감마-아미노낙산 수용체 A형 신경전달을 조절하는 새로운 화합물의 발견 방법

여기에서는 결합에서 생리학 및 약리학에 이르기까지 GABA_A 수용체에서 활성을 띤 화합물을 발견하기 위한 프로토콜을 제시합니다. GABA_A 수용체에 특이적인 새로운 분자를 검색하기 위해서는 관심 있는 하위 유형을 가능한 한 정확하게 정의하고 새로 확인된 화합물의 특이성을 평가하는 것이 중요합니다(예: 검토를 위해 Rudolph and Knoflach¹또는 Sieghart^{2 참조}). 신약 개발의 일반적인 경로와 달성해야 하는 단계가 그림 1에 나와 있습니다.

결합 분석은 약물 발견의 첫 번째 단계로 많이 사용되어 왔으며 여전히 많이 사용되고 있습니다. GABA_A 수용체의 경우, 치료적으로 유용하고 안전한 약물이 결합하는 수용체의 벤조디아제핀 결합 부위에 결합하는 화합물을 식별하도록 최적화되어 있습니다. FLIPR(Fluorometric imaging plate reader) 멤브레인 전위 적색 염료 기반 분석^{3을 사용하는 다른 기술은} 원치 않는 부작용 프로필로 인해 바람직하지 않은 추가 부위에 결합하는 바르비투르산염과 같은 화합물을 검출합니다. 또한 사용된 염료는 GABA_A 수용체를 직접 활성화할 수 있으므로 약물 발견을 위한 이러한 분석의 유용성에 의문이 제기됩니다⁴. 결합 분석은 주어진 화합물이 특정 수용체 부류에 결합할 수 있다는 증거만 제공할 수 있습니다. 세포막을 사용한 시험관 내 분석은 선택적 인간 GABA_A α5β3γ2 수용체 리간드를 식별하는 데 사용됩니다. 인간 GABA_A α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 및 α3β3γ2 수용체를 발현하는 일시적 transfection된 HEK293 세포는 이러한 분석을 위한 멤브레인을 준비하는 데 사용됩니다. 리간드의 효과는 막 수용체에 결합된 [³H]플루마제닐의 섬광([³H]플루마제닐 결합 억제)을 측정하여 감지됩니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 수용체에서 화합물 결합 친화도의 빠르고 효율적인 측정이 관심 수용체에서 제공된다는 것입니다.

기능 연구는 화합물의 기능적 활성을 평가하고 화합물이 수용체에 결합함으로써 발생하는 메커니즘에 대한 생리학적, 약리학적 설명을 제안하는 데 필수적입니다. 오늘날, 기능적 GABA_A 수용체는 이온 공극에 의해 형성된 유사 대칭 축을 중심으로 5개의 소단위가 조립되어 발생하고 5개의 동일한 소단위체의 조립으로 인해 발생한다는 것은 잘 알려져 있습니다. 대부분의 GABA_A 수용체는 두 개 이상의 서로 다른 소단위체로 구성되어 있습니다. 예를 들어, 주요 뇌 GABA_A 수용체는 각각 2, 2, 1의 화학량론에서 α1, β2 및 γ2 소단위로 구성됩니다^5,6. 제노푸스(Xenopus) 난모세포 또는 HEK293 세포와 같은 숙주 시스템의 재구성은 수용체의 약리학적 특성을 빠르게 탐색할 수 있는 가능성을 제공합니다.

그런 다음 뇌 절편에서 세포 외 기록으로 화합물의 약리학적 특성을 탐구합니다⁷. 이 방법은 신경 전달에 대한 화합물의 효과를 탐구할 수 있게 해주고 전체 신경 환경에서 천연 수용체 수준에서 이종 발현 시스템에서 결정된 화합물의 기능적 효과를 확인하는 효과적인 방법을 제공합니다. GABAergic neurotransmission은 또한 억제성 시냅스후 전류(IPSC)에 대한 화합물의 영향을 측정하여 분자 수준에서 평가할 수 있습니다⁸. 그러나 여기에 사용된 프로토콜과 뇌 절편의 전체 세포 패치 클램프 기록을 기반으로 하는 프로토콜은 더 정교하고 처리량이 더 낮습니다.

마지막으로, α5β3γ2 선택적 리간드의 식별에 사용되는 체외 스크리닝 캐스케이드의 강점과 약점을 다양한 기술과 그 본질적인 한계의 관점에서 논의합니다. 이 연구는 GABA_A 수용체 분야의 전문가와 비전문가에게 이러한 리간드 의존성 이온 채널의 새로운 조절인자 발견을 다루는 데 사용되는 다양한 체외 접근법의 조합에 대한 유용한 검토를 제공할 것입니다.

