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방법 논문

복합 체적 망막 이미징 오블리크 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy (오슬로) 및 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)

8.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57814

⸱

2018년 8월 4일

 ,  , 
1Department of Medicine, Boston University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기, 우리 소설 영상 복합 플랫폼을 사용 하 여 큰 시야 (FOV) 3 차원 (3D) 형광 및 10 월 망막 이미지를 얻을 프로토콜 제시. 시스템 설치 프로그램, 정렬 방법 및 운영 프로토콜을 소개 합니다. Vivo에서 화상 진 찰 설명 될 것입니다, 그리고 대표적인 결과 제공 됩니다.

초록

형광 이미징 안과에서 널리 이용 된다, 하는 동안 큰 시야 (FOV) 3 차원 (3D) 형광 망막 이미지는 여전히 그들을 z 스태킹 요구할 것 때문에 형식 이미징-의 상태--예술 망막으로 큰 도전 체적 데이터 집합을 컴파일하십시오. 새로운 광학 일관성 단층 촬영 (OCT) 및 10 월 제품은 (OCTA) 시스템 3 차원 (3D) 해 부 및 혈관 이미지를 제공 하기 위해 이러한 제한을 극복 하지만 10 월의 염료 무료 자연 누설 혈관의 지표를 시각화 수 없습니다. 부전입니다. 이 프로토콜 소설 간접을 스캐닝 3 차원 체적 형광 망막 영상 제공 하는 레이저 ophthalmoscopy (오슬로) 기술에 설명 합니다. 이미징 시스템의 설정을 간접 비둘기 꼬리 슬라이더에 의해 검사를 생성 하 고 형광 단면 이미지를 감지 하는 각도에서 최종 이미징 시스템을 정렬. 시스템 검색 방법, 레이저를 사용 하며 따라서, 10 월의 쉬운 법인은 보완 체적 구조 이미징 형식으로 Vivo에서 화상 진 찰 쥐 망막에는 여기에 보여 줍니다. Fluorescein 솔루션은 체적 fluorescein angiography (vFA) 생산 정 맥 주입 됩니다.

서론

안과 및 비전 과학 크게 혜택을 현대 광학 이미징 기법에서 때문에 망막 빛으로 쉽게 액세스할 수 있습니다. 형광 망막 영상 진단 및 둘 다 미국에 있는 장 님의 원인 선도 chorioretinal 혈관 질병 연령 관련 황 반 변성 (AMD) 및 당뇨 망막 병 증 (DR) 등의 관리에 필수적인 도구입니다.

그러나, 그것은 여전히 큰 시야 (FOV), 3 차원 (3D) 망막 형광 이미징 사용 하 여 이미지를 얻으려고 도전. 저 사진 깊이 해결 기능이 없는 확산 빛을 거부 하지 않습니다. 그 결과, 다른 깊이에서 신호를 혼합 하 여 이미지 품질을 줄일 수 있습니다. 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy (SLO)와 confocal 제어1를 사용 하 여 확산된 한 빛의 효과 감소 하는 confocal SLO (cSLO) 수 있습니다. 그러나, SLO 또는 cSLO 초점의 깊이의 제한으로 인해 3D 인간의 망막 이미지를 얻기 어렵습니다. 적응 광학 SLO (AOSLO)는 인간의 눈으로 도입 wavefront 착오에 대 한 수정 하 여 뛰어난 해상도 콘트라스트를 제공할 수 있습니다. 그러나, AOSLO는 여전히 필요 z 스태킹 체적 영상2. 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)3 및 10 월 제품은 (OCTA) 시스템 제공 하는 3 차원 (3D) 해 부 및 혈관 이미지4,,56, 하지만 염료 무료 자연 이러한 제한을 극복합니다 10 월의 누설 혈관 장애의 지표를 시각화 수 없습니다.

