설치류 쥐 모터 피 질에서 Microelectrode 주입으로 인 한 기능적 적자를 평가 하기 위해 테스트 행동

요약

우리는 쥐의 모터 피 질에서 microelectrode 주입 하면 즉각적이 고 지속적인 모터 적자는 나타났습니다. Microelectrode 이식 수술 및 3 설치류 행동 작업 모터 피 질에 주입 한 손상 때문에 또는 총 모터 기능에 잠재적인 변화를 명료 하 게 하는 방법 여기 개요 제안.

초록

뇌에 이식 하는 의료 기기는 엄청난 잠재력을 만요. 두뇌 기계 인터페이스 (BMI) 시스템의 일환으로, intracortical microelectrodes 신경의 개인 또는 작은 그룹에서 활동 전위를 기록 하는 기능을 보여 줍니다. 이러한 기록 된 신호를 환자를 허용 하거나 컴퓨터, 로봇 팔 다리, 그리고 그들의 자신의 사지를 제어 성공적으로 사용 되었습니다. 그러나, 이전 동물 연구는 두뇌에 있는 microelectrode 주입 주변 조직 손상 뿐만 아니라 기능적인 적자 발생 시킬 수 있습니다 나타났습니다. 여기, 우리는 일련의 행동 테스트 intracortical microelectrodes 이식 쥐의 모터 피 질에 따라 잠재적인 모터 장애 척도를 논의. 오픈 필드 그리드, 사다리 교차점, 및 그립 강도 테스트 메서드 microelectrode 이식에서 발생 하는 잠재적인 합병증에 관한 귀중 한 정보를 제공 합니다. 행동 테스트의 결과 병 적인 결과 인접 한 조직에서이 절차의 영향에 추가 정보를 제공 하는 끝점 조직학와 상관 된다.

서론

원래 intracortical microelectrodes 지도, 두뇌의 회로 그리고 기능 출력¹을 생산 하기 위해 사용 될 수 있는 모터 의도의 탐지를 가능 하 게 하는 유용한 도구도 개발에 사용 되었다. 감지 기능 출력 제어 로봇 또는 컴퓨터 커서^2,3 의 척수 상해, 뇌성 마비, 루 경화 증 (ALS), 또는 다른 운동 제한 조건에서 고통 개인을 제공할 수 있습니다. ^4,,56, 팔 또는 그들의 자신의 장애 사지⁷기능을 복원 합니다. 따라서, intracortical microelectrode 기술 유망 하 고 신속 하 게 성장 하는 분야⁸로 떠오르고 있다.

때문에 분야에 성공, 임상 연구 진행 향상 BMI 기술^5,,910의 가능성을 이해 하는. 뇌의 신경 세포와의 커뮤니케이션의 모든 잠재력을 실현 하 여 재활 응용 프로그램은 무한 한⁸로 인식 됩니다. Intracortical microelectrode 기술의 미래에 대 한 좋은 낙관론은, 비록 그것은 또한 유명한 microelectrodes 결국¹¹, 이식 다음 급성 neuroinflammatory 응답으로 인해 실패. 두뇌에 있는 외국 물자의 주입 즉시 손상 주변 조직에 발생 하 고 이식¹²의 속성에 따라 달라 집니다 neuroinflammatory 응답으로 인 한 추가 피해를 연결. 더하여, 두뇌에 있는 임 플 란 트 microlesion 효과 발생할 수 있습니다: 포도 당 대사 감소 급성 부 종 및 출혈 때문에 장치 삽입¹³에 의해 발생할 수 생각. 또한, 신호 품질 및 유용한 신호는 기록 될 수 있는 시간의 길이 동물 모델^11,14,,1516에 일치 하지 않습니다. 여러 연구 결과 neuroinflammation와 microelectrode 성능^17,,1819사이 연결을 설명 했다. 따라서, 공동체의 일치 microelectrodes, 주변 신경 조직의 염증 반응 적어도 부분적으로, 전극 신뢰성 타협 이다.