Xenopus laevis는 제네바 주 동물 지침에 따라 사육되고 처리됩니다.

1. 방사성 리간드 결합

1. 분석 플레이트의 준비
   1. 5 mM KCl, 1.25 mM CaCl₂, 1.25 mM MgCl₂, 120 mM NaCl 및 15 mM Tris로 1.5 L의 분석 완충액을 준비합니다. HCl로 pH를 7.4로 조정합니다.
   2. 50.76μM에서 테스트할 화합물을 준비합니다(예: 마이크로 원심분리 튜브의 980μL 분석 버퍼에 10mM의 5μL 화합물). 와류 기계를 사용하여 2-5초 동안 고속으로 잘 혼합하십시오.
   3. 1 μL의 화합물(10 mM)을 1,970 μL의 분석 완충액에 피펫팅하여 기준 화합물 플루마제닐의 사전 희석을 준비합니다. 와류 기계를 사용하여 2-5초 동안 고속으로 잘 혼합하십시오.
   4. 50mL 폴리프로필렌 튜브에서 4°C에서 4nM의 분석 버퍼로 [^3H]플루마제닐 원액을 희석합니다.
   5. 그림 2.
   6. 50.76μM에서 희석된 화합물 73.2μL를 플레이트의 열 12에 피펫으로 넣습니다(단계 1.1.2 참조).
   7. 9단계(^1E-10 – ^1E-06M)에 걸친 기하학적 진행을 사용하여 23.12μL의 전달 부피와 충전 컬럼 3–11로 각 화합물을 희석합니다. 희석액을 철저히 혼합하십시오. 희석할 때마다 팁을 교체하십시오.
2. 세포막을 희석하십시오.
   1. HEK293 과발현 인간 GABA_A 수용체(0.025–0.15 mg/mL)에서 이전에 분리한 세포막을 해동하여 실온(RT)에서 80mL를 얻고 현탁액을 4°C의 분석 버퍼로 옮깁니다.
   2. 조직 균질화기를 사용하여 멤브레인 용액을 10,000–12,000rpm에서 30-40초 동안 4°C에서 여전히 재현탁합니다.
3. NSB(Non-Specific Binding) 제어를 위한 묽은 디아제팜
   1. 분석 버퍼가 있는 4mM 디아제팜 원액을 5mL 중 40μM 농도로 희석합니다.
4. 반응 시작
   1. 50μL의 4nM[^3H]플루마제닐을 96웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고 얼음물 용기에 보관합니다.
   2. GABA_A 수용체 아형 막 제제 100μL를 첨가하여 단백질 농도가 0.5mg/mL가 되도록 합니다.
   3. 50μL의 40μM 디아제팜을 컬럼 2에 피펫팅합니다.
   4. 얼음 위에서 1시간 동안 접시를 배양합니다.
   5. 후속 멤브레인 분리 및 방사능 측정을 위해 96웰 필터 플레이트의 각 웰에 50μL의 분석 버퍼를 추가하고 나중에 반응을 중지합니다.
5. 반응 중지
   1. 50mM Tris-HCl, pH 7.4의 세척 버퍼를 준비합니다.
   2. 96웰 세포 회수기를 사용하여 용액을 여과합니다. 웰당 300μL의 얼음처럼 차가운 세척 버퍼로 플레이트를 3회 세척합니다.
   3. 플레이트 바닥을 플라스틱 필름으로 밀봉하고 각 웰에 액체 섬광 계수를 위한 섬광 칵테일 40μL를 첨가하고 에탄올 70%로 닦습니다.
   4. RT에서 최소 1시간 동안 플레이트를 부드럽게 흔듭니다. RT에서 적어도 한 시간 더 그대로 두십시오.
   5. 섬광 카운터에 플레이트를 놓아 방사능(CPM)을 측정합니다. 웰당 3분 동안 측정을 허용합니다.
6. 데이터 분석
   1. NSB(Non-Specific Binding)의 8회 반복과 TB(Total Binding)와 샘플의 중복 또는 삼중화에 대한 평균을 결정합니다. 다음 방정식에 따라 각 샘플의 평균에 대한 % 비결합(SB)을 계산합니다.
      