이 프로토콜 3D 체적 형광 망막 화상 진 찰, 즉 경사 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy (오슬로)에 대 한 새로운 복합 플랫폼을 설명 합니다. 이 이미징 시스템에서 비둘기 꼬리 슬라이더에 의해 생성 되는 간접 검사 하 고 최종 이미징 시스템 단면 이미지 크로스 형광을 검출 하는 각도에 정렬 됩니다. 레이저 스캐닝 방법, 사용 하 고 이러한 기술을 보완 체적 구조 이미징 적임으로 oct 쉽게 설립 허용. 현재 깊이 해상도 쥐 망막에서 약 25 µ m 이며, 보기의 필드는 30 ° 이다. 기본적으로, 오슬로 형광 버전 10 월의 고 동시에 10 월 결합 될 수 있다 및 큰 FOV 동안 OCTA.

이 프로토콜에서 오슬로, 정렬 및 건설의 방법, vivo에서 쥐 망막의 이미징 방법 및 대표 결과의 설정을 설명 합니다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) 보스턴 의료 센터에 의해 승인 되었습니다.

1. 시스템 설치

  1. 오슬로 시스템
    1. Supercontinuum 레이저 소스를 사용 하 여 시스템 레이저 소스.
      1. Dichroic 거울 (DM1)에 의해 더 높은 파장 범위 (650-2000 nm)에서 보이는 빛 범위 (450-650 nm)를 구분 합니다. 편광 빔 스플리터 (PBS)를 통과 하는 광선 후 흩어진 프리즘의 쌍으로 스펙트럼을 확장 합니다.
      2. 여기 파장 범위 (475-495 nm)를 선택 하는 슬릿을 배치 합니다. 반사 거울을 사용 하 여 프리즘 쌍을 다시 필터링 된 광선을 반영 하 고 다음 단일 모드 광섬유 (SMF 1)으로 빛을 커플.
      3. 분 광 계를 사용 하 여 단일 모드 광섬유의 출력에서 파장 선택 확인.
    2. 그림 2와 같이 두 개의 캐스케이드 광섬유 커플러를 단일 모드 광섬유를 연결 합니다. 두 번째 섬유 커플러에서 섬유 출력 포트 중 하나는 오슬로 시스템에 빛을 제공합니다.
    3. 오슬로 시스템에서 먼저 레이저를 당기기.
      1. 검 류 계 미러 (GM1)으로 레이저를 편향. 릴레이 1:1 망원경 시스템에 의해 두 번째 검 류 계 미러 (GM2) 레이저 그리고 3:1 망원경 시스템에 의해 눈의 눈동자를 더 릴레이.
      2. 시스템 내에서 3:1 망원경 형광 신호에 맞게 dichroic 거울 (DM2)를 설치 합니다.
    4. 광 축 오프셋을 간접 조명 그림 3에서 같이 검색을 만들 사용자 지정된 비둘기 꼬리 슬라이더에 3:1 망원경 시스템 및 dichroic 거울 (DM2)를 탑재 합니다. 캘리퍼스를 사용 하 여 정확 하 게 제어할 원하는 대로 오프셋된 길이.
    5. 형광 이미징 광학 경로입니다.
      1. Dichroic 거울과 느린 스캔 스캔 드 3 검 류 계 미러 릴레이 의해 형광을 반영 합니다.
      2. 또 다른 1:1 망원경 시스템 이미징 대물 렌즈에 빛을 릴레이 합니다. 번역 단계에서 위의 광학을 설치 합니다.
        참고: 두 개의 추가 번역 단계 3 검 류 계 미러 (GM3)는 이미지를 최적화 하기 위한 자유도에 중복을 제공 하기에 설치 됩니다.
    6. 3 자유도 (회전, 그리고 번역의 두 축)은 무대에서 최종 이미징 시스템을 탑재 합니다. 평면 카메라를 사용 하 여 횡단면 형광 이미지를 캡처합니다.
  2. 광학 일관성 단층 촬영 시스템
    1. 동일한 supercontinuum 레이저 소스를 사용 하 여 시스템 레이저 소스.
      1. 가까운 적외선 (NIR) 범위 (650-900 nm) 나머지 빛 (650-2000 nm)에서 다른 dichroic 거울 (DM3) 구분 합니다. 긴 패스 필터를 사용 하 여 800-900 nm 대역폭 제한에. 단일 모드 광섬유 (SMF 2)에 빔 커플.
    2. 단일 모드 섬유 블루 오슬로 여기와 결합 하 여 두 개의 캐스케이드 광섬유 커플러의 다른 입력된 포트에 연결 합니다. 직접 변수 중립 밀도 필터 (VNDF), 분산 보상 접시와 반사 거울 OCT 참조 팔 두 번째 섬유 커플러의 두 번째 출력 포트에서 빛.
      참고: 빛 참조 팔에서 반환 그리고 눈 두 번째 광섬유 커플러에서 recombines 신호를 수집 하는 OCT 분석기에 전달 됩니다.
  3. 데이터 수집
    1. 사용 데이터 수집 시스템 소프트웨어를 LabVIEW에서 그리고 OCTA7,8,,910의 검사 프로토콜에서 수정 합니다. 각 B-스캔에 대 한 80% 듀티 사이클 500 단계와 치아 x를 제어 하는 아날로그 출력 보드 (AO1)에 의해 출력은 본 ' 빠른 스캐닝 미러, GM2.
    2. OCT에 대 한 데이터를 얻기 위해 각 단계에서 라인 스캔 카메라를 트리거 거울은 검색 방향을 전달에서 하는 경우에. 라인 스캔 카메라 17 µs에 대 한 노출 시간을 설정 합니다.
    3. OCTA 신호를 획득, 5 번 같은 B-스캔 위치에서 측정을 반복 합니다.
    4. 50 kHz에서 100 khz, AO 출력 속도 10 월 라인 속도 설정 합니다. Y 제어 ' 느린 스캔 거울, GM1, 램프 파형에 의해. GM1 드 느린 스캔 스캔 스캔 드 미러, GM3, 동기화.
    5. 다른 아날로그 출력 보드 (AO2) 한 형광 이미지 각 y에 의해 평면 카메라를 트리거 ' 위치. 이미지 크기 자르기 또는 증가 속도 감도 원하는 대로 이웃 픽셀을 빈.