많은 연구 조사 지역의 염증^11,20,,2122 또는 삽입^11,23, 으로 인 한 뇌 손상을 줄이기 위해 방법을 탐험 ^24,25시간^14,26동안 녹음 성능 개선의 목표. 또한, 우리는 최근 쥐의 모터 피 질에서 microelectrode 삽입으로 인 한 의원 성 상해는 즉각적이 고 지속적인 좋은 모터 적자²⁷발생 표시는. 따라서, 여기에 제시 된 프로토콜의 목적은 주고 연구자 주입 및 intracortical 장치의 영구 존재 하는 뇌 외상 결과로 가능한 모터 적자를 평가 하기 위해 양적 방법 (microelectrodes에는 이 원고의 경우)입니다. 여기 설명 하는 동작 테스트 모두 그로스와 잘 모터 기능 장애, 애타게 하도록 설계 되었습니다 그리고 뇌 손상의 많은 모델에서 사용할 수 있습니다. 이러한 방법 간단, 재현성, 및 설치류 모델에서 쉽게 구현 될 수 있습니다. 또한, 여기에 제시 된 방법 조직학 결과 모터 동작의 상관 관계에 대 한 혜택을까지 최근, 저자 안 본 BMI 필드에 게시 된 수 있습니다. 마지막으로,이 방법 괜 찮 모터 기능²⁸, 총 모터 기능²⁹, 그리고 스트레스와 불안 행동^29,30, 테스트 하도록 설계 되었습니다으로 여기에 제시 된 방법을 구현할 수도 있습니다에 연구원은 밖으로 (또는)을 지배 하 고 머리 부상 모델의 다양 한 모든 모터 함수 적자.

프로토콜

모든 절차 및 동물 관리 관행에 의해 승인 되었고 루이 스톡 클리블랜드 학과의 재향 군인 담당 센터 기관 동물 의료 및 사용 위원회 수행.

참고: 컨트롤 자상 부상 모델의 사용에 대 한 결정에 연구원 교육, 것이 좋습니다 외. 포터 의해 수행 하는 작업을 검토 하 ²¹.