      여기,
      총 SB = 평균 TB에서 평균 NSB를 뺀 값입니다.
   2. 가로 좌표에서 % SB 대 억제제 농도를 플롯합니다. 단일 사이트 경쟁 분석 방정식
      를 사용하여 데이터를 피팅합니다.
      여기,
      y = SB,
      의 % A = y,
      의 최소값 B = y,
      의 최대값 C = IC₅₀,
      X = 경쟁 화합물 농도의 로그₁₀,
      D = 곡선의 기울기(언덕 계수).
   3. 다음 데이터 사용 방정식에 따라 절반 최대 억제 농도(IC₅₀), 각 멤브레인에서 [³H]플루마제닐의 해리 상수(Kd)를 사용하여 결합 친화도(Ki)를 계산합니다⁹ 및 분석에서 [³H]플루마제닐의 농도
      

2. Xenopus 난모세포의 수용체 발현 및 기록

1. 난소 채취 및 난모세포 준비
   1. pH 7.4에서 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2.4 mM NaHCO₃, 10 mM Hepes, 0.82 mM MgSO_{4.7H 2}O, 0.33 mM Ca(NO₃)_{2.4H 2}O 및 0.41 mM CaCl_{2.6H 2}O로 멸균 Barth 용액을 준비하고, 100 unit/mL의 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 0.25 μg/mL의 암포테리신 B를 보충한다.
   2. pH 7.4에서 88.5mM NaCl, 2.5mM KCl, 5mM HEPES, 1mM MgCl_{2.6H 2O}로 1x OR2 배지(CaCl₂ 없음)를 준비합니다.
   3. Xenopus Laevis 암컷을 냉각된 트리카인 메탄설포네이트(150mg/L의 농도, pH 7.4에서 조정)와 중탄산나트륨(300mg/L)에서 20분 동안 깊은 마취로 희생한 후 참수합니다.
   4. 깨끗한 가위와 집게로 난소를 빠르게 적출하고 40mL의 1x Barth 용액과 항생제/항진균제로 채워진 2개의 페트리 접시(10cm)에 넣습니다.
   5. 해리되지 않은 난소를 4°C의 Barth 용액에 최대 2주 동안 보관합니다.
   6. 해리를 위해 깨끗한 면도날로 난소를 작은 조각(1-2cm³)으로 자르고 100mL 스피너 플라스크에서 100mL 스피너 플라스크에서 17-19°C에서 0.2% 콜라겐분해효소(유형 I)를 포함하는 CaCl₂(OR2-noCaCl₂)가 없는 50mL의 OR2 배지에서 배양합니다. 마그네틱 바가 바닥에서 약 3-5cm 위에 있는지 확인합니다. 난모세포가 부서지지 않도록 스피너 플라스크.
   7. 4-5시간 후, 대부분의 난모세포가 난포에서 분리되었는지 확인합니다(즉, 개별적으로 헤엄칩니다). 1.8mM CaCl₂를 보충한 200mL OR2로 5회 세척합니다.
   8. 혈관화된 난모세포를 Barth 용액과 항생제/항진균제로 채워진 Petri-dish(10cm)로 옮기고 cDNA 또는 mRNA 주입 전에 17°C에서 최소 하룻밤 동안 보관합니다.
   9. 다음 날, 쌍안경 아래에서 맑고 뚜렷한 동물과 식물 기둥을 나타내는 건강한 난모세포를 선택합니다(동물 기둥은 짙은 갈색, 식물 기둥은 밝은 노란색). 깨끗한 파스퇴르 피펫을 사용하여 난모세포를 하나씩 멸균 원추형 96 주입 웰 플레이트에 넣습니다.
      참고: mRNA 주사를 위한 난모세포 배치에 특별한 주의가 필요하지 않습니다. 반면, cDNA 주입의 경우 동물 기둥이 위쪽을 향하도록 난모세포를 향하게 하는 것이 필수적입니다.
2. mRNA 또는 cDNA 자동 주입