2. 시스템 맞춤

  1. 블루 여기 파장 선택 오슬로 광원에서 슬릿을 조정 합니다. 주위에 스펙트럼 범위를 모니터링 하는 분석기를 사용 하 여 475-490 nm.
  2. 비둘기 꼬리 마운트 슬라이더 ~ 5 m m에 의해 광 축 변화를 조정 합니다. 이 쥐 눈동자에 오프셋 ~1.7 m m, 결과 망막에 ~ 15 °의 경사 각도에 의해 발생 합니다.
  3. 같은 5 m m 형광 검출 광학의 번역 단계를 조정 합니다.
  4. 최종 형광 이미징 시스템 ~ 30 ° 되도록 조정 합니다.
  5. 전력 측정기를 사용 하 여 광 출력을 측정 합니다. 블루는 오슬로 전원을 ≤0.2 mW 및 OCT 레이저 전원 ≤0.8 mW는 망막 손상을 일으키지 것입니다 있는지 확인 합니다.
    참고: ANSI 표준에 따라, 망막에 최대 허용 노출 (MPE)의 수준 이다 ~ 2mW7,8 빛 보이는 범위에서. Delori 그 외 여러분 에 의해 수식에 따라 9, MPE 근처 적외선 빛은 가시 광선 보다 약 2 배 높은 약 4 mW.