1. microelectrode 이식 수술

1. 미리 수술 동물 준비
   1. Isoflurane (2-4%)를 사용 하 여 유도 챔버에서 동물 anesthetize 마 취에서 지속적으로 심장 박동과 혈액 산소 함유량을 모니터링 하는 중요 한 측정 시스템을 사용 하 여 동물을 모니터링 합니다.
   2. 마 취를 계속 코 콘에 동물을 이동 합니다. 피하 (SQ) cephalosporin 항생제, 예: cefazolin (25 mg/kg) 및 비 스테로이드 항 염증, 감염을 방지 하 고 통증, 각각 관리를 예를 들면 carprofen (5 mg/kg) 주사.
   3. 후 한 건조에서 그들을 방지 하기 위해 동물의 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
   4. 작은 동물성 손톱깎이 사용 하는 봉합 상처 치유 하는 동안 긁 기에서 동물을 방지 하기 위해 발톱 손질. 못 하지 잘린 너무 짧고, 통증과 출혈 동물에 대 한 발생할 수 있습니다으로 확인 합니다.
   5. 전기 면도기 트리머를 사용 하 여 눈 사이 귀 뒤에 철저 하 게 동물의 머리를 면도.
   6. 절 개의 영역에서 동물의 머리의 상단에 로컬 진통 bupivacaine (0.125 %bupivacaine 재고 솔루션에서 희석의 0.3 mL)의 SQ 주사 제공.
   7. 동물을 머리 수술 하는 동안 이동 하는 것을 막기 위해 귀 막대를 사용 하 여 stereotaxic 프레임에 탑재 합니다. 동물의 내부 온도 유지 하기 위해 동물 아래 패드 난방 순환 수를 놓습니다.
   8. 무 균 드 레이프, 예를 들어, 제도 승인 살 균 플라스틱 랩, 외과 분야를 분리 하는 적용.
   9. 스크럽 번갈아 betadine 솔루션을 사용 하 여 외과 영역 그리고 소 프로 파 놀 스크럽.
   10. 되도록 동물 외과 비행기 아래 기관 프로토콜에 따라 발가락 핀치를 수행 합니다.
2. 동물 이식 준비
   1. No. 10 메스 블레이드를 사용 하 여 두개골을 노출 하는 중간 선 아래에 약 1의 절 개를 만듭니다. 퉁 명 스럽게 솜 밀고 주걱을 사용 하 여과 제거 하 고 어떤 출혈 거 즈 패드 사용을 중지. 악어 클립을 사용 하 여 주변 조직 철회 하 고 깨끗 하 고 과산화 수소와 두개골을 탈수.
   2. 나중 단계에서 결합 치과 시멘트를 개선 하기 위해 노출 된 두개골에 cyanoacrylate 기반 조직 접착제의 몇 방울을 놓습니다.
   3. 선택한 반구에서 뼈에는 닉을 만들어 forepaw 운동 약 3 m m 중간을 2mm bregma에 앞쪽 측면에 해당 하는 모터 피 질 영역을 표시 합니다.
   4. 1.75 m m 둥근된 팁 치과 드릴을 사용 하 여, 특별 한 배려는 너무 빨리 또는 너무 깊이 드릴 하지 복용 및 stereotaxic 프레임에 한 손으로 지원 두개골의 일부를 제거 합니다. 드릴³¹과열 방지를 간헐적으로 두개골에 적용 되어야 한다.
   5. 잘 구부려 진된 45 ° dura 선택을 사용 하 여 경질을 반영 합니다.
   6. 어떤 출혈을 사용 하 여 면 밀고 주걱 및 염 분, 직접 터치를 돌보는 뇌 표면 청소.
3. Microelectrode 모터 피 질에의 삽입
   1. 신중 하 게 복용 하지 전극의 정강이 범프를 주의 stereotaxic 프레임에 범용 홀더에서 소독된 microelectrode를 탑재 합니다. 전극의 headstage 인터페이스 커넥터 단단히 소유자에 의해 개최 됩니다 확인 하십시오.
      참고: 여기, 그리고 2 m m x 123 µ m x 15 µ m 측정 비 기능 미시간 스타일 실리콘 생크 전극 사용, 생크 미세 집게를 사용 하 여 삽입 했다.
   2. Stereotaxic 프레임에는 micromanipulators을 사용 하 여 신중 하 게 놓고 전극의 팁 오픈 craniotomy.
   3. 부드럽게 측정 가이드로는 micromanipulators를 사용 하 여 뇌에 전극 약 2 m m 낮은 (전극의 선택에 따라 제어 속도에서 자동된 삽입 필요할 수 있습니다.) 어떤 표시 맥 관 구조 가능할 때마다을 피하기 위해 주의. 일단 전극 장소에, 신중 하 게 보편적인 홀더에서 커넥터 놓고 삽입 팔을 철회.
   4. 조심 스럽게 면 밀고 주걱 및 식 염 수를 사용 하 여 전극 주위에서 출혈이 청소.
   5. 실리콘 고무를 사용 하 여 이식된 전극 주위 craniotomy 오프 인감.
   6. 치과 시멘트를 사용 하 여 두개골에 전극 수정.
   7. 시멘트는 완전히 건조, 일단 절 개의 가장자리 함께 가져 앞에 그리고 시멘트 headcap 및 봉합 그들 종료 뒤.
4. 수술 치료
   1. 동물의 생체 신호를 모니터링 하면서 패드를가 열 순환 물에 복구할 수 있습니다. 사용 하 여 열 램프 램프에서 온도 더 제어 하기 어려운 동물 과열 수 있습니다 하지 마십시오.
   2. 일단 동물은 완전히 깨어 있는, 음식과 물에 쉽게 접근할 깨끗 한 케이지를 동물을 이동 합니다.
   3. 수술 일 1-3 일 동안 스퀘어 cephalosporin 항생제 (25 mg/kg)와 비 스테로이드 항 염증 (5 mg/kg) 감염을 방지 하 고 그들의 고통을 관리 하는 동물을 제공 합니다.
   4. 매일 통증 또는 불편 함, 출혈, 체중 변화, 또는 적어도 수술 하루 5 문제를 봉합의 흔적에 대 한 동물을 모니터링 합니다.