   1. 권장 지침에 따라 시판되는 키트를 사용하여 mRNA를 합성합니다. RNase로 기구와 테이블을 청소하고 적절한 보호 장갑을 착용합니다.
      참고: mRNA의 품질은 좋은 발현을 생성하는 데 결정적인 요소이며, 주입 절차 중 mRNA 분해를 방지하는 데 필수적입니다.
   2. 시판되는 키트를 사용하여 cDNA를 준비하고 원하는 양을 0.2 μg/μL의 농도로 중증류수에 용해시킵니다.
   3. 0.2 μg/μL 농도의 mRNA 용액 10–50 nL 또는 0.02–0.2 μg/μL 범위의 농도로 10 nL의 cDNA 용액을 주입하는 것이 바람직하며, 바람직하게는 95 난모세포의 배치로 주입합니다.
   4. 여러 subunit(즉, heteromeric α1β2γ2 GABA_A receptor)이 필요한 막 단백질의 경우, 해당 mRNA 또는 cDNA를 원하는 비율(즉, 1:1:1 또는 1:10:1)로 혼합합니다.
   5. 난모세포에 의한 열 충격 단백질의 발현을 방지하기 위해 난모세포를 17°C로 유지하십시오. 마이크로플레이트는 온도 조절이 가능한 보관 장소에 보관하십시오.
   6. 전기생리학적 기록을 위해 0.1–1,000μM에서 OR2의 결합 분석에서 양성으로 판정된 테스트 화합물을 용해하고 96웰 평평한 바닥 폴리프로필렌 플레이트에 폐기합니다.
3. 발현을 위한 플라스미드
   1. 박테리아 T7 또는 T6 프로모터를 사용한 mRNA 합성을 위해 시중에서 판매되는 키트의 사용 설명서를 따르고 RNase가 없는 물에서 0.2μg/μL의 용액 20μL를 만듭니다.
   2. cDNA 발현을 위한 진핵생물 발현 벡터를 포함하는 용액을 20μL 이상 준비하며, 일반적으로 20μg/μL를 중증류수에 용해시킵니다.
4. 난모세포(Oocyte)의 미세주입과 그 품질의 시각화
   1. 압력 배출 시스템 또는 자동 주입 시스템이 장착된 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 팁 직경이 최대 100μm인 유리 마이크로 주입 바늘을 사용하여 플라스미드가 포함된 용액 10–50nL를 주입합니다><(2.3.1 또는 2.3.2 단계 참조). 참고: 여기에서 논의된 예에서 난모세포는 cDNA 또는 mRNA와 함께 사용하기에 적합한 자동화 시스템을 사용하여 95개의 배치로 주입됩니다.
   2. 주사 바늘에 1%의 메틸렌 블루와 같은 염료를 1μL로 채우고 표준 절차(cDNA의 경우 핵 또는 mRNA의 경우 세포질)에 따라 난모세포를 주입합니다.
   3. 주입된 난모세포를 끓는 물에 약 1분 동안 버립니다. 쌍안경 아래에서 면도날로 난모세포를 반으로 자릅니다.
      참고 : 염료는 그림 3 E와 같이 국부적으로 유지되어 주입을 정확하게 관찰 할 수 있습니다.
5. 2전극 전압 클램프 녹음
   1. 난모세포가 포함된 웰 플레이트를 그림 4.
      에 설명된 원리를 사용하여 자동화 시스템에 놓습니다. 참고: 그림 5에 표시된 패치 클램프 시스템과 달리 셀의 실제 멤브레인 전위는 전압 전극에 의해 판독됩니다.
   2. 예를 들어, 집중 활동 관계의 결정을 위해 그림 6에 설명된 구성표와 함께 아이콘 기반 인터페이스를 사용하여 자동 기록 시스템을 프로그래밍합니다.
6. 곡선 피팅
   1. 그림에 표시된 농도 활성화 곡선을 사용하여 적절한 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하고, 현재 진폭을 작용제 농도의 로그 함수로 플롯합니다.
   2. 이후에 경험적 Hill 방정식을 다음과 같은 형식으로 맞출 수 있는 시그모이드 곡선을 관찰합니다
      