3. Vivo에서 동물 실험

  1. 12 주 남성 긴 에반스 쥐 유도 챔버로 전송 합니다. Isoflurane 기화에 의해 2 L/min의 유량과 10 분 동안 산소에 4.5 %isoflurane 쥐를 anesthetize.
    1. 인터 핀치 동안 철수 반사의 부족에 의해 결정 된 마 취의 깊이 확인 합니다.
  2. 유도, 후 5-축 (x, y, z 번역, yaw 및 피치) 보유자에 쥐를 놓습니다. 열띤된 무대, 순환 온수 담요 또는 장기간된 실험에 적합 한 다른 방법을 사용 하 여 추가 열을 제공 합니다. 실험의 나머지 부분 동안 2 리터/분의 유량과 isofluorane의 1.5%에서 마 취를 유지 합니다. 액티브 배기 유도 챔버를 사용 하지 않는 때 유도 챔버 청소 isoflurane에 스노 클 또는 backdraft 또는 하강 기류 테이블에 배치 되어야 합니다.
  3. 2 분 동안 1 %Tropicamide 안과 솔루션 눈동자 같은데요. 필요한 경우 추가 취에 대 한 쥐의 눈에 0.5% Tetracaine HCl 안과 솔루션을 적용 합니다. 실험 기간 동안 적어도 한 번 모든 분 상용 인공 눈물 moisturized 눈을 유지.
  4. Fluorescein 소금 (10 %w / w) 또는 FITC 주입 (10 %w / w) 멸 균 식 염 수에 희석 (0.1-0.3 mL) 1 mL를 꼬리 정 맥을 통해 주사기와 29 G 바늘.
  5. 레이저 소스를 켭니다. 장소는 중립 밀도 필터 정렬 하는 동안 블루 빛 자극을 감소. ~0.8 mW 수 10 월 빛과 푸른 빛의 전력을 측정 < 0.01 mW 백 내장의 형성을 피하기 위해.
  6. 검 류 계 스캐닝 및 맞춤 모드를 시작 합니다. 고정 된 레이저 각 막에 자리 만들려고 눈 볼의 높이 조정 합니다. 레이저에 대략 수직 눈동자의 테두리를 만들 수 쥐 눈 위치를 조정 하 고 오프셋 ~1.5 m m에 대 한 눈을의 꼭대기 센터 레이저.
  7. 10 월 이미지 최적의 품질에 도달할 때까지 더 동물 홀더를 조정 합니다. X에서 ' 단면 B-스캔 이미지 평면 나타나는지 확인 빠른 스캔 방향. Y을 전환할 때 ' 느린 스캔 방향, 단면 B-스캔 이미지 표시 기울어진, 비스듬한 검색으로 확인.
  8. 블루 라이트 여기에 중립 밀도 필터를 제거 하 고 실시간으로 카메라에서 피드를 모니터링 합니다. 교차 단면 형광 이미지 보여주는 혈관 다른 깊이에 나타나는 나타납니다.
    1. 최종 형광 이미징 최적의 초점을 도달 하는 시스템의 초점을 조정 합니다. 미세 조정 최적의 오슬로 이미지 품질에 도달 하는 측면 평면에서 눈 위치를 허용 합니다.
  9. 맞춤, 후 동시 OCTA와 체적 fluorescein angiography (vFA)를 시작 합니다.
  10. OCTA를 Matlab으로 오슬로 체적 이미지를 생성 합니다. 세부10이전 알고리즘 설명 합니다. 이미지 세분화 하 여 깊이 해결 망막 vasculatures를 생성 합니다.
  11. 완료 후는 이미징, 레이저 해제, 동물 하 고는 눈에 일부 안과 연 고를 적용 놓고 복구 상자에서 동물을 배치.
  12. 두지 마십시오 동물 무인 또는 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 기관 정책에 당.

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결과

그림 4a 쥐 망막의 단면 OCT 이미지를 보여줍니다. 그림 4b -4 c 를 동시에 취득 하는 OCTA 및 오슬로 vFA의 동일한 망막 단면 이미지를 표시 합니다. 오슬로 횡단면 FA를 유사한 10 월 B-스캔 수 있습니다. OCTA, 비해 오슬로 vFA 단면 이미지는 신경 섬유 층 (NFL)와 신경 절 세포 층 (GCL), 혈관과 모세 혈관 외부 plexiform 레이어 (OPL)에 명확 하 게 식별합니다. 그림 4 d 와 4 g OCTA 및 오슬로 vFA 이미지의 표면 층을 보여준다. OCTA, 달리 오슬로 vFA 이미지 (그림 4 g) 형광 방출 대비를 이용 하 여 모션 아티팩트 (수직 줄무늬...

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토론

여기, 우리가 오슬로 vivo에서 체적 형광 망막 상상 이상 30 ° FOV와 기법을 설명 했습니다. 10 월, 관리 인, 방법 이미징의 현재 표준에 비해 오슬로 비슷한 3D 이미징 기능을 제공 합니다 아직 10 월에 과민 하지 않다 형광 대비 수 있습니다. 오슬로의 장점은 하나의 래스터 스캔을 요구 하 고 따라서 구조 및 형광 체적 영상에 대 한 두 개의 상호 보완적인 기법을 제공 하는 10 월의 완벽 한 결합 수 있습니다.