2. 행동 테스트

1. 모든 동작 테스트를 위해 테스트 동물 2 x 그들의 사전 수술 기준 점수를 계산 하기 위해 전극 이식 수술 전에 주에 테스트 당. 수술 다음 각 테스트에 주 당 2 x 테스트 동작을 시작 하기 전에 1 주 동안 휴식을 동물 허용. 일관 된 테스트 조건 사전 및 수술 후 불안의 측정에서 발생할 수 있는 성능에 스트레스의 영향을 최소화 하기 위해 테스트에 대 한 연구를 통해 사용 되어야 한다.
   1. 각 동물 전후 각 테스트 세션의 시작 부분에서 염소 이산화 기반 sterilant와 모든 테스트 장비를 청소 하십시오.
   2. 오픈 필드 그리드와 사다리 테스트 영화. 이러한 테스트 필요 비디오 카메라 (1080p, 15fps, 78 ° 대각선의 시야의 최소), 노트북, 및 비디오 데이터를 저장 하는 방.
   3. 각 테스트의 시작 부분에서 시험장에 동물을 가져오고 테스트를 시작 하기 전에 적어도 20 분 동안 적응 하도록 허용. 방에 빛과 온도 제어, 그리고 같은 인사는 모든 테스트 완료 해야 합니다. 이상적으로, 같은 방에 방에 변경 없이 테스트의 과정을 통해 모든 동물에 대 한 사용 됩니다.
   4. 작업을 완료 하는, 특히 사다리 훈련 기간 동안 동물을 장려 하기 위해 사용 하 여 음식 보상. 시리얼 이나 바나나 칩 또는 크래커의 작은 조각을 좋은 보상을 확인합니다.
   5. 각 개별 동물 (공식 1)에 대 한 사전 수술 점수에 모든 주간 테스트 공연 정상화.
      방정식 1:
2. 필드 표 테스트 오픈
   참고: 오픈 필드 그리드 테스트 사내 고 약 40 cm 높은 불투명 측 벽 1 m² 의 실행 표면 있다. 실행 하는 눈금의 표면 아래 테이프 (그림 1A)를 사용 하 여 아래쪽에서 9 동등 사각형으로 나뉘어져 있습니다. 기록 카메라 비 계에는 격자의 중심 위에 영구적으로 장착 됩니다.
   1. 오픈 필드 그리드 테스트 하려면 동물 테스터 멀리 직면 하는 눈금의 중앙에 놓습니다.
   2. 동물 비디오를 기록 하는 동안 3 분 동안 자유롭게 실행을 허용 합니다.
   3. 동물 테스트 완료 되 면, 그리드에서 동물을 제거 하 고 감 금 소에 반환. 염소 이산화 기반 sterilant와 철저 하 게 그리드를 청소.
   4. 각 동물 1 테스트 x 하루 테스트 당.
   5. 비디오 추적 소프트웨어를 사용 하 여 총 모터 함수의 통계로 넘어 눈금선, 여행, 총 거리 및 동물의 최대 속도의 수를 분석 합니다.
      참고: 여기에 제시 된 데이터는 수동으로 훈련 된 연구원에 의해 계량 했다 하지만 그것은 사내 최근에 개발 된 사용 하 여 선호 추적 알고리즘³².
3. 사다리 테스트