      여기,
      Y = 유발 전류의 비율,
      EC₅₀ = 50% 활성화를 위한 농도,
      x = 화합물의 농도,
      n_H = 언덕 계수 또는 겉보기 협력성.
   3. 일련의 셀에서 얻은 데이터를 분석하기 위해 각 응답의 진폭과 가장 높은 농도로 기록된 값을 나누어 전류를 통일체로 정규화합니다.
   4. 평균 및 표준 오차를 결정하고 표준으로 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 곡선 피팅을 실현합니다.

3. Brain Slices의 전기생리학적 기록

참고: 해마 쥐 조각은 국가 및 기관 지침에 따라 준비됩니다.

1. 해마 절편의 준비
   1. 124 mM NaCl 124, 2.5 mM KCl, 1.25 mM KH₂PO₄, 2 mM MgSO 4.7H₂O, 2.5 mM CaCl₂ 2H₂O, 26 mM NaHCO ₃, 10 mM 포도당 및 4 mM 당류를 95%_O2 및 5%_CO2의 혼합물로 병에 가스를 주입한 해부 인공 뇌척수액(dACSF)을 준비합니다.
   2. 95%_O2 및 5%_CO2의 혼합물과 함께 병에서 가스화된 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.25 mM KH₂PO₄, 2 mM MgSO 4.7H₂O, 2.5 mM CaCl₂ 2H₂O, 25 mM NaHCO₃ 및 10 mM 포도당으로 기록 인공 뇌척수액(rACSF)을 준비합니다.
   3. 2.5% 이소플루란과 순수 산소의 혼합물을 사용하여 쥐를 마취하고 목을 베십시오.
   4. 가위로 정중선을 따라 두피를 자릅니다. 기저 조직을 손상시키지 않고 정중선을 따라 두개골을 자릅니다. 핀셋으로 두개골을 제거하고 고운 주걱을 사용하여 뇌를 퍼냅니다.
   5. RT에서 가스가 주입된 dACSF 용액에 뇌를 넣고 미세한 주걱으로 왼쪽 해마 형성을 해부합니다.
   6. 조직 다지기로 해마의 중간 부분에서 가로 절편(400μm 두께)을 자르고 페인팅 브러시를 사용하여 기록 챔버로 옮깁니다. 슬라이스를 45분 동안 RT로 유지합니다.
   7. 35°C에서 1.5mL/분의 속도로 가스가 주입된 rACSF로 슬라이스를 관류합니다. 95% O₂ 및 5% CO₂.
      의 혼합물로 용액을 거품화합니다. 참고: 이 단계가 끝나면 슬라이스는 전기생리학 실험을 위한 준비가 된 것입니다.
2. 단일 인구 급증 기록
   1. 현미경에 장착된 챔버에 뇌 조각을 넣습니다.
   2. rACSF를 사용하여 3mL/분의 속도로 슬라이스를 관류합니다.
   3. 저항이 ~2MΩ인 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 마이크로피펫을 당깁니다
      알림: 이 마이크로피펫은 기록 전극으로 사용되며 증폭기에 전기적으로 연결됩니다.
   4. 마이크로피펫에 2M NaCl이 함유된 용액을 채우고 증폭기의 피펫 홀더에 넣습니다.
   5. 오른쪽 micromanipulator를 사용하여 해마 절편의 CA1 영역에 있는 피라미드층의 피라미드층에 기록 마이크로피펫을 배치합니다.
      참고: 위치는 그림 7.
   6. 절연된 바이폴라 백금/이리듐 전극을 왼쪽 micromanipulator.
      의 홀더에 놓습니다. 알림: 이 전극은 자극 전극으로 사용되며 자극 발생기에 전기적으로 연결됩니다.
   7. 오른쪽 micromanipulator를 사용하여 해마 절편의 CA1 영역에 있는 Schaffer 측부의 자극 전극을 배치합니다.
      참고: 위치는 그림 7.
   8. 자극 발생기를 사용하여 30초마다(100μs 지속 시간, 10μA에서 시작) 자극 전극에 전류 펄스를 전달하고 인구 급증(PS)이 나타날 때까지 자극 강도를 점차적으로 증가시킵니다.
   9. 얻을 수 있는 최대 진폭의 45%에 해당하는 PS를 유발하도록 자극 강도를 조정합니다. PS는 신호 증폭기를 사용하여 2.4KHz에서 필터링되고 20KHz에서 디지털화됩니다.
3. Paired-pulse 억제
   1. 뇌 절편을 준비하고(3.1단계) 앞에서 설명한 대로 진행합니다(3.2.1–3.2.7단계).
   2. 자극 발생기를 사용하여 30초마다 두 개의 전류 펄스(20ms 간격으로 100μs 지속 시간)를 자극 전극에 전달합니다. 최대 진폭의 45%에 해당하는 PS를 유발하도록 자극 강도를 설정합니다.
4. 화합물 테스트
   1. DMSO의 최종 농도가 0.1% 이하가 되도록 가스가 주입된 ACSF에서 테스트할 화합물을 희석합니다.
   2. DMSO를 화합물 용액과 동일한 농도로 대조 용액에 첨가합니다.
   3. Schaffer 측부 자극에 의해 유발된 단일(3.2단계) 또는 paired-pulse(3.3단계) PS를 30초마다 최소 30분 동안 기록합니다. PS 형상은 이 기준 기간 동안 안정적이어야 합니다.
   4. 테스트할 화합물의 농도가 일정하게 함유된 가스 처리된 rACSF가 있는 비커를 준비합니다.
   5. 이 용액으로 해마 절편을 관류하는 동시에 단일 또는 쌍 펄스 PS를 기록합니다.
   6. 화합물 없이 가스가 주입된 rACSF로 슬라이스를 관류하여 복합 효과의 회복을 평가합니다.
      참고: 가역적 효과를 위해 PS는 화합물 적용 전 기준선 기간 동안 관찰된 초기 모양으로 되돌아갑니다.
5. 데이터 분석
   1. 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 실험 중에 기록된 PS 트레이스를 4개 블록으로 평균화합니다.
   2. 평균 트레이스의 PS 진폭을 측정합니다.
   3. 화합물을 관류하기 10분 전에 기록된 기준선 값의 백분율로 진폭을 정규화합니다.
   4. 데이터를 SEM± 평균으로 표현합니다.