이 프로토콜에서 좋은 이미지 품질을 얻기 위해 핵심은 쥐 눈의 선명도. 오슬로 이미지 가려진 경우 백 내장 형성 여부를 검사 합니다. 케 타 민/xylazine 마 취, 각 막 건조, 라이트 블루를 노출 등 여러 가지 요인 백 내장, 화질 저하 크게 것의 형성을 원인이 됩니다. 2 분 이상;에 대 한 라이트 블루를 지속적인 노출을 피하는 백 내장을 방지 하 인공 눈 눈물 적어도 한 번 모든 분을 적용 방지 각 막 건조; 눈 빛을 차단 하 여...

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공개 사항

지 이순신 오슬로 대 한 보류 중인 특허를 보유 하고있다. 다른 저자는 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

감사의 글

자금 인 NIH 5R01CA183101에서 하위 계약 뿐만 아니라 보스톤 의료 센터에서 에반스 의료 재단 자금에서 부 CTSI 파일럿 1UL1TR001430, 부 Joslin 파일럿 프로그램, 및 부 CTSI KL2TR001411를 부여 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Supercontinuum 레이저 소스NKT PhotonicsSuperK EXTREME EXU-OCT6
이색성 거울 (DM1)ThorlabsDMLP650R
이색성 거울 (DM2)ChromaZT514 / 1064rpc
이색성 거울 (DM3)ThorlabsDMLP900R
단일 모드 광섬유 (SMF 1)ThorlabsP3-460B-FC-2
단일 모드 광섬유 (SMF 2)ThorlabsP3-780A-FC-2
광섬유 커플러ThorlabsTW850R5A2
1:1 망원경 시스템ThorlabsAC254-100-A×
3:1 망원경 시스템ThorlabsAC254-150-A×
3:1 망원경 시스템ThorlabsAC254-50-A×
Galvo 미러 (GM1,GM2)ThorlabsGVS201×
De-sacn Galvo Mirrors (GM3)ThorlabsGVS011
대물 렌즈OlympusUplanSApo 20×/0.75
최종 이미징 시스템OlympusUplanFL N 10×/0.3
최종 이미징 시스템Computar12-36mm/1:2.8
CameraPCOPco.pixelfly usb
필터ThorlabsFEL0800
장착 연속 가변 ND 필터ThorlabsNDC-50C-4M-A
라인 스캔 카메라ThorlabsSPL2048-140K
아날로그 출력 보드 (AO1)National InstrumentPCI-6731
아날로그 출력 보드 (AO2)National InstrumentPCIe-6351
롱 패스 필터ThorlabsFEL0800
2222

참고문헌

  1. Webb, R. H., Hughes, G. W., Delori, F. C. Confocal scanning laser ophthalmoscope. Applied Optics. 26 (8), 1492-1499 (1987).
  2. Roorda, A., et al. Adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Optics Express. 10 (9), 405-412 (2002).
  3. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  4. de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5(2015).
  5. Jia, Y., et al. Quantitative Optical Coherence Tomography Angiography of Choroidal Neovascularization in Age-Related Macular Degeneration. Ophthalmology. 121 (7), 1435-1444 (2014).
  6. Chen, C. -L., Wang, R. K. Optical coherence tomography based angiography [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 1056-1082 (2017).
  7. Yi, J., Chen, S. Y., Shu, X., Fawzi, A. A., Zhang, H. F. Human retinal imaging using visible-light optical coherence tomography guided by scanning laser ophthalmoscopy. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3701-3713 (2015).
  8. Zhang, X. Y., et al. Dual-band spectral-domain optical coherence tomography for in vivo imaging the spectral contrasts of the retinal nerve fiber layer. Optics Express. 19 (20), 19653-19667 (2011).
  9. Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices. Journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision. 24 (5), 1250-1265 (2007).
  10. Zhang, L., et al. Volumetric fluorescence retinal imaging in vivo over a 30-degree field of view by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO). Biomedical Optics Express. 9 (1), 25-40 (2018).

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