   참고: 사다리 테스트 사내 고 2 취소 아크릴 측 벽, 길이, 직경 3 mm 가로 2 c m 간격 (그림 2A)에서 간격으로 연결 된 각 1 m의 구성 됩니다. 사다리 테스트 숙련 된 시험 이며 따라서 사전 수술 기준 점수를 기록 하기 전에 훈련의 1 주를 요구 한다. 교육에 대 한 프로토콜 테스트는 동일.
   1. 사다리 테스트 하려면 임시 깨끗 한 보관 케이지를 동물을 이동 합니다.
   2. 2 감 금 소 교량을 사다리 설정 합니다. 깨끗 한 케이지 달려있다 사다리의 시작 끝 그리고 끝 끝 실행을 완료 하는 데 동기 부여로 봉사 하는 동물의 집 케이지에 달려있다.
   3. 사다리의 중심에 삼각대에 동일한 (또는 유사한) 비디오 카메라를 배치 합니다. 카메라의 위치 가로 대 높이에 있어야 볼 수 전체 사다리에 대 한 허용 합니다.
   4. 실행 비디오 카메라와 함께 첫 번째 울 렸으 면 터치를 그들의 정면 발을 수 있도록 사다리의 출발선에 동물을 개최.
   5. 그들의 자신의 걸음에 사다리를 건너 동물 허용. 동물의 발 닿은 첫 번째 울 렸으 면 마지막 가로 대에 제 3에서 결승 선을 교차 하는 동물의 시간 결정 순간 사이의 시간 경과.
   6. 동물 사다리에 돌아서 또는 20의 기간 동안 이동 하지 않습니다 경우 s, 실행 실패 하 동물을 고려 하십시오. 동물 페널티킥 실패 각 시간 실행 점수를 할당 합니다. 사전 수술 테스트²⁷동안 기록 느린 성능에 의해 형벌 시간을 결정 합니다.
   7. 건너 사다리 5 각 동물 허용 x 각 실행 사이 약 1 분 나머지와 함께 하루를 테스트 당.
   8. 정밀한 모터 함수의 통계로 하루 빠른 3 실행의 평균입니다. 또한, 각각의 소프트웨어를 추적 하는 비디오를 사용 하 여 가로 대에서 미끄러져 발 횟수를 기록 합니다.
      참고: 여기에 제시 된 데이터는 수동으로 훈련 된 연구원에 의해 계량 했다 하지만 그것은 나 외. 를 사용 하 여 최근에 개발 된 사내 추적 알고리즘을 사용 하 선호 ³².
4. 그립 강도 테스트
   1. 각 테스트 세션 전에 그립 강도 측정기를 교정 하 고 그램의 강도 측정.
   2. 위치는 카운터 바닥 위에 확장 그립 핸들의 가장자리에 그립 강도 미터입니다.
   3. (그림 3A) 꼬리의 기지에 의해 동물을 잡고 두 앞 발과 자전거 핸들을 잡아 동물 허용.
   4. 일단 동물에는 각 발에와 함께 확고 한 그립, 느리고 꾸준한 힘으로 꼬리의 기지에 의해 미터에서 동물을 당겨.
   5. 디지털 그립 강도 측정기에 의해 출력에 표시 되는 동물에가 해지는 최대 그립 강도 기록 합니다.
   6. 각 동물 3 테스트 x 각 테스트 사이 약 2 분 나머지와 함께 하루를 테스트 당.
   7. 정밀한 모터 함수의 통계로 기록 하 고 3의 각 출력 최대 그립 강도 평균.