바인딩:
세포막을 이용한 시험관 내 분석법은 γ2 수용체를 포함하는 BZD 알로스테릭 부위에 결합하는 선택적 인간 GABAA α5β3γ2 수용체 리간드를 식별하는 데 사용됩니다. 인간 GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 및 α3β3γ2 수용체를 발현하는 일시적 transfection된 HEK293 세포를 사용하여 이 분석을 위한 멤브레인을 준비합니다. 전위 리간드의 효과는 막 수용체에 결합된 [3H]플루마제닐의 섬광([3H]플루마제닐 결합 억제)을 측정하여 감지됩니다. 그런 다음 RO4938581의 예에서와 같이 특정 GABAA 수용체에 대한 화합물의 선택성을 평가하기 위해 변위 결합 곡선을 생성합니다(그림 8). 그림 9는 결합 분석을 사용하여 생성된 α5 선택적 GABAA 수용체 음성 알로스테릭 조절제인 RO49385819를 포함한 여러 참조 화합물의 프로파일을 요약합니다.

Xenopus 난모세포의 녹음:
α5β3γ2 이질체와 같은 GABAA 수용체의 발현은 GABA 노출에 대한 반응으로 강력한 전류를 생성합니다. 최대 300μM 범위의 짧은 GABA 펄스(30초)에 대한 응답으로 인간 α5β3γ2를 발현하는 난모세포에서 얻은 일반적인 전압 클램프 기록은 그림 6에 나와 있습니다. 이 실험에서는 다양한 농도의 GABA를 96웰 플레이트에 배치하고 특정 웰에서 세포를 이동시켜 반응을 유발했습니다. GABA는 세포를 중앙 관류 챔버로 되돌려 놓고 해당 연동 펌프를 활성화하여 제어 용액의 관류를 적용하여 철저히 세척했습니다. 농도 활성화 곡선의 결정에 사용되는 프로그램 순서는 그림 6A에 설명되어 있습니다. 완전 자동으로 수행되는 이러한 데이터는 Xenopus 난모세포에서 얻을 수 있는 기록의 품질과 mRNA 주입 후 며칠 후에 얻은 높은 수준의 수용체 발현을 모두 보여줍니다. 서로 다른 수용체 조합에서 수행된 실험은 일련의 EC50s를 산출하며, 이는 수용체의 절반을 활성화하는 데 필요한 GABA 농도입니다. 그림 10에 표시된 것과 같은 스파이더 그래프의 EC50 값 플롯은 수용체 특성과 서브유닛 구성의 영향을 빠르게 비교합니다.

음의 또는 양의 알로스테릭 변조기(NAM 또는 PAM)의 효과를 검사하려면 먼저 제어에서 그리고 나서 변조기의 존재 하에서 작용제(GABA) 테스트 펄스에 의해 유발된 반응을 비교해야 합니다. 이러한 실험을 수행하기 위한 효율적인 실험 프로토콜은 그림 11에 설명되어 있습니다. GABA의 기준 농도에 대한 세포의 반응을 먼저 결정하고 동일한 GABA 농도를 적용한 다음 GABA와 조절제를 함께 적용하여 서열을 반복합니다. 두 개의 중첩된 반응의 플롯은 이 예에서 변조기의 존재로 인한 현저한 억제를 나타냅니다. 변조기 효과의 정량화는 변조기 대 대조군의 존재 하에서 유발된 반응의 비율을 계산하여 쉽게 얻을 수 있으며 결과는 열 플롯의 형태로 플롯될 수 있습니다. 그림 12에 표시된 데이터는 96개 화합물에 대해 얻은 3개의 데이터 세트 기록에 해당하는 열 플롯을 보여줍니다.

충분히 활성인 화합물을 확인한 후, 이러한 분자가 다른 수용체 조합에서 활성인지 평가하는 것이 종종 필수적입니다. GABAA 수용체의 경우, 서로 다른 소단위체를 암호화하는 19개의 유전자가 확인되었으며, 기능적 수용체는 서로 다른 소단위체의 다량체 조립체로부터 유래할 수 있는 것으로 알려져 있습니다(검토는 Knoflach, Hernandez 및 Bertrand10 참조). 여러 subunit 및 조합은 많은 수의 counter screening을 수행해야 할 수 있는 수용체 하위 유형의 방대한 레퍼토리를 생성하지만, GABAA 수용체의 경우 α1β2γ2 구성인 가장 풍부한 하위 유형에 먼저 초점을 맞출 수 있는 경우가 많습니다. 예를 들어, 동일한 난모세포 배치에서 α5β3γ2 및 α1β2γ2의 발현으로 일대일로 수행된 실험은 주어진 분자의 각 효과를 잘 비교했습니다. α5β3γ2 및 α1β2γ2에 대한 3개의 세포에서 얻은 일반적인 결과는 그림 13에 나와 있으며, 이는 α5β3γ2에서 한 분자의 우선적인 양성 조절을 보여줍니다.

