. 이 문제는 때 특정 상호 작용 먹이의 풍부한 매우 낮은 풍부한 먹이 플라스....