3. 사후 행동 프로토콜

1. 동물 마 취 제 (160 mg/kg)를 사용 하 여 깊이 anesthetize 모든 행동 (예를 들어, 주입 후 8-16 주), 테스트 수행 및 xylazine (20 mg/kg), transcardially 그들을 perfuse, 그들의 두뇌 및 곳을 알아내는-슬라이스를 수확, 그리고 조직 얼룩 immunohistochemical 마커를 사용 하 여 계량 주입^{33,34,35,36,,3738}의 사이트 주위 세포 응답.

4. 통계 분석

참고: 예비 전력 분석은 특정 연구 질문에 대답을 추구 하는 어떤 학문 든 지에 대 한 강력 하 게 제안 했다. 특정 연구 디자인에 대 한 통계적 의미를 달성 하는 데 필요한 동물의 수를 알려 줍, 전력 분석, 특정 연구 가설, 실험, 예상된 효과 크기의 다양성의 디자인에 따라 결정 되어야 의도 된 치료, 임상 또는 과학적인 관련성을 달성 하는 데 필요한 잘 효과 크기.

1. 일반적인 통계 소프트웨어를 사용 하 여 통계 분석을 수행 합니다.
2. 설명 통계를 집계 하 고 평균 ± 표준 오차도 그들을 표시 합니다.
3. 두 표본 t-검정을 사용 하 여 그룹 대 이식 컨트롤 비교 주간 각 시간 점에서 [오픈 필드 그리드 (2.2 단계), 사다리 (2.3 단계), 및에서 그립 강도 테스트 (2.4 단계)] 행동 성능 분석. 독립적인 측정 각 주간 시간 포인트를 고려 하십시오.
4. 혼합된 효과 선형 모델을 사용 하 여 경도 성능을 수량화 합니다. 주 및 그룹 요소를 고정 되 고 실험 동물 임의의 효과 서 그룹 내에 중첩 된. 분산 분석 (ANOVA) p < 0.05의 의미 수준 요인 효과 결정 하는 데 사용 됩니다.
5. 사다리 성능을 비교 하 여 선형 회귀 분석을 사용 하 여 immunoglobin G (IgG) 강도. 상관 계수는 Pearson의 방법으로 계산 합니다.

결과

여기에 제시 하는 방법을 사용 하 여, 모터 피 질에서 microelectrode 이식 수술은 완료 된 다음 설립된 절차^39,40,41,42, 오픈 필드 그리드 테스트 하 여 다음 총 모터 기능 및 사다리 그립을 평가 강도 정밀한 모터를 평가 하기 위해 테스트 기능²⁷. 모터 기능 테스트는 완료 된 2 x 컨트롤 없이 수술 비 이식 동물 이식된 동물에서 수술 후 16 주 동안 주당. 모든 수술 후 점수 주당 평균 하 고 각 개별 동물의 사전 수술 기준 점수를 표준화 했다. 모든 오류는 평균 (SEM)의 표준 오류로 보고 됩니다.

토론

여기에 설명 된 프로토콜을 효과적으로 그리고 reproducibly 측정 벌금과 총 모터 적자의 설치류 뇌 손상 모델에서 사용 되었습니다. 또한, 모터 피 질에서 microelectrode 주입 다음 조직학 결과 괜 찮 모터 동작의 상관 관계에 대 한 수 있습니다. 메서드는 따라 하기 쉽고, 설정, 저렴 하 고 연구원의 개별 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 또한, 동작 테스트 발생 하지 않습니다 큰 스트레스 나 통증 동물; 오히려, 연구원은 동물 성장 운동 및 테스트와 함께 제공 된 보상을 믿습니다. 이전 연구는 모터, 메모리, 및 기능 손상을^44,45모터 피 질 손상이 발생할 수 있습니다 제안 했다. 그러나,이 지식에도 불구 하 고 거기에는 모터 피 질²⁷, 환자의 임상 결과 부정적인 영향을 미칠 수 있는 microelectrode 주입으로 인 한 기능적 영향에 대 한 제한 된 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Sprague Dawley 쥐, 수컷, 201-225g	Charles River	CD
Compac5 마취 시스템	Vetequip	901812
전기 트리머	Wahl	9918-6171
스테레오택시 프레임	David Kopf Instruments	1760
Gaymar 온수 패드 및 펌프	Braintree Scientific Inc	TP-700
Vetbond 조직 접착제	3M	07-805-5031
치과 드릴	Pearson Dental	O60-0045
Dura pick	Fine Science Tools	10064-14
실리콘 생크 미세 전극	클리블랜드 VA 의료 센터에서 자체 제작	N/A
KwikCast 실리콘 엘라스토머	세계 정밀 기기	KWIK-CAST
Teets 치과 시멘트	A-M Systems	525000
Webcam HD Pro c920	Logitec	960-000764
그립 강도 측정기	Harvard Apparatus	565084
Minitab 17 통계 소프트웨어	Minitab Inc
Open field grid test	Case Western Reserve University에서 자체 제작	N/A
사다리 테스트	Case에서 자체 제작 웨스턴 리저브 대학교	N/A
토끼 안티 쥐 IgG 항체	Bio-Rad	618501