그림 11에 설명된 실험 프로토콜은 PAM 활동의 특성화에 매우 적합합니다. 이 프로토콜에서 테스트된 화합물은 점진적으로 증가하는 농도로 작용제와 함께 적용됩니다. 동일한 셀에 대한 여러 응용 프로그램으로 인해 발생할 수 있는 누적 효과를 피하기 위해 각 데이터 포인트에 대해 새롭고 나이브(naive) 셀이 측정됩니다. 작용제만 단독으로 기록한 다음 복합 응용 프로그램 중에 기록된 반응의 진폭을 측정하면 PAM 또는 NAM 효과를 정량화하는 비율을 얻을 수 있습니다. 디아제팜에 대한 α1β2γ2 및 α5β3γ2에서 얻은 일반적인 결과는 그림 14에 나타나 있으며, 이는 이 수용체 조합에서 α5β3γ2의 겉보기 민감도가 약 10배 더 높다는 것을 보여줍니다. 이러한 값은 게시된 data11과 좋은 상관 관계가 있습니다. 벤조디아제핀 부위는 γ2와 인접한 α subunit12,13,14 사이의 계면에 의해 구성되는 것으로 생각되기 때문에 α5β3γ2의 민감도는 γ2-α1보다 γ2-α5에 대한 우선적인 디아제팜 친화도를 시사합니다. 효율적인 기능적 특성화와 결합된 다양한 수용체 조합을 발현할 수 있는 가능성은 PAM 특성의 결정 요인과 생리학적 및 약리학적 효과에 대한 의미를 탐구할 수 있는 여러 가지 방법을 열어줍니다.

해마 뇌 절편:
쥐 해마 뇌 절편을 사용한 실험은 천연 수용체 모델에서 시험관 분석에서 확인된 화합물의 약리학적 프로필을 검증하기 위해 수행됩니다. 해마의 피라미드 세포에서 발현되는 우세한 GABAA 수용체 아형은 α1β2/3γ2, α2β2/3γ2 및 α5β2/3γ2이며, 모두 벤조디아제핀(BDZ)15에 의해 조절됩니다. 쌍펄스 억제(Paired-pulse inhibition)는 20ms 간격으로 전달된 두 쌍의 전기 자극 중 두 번째 신호의 반응 변화를 테스트하여 해마 회로 흥분성을 밝힐 수 있는 패러다임입니다. 두 번째 반응의 변화는 피라미드 세포층을 신경 분포시키는 인터뉴런에 의한 GABAergic 피드백 때문입니다16,17,18. 그림 7> 대조군 상황에서는 GABAergic 억제로 인해 두 쌍의 자극의 두 번째 반응이 억제됩니다. 비선택적 NAM인 β-CCM으로 슬라이스를 관류하여 이러한 억제를 감소시키면 두 쌍을 이룬 자극의 두 번째 반응이 훨씬 덜 억제됩니다. 이 실험 패러다임은 α5 subunit을 포함하는 GABAA 수용체에 대해 선택적인 화합물에 민감합니다.

그림 1: 스크리닝 전략. 일반적인 약물 스크리닝 경로는 특정 표적에 대해 대규모 화합물 라이브러리를 스크리닝하는 고처리량 스크리닝으로 시작됩니다. 주요 후보가 식별된 후 의약 화학 작업이 시작됩니다. 이 단계에서 화학자는 표적 선택성, 뇌 침투성, 안정성, 저하 등과 같은 원하는 기준을 충족하기 위해 구조적 변형을 수행하여 분자를 연구하고 정제합니다. 이 중요한 단계에서는 화학적 변형으로 인해 분자 특성이 변경되지 않았는지 평가하고 최상의 후보를 구체화하는 것이 중요합니다. 다음 단계는 몇 가지 유망한 화합물을 식별하고 안전성, 내성 등을 포함하는 다음 단계로 가져오는 것입니다. 전기생리학이 기능적 분석법으로 표시되지만 칼슘 형광 분석 또는 전압에 민감한 염료를 포함한 다른 방법을 대안으로 사용할 수 있습니다. 이러한 후자의 방법은 결합 분석의 대체품으로 고처리량 분석에서도 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 결합 실험에 사용되는 96웰 도금의 레이아웃. 열 1은 총 결합 측정에 사용되고 열 2는 비특이적 결합 측정에 사용됩니다. A-H 행은 농도가 증가하는 4개의 서로 다른 화합물(3-12열)로 채워지며, 각 화합물은 중복(즉, A와 E행의 화합물 1, B와 F행의 화합물 2 등)으로 레이아웃에 서로 다른 색상으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 자동화 시스템을 사용한 미세주입.(A) 관심 플라스미드가 포함된 액체로 채워진 유리 주사 바늘을 자동으로 난모세포에 찔러넣는 정밀한 XYZ 시스템. (B) 이 패널은 (C) 난모세포가 자동으로 주입되는 96웰 원뿔형 바닥 플레이트를 보여줍니다. (D) 이 패널은 사출 원리를 보여줍니다. 핵 주입의 경우, 패널 B에서 볼 수 있듯이 바늘은 핵보다 약간 더 깊은 난모세포를 관통합니다. 그런 다음, 주사 전에 바늘을 핵(패널 C 참조)에서 빼냅니다(패널 D 참조). (E) 주사의 품질을 평가하기 위해 바늘에 염료를 채우고 "조리된" 난모세포를 반으로 자를 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 자동화된 2전압 클램프 전극 원리. 원리는 관류에 액체를 적용하는 대신 우물 사이에서 제제를 이동하는 것을 기반으로 합니다. (A) 패널의 좌측은 두 개의 전극과 한 샘플에서 다른 샘플로 이동하는 동안 제제 주위에 액체 방울을 유지하는 작은 바스켓을 사용하여 Xenopus 난모세포에 기록할 수 있는 배열을 나타냅니다. 두 개의 전극이 있는 바구니에 놓인 난모세포의 사진이 오른쪽에 표시됩니다. (B) 이 패널은 "거꾸로" 전기생리학 기록 원리의 개략도를 보여줍니다. (C) 이 패널은 기록 테이블 상의 난모세포, 복합판 및 세척 스테이션의 배치를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 2전극 전압 클램프 기록 대 패치 클램프. 난모세포(왼쪽 패널)에 대한 일반적인 2전극 전압 클램프 기록은 세포주(오른쪽 패널)에 사용되는 패치 클램프 구성과 비교됩니다. 직경이 약 1mm인 난모세포와 약 20μm인 세포 사이의 크기 차이에 주목하십시오. 2전극 전압 클램프에서 난모세포의 막 전위는 원하는 유지 전압과 비교되고 신호 차이는 전류 전극에 주입됩니다. 패치 클램프 기록에서 패치 클램프 전극의 저항은 멤브레인 저항에 비해 무시할 수 있는 수준이므로 증폭기에 의해 부과되는 전압이 세포막에 충실하게 공급된다고 가정합니다19. 그림은 세타 튜브()의 두 채널이 한편으로는 제어 용액으로 채워지고 다른 한편으로는 drug20,21이 포함된 용액으로 채워지는 액체 필라멘트 관류를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 인간 α5β3γ2 수용체에서의 농도 활성화 관계. (A) 자동화 시스템을 제어하는 시퀀스는 일련의 아이콘으로 구성되며 농도 활성화 관계를 결정하기 위한 실험 프로토콜을 설정합니다. 이 패널에서 볼 수 있듯이 1-3단계에서 시스템은 플레이트에서 측정 바구니로 난모세포를 로드합니다. 누설 전류는 2단계에서 측정되며, 이 값이 원하는 기준을 초과하면 셀이 자동으로 변경됩니다(3단계). 안정화 기간(4단계) 후 기준 GABA 농도에 대한 난모세포 반응을 측정합니다(5-8단계). 1μA보다 큰 전류를 표시하는 난모세포는 후속 측정을 위해 유지됩니다. 11-13단계에서 세포는 다양한 농도의 GABAA에 의해 도전을 받고 원하는 농도 수(14단계) 및 세포(15단계)에 대해 프로세스가 반복됩니다. (B) 이 패널은 일련의 간단한 GABA 응용 프로그램(30초)이 증가하는 순서로 적용됨에 따라 유발되는 일반적인 전류를 보여줍니다. 복합 적용의 타이밍은 막대로 표시됩니다. (C) GABA 농도의 로그 함수로 피크 내부 전류의 플롯은 연속 곡선, 약 11μM에서 EC50 및 1.3의 Hill 계수를 갖는 경험적 Hill 방정식에 의해 쉽게 맞는 농도 활성화 곡선을 생성합니다. 8개의 셀에 기록된 전류는 최대 유발 반응에 대한 통일성으로 정규화되었습니다. 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: β-CCM, GABAA NAM은 해마 절편에서 쌍 펄스 억제를 감소시킵니다. (A) 이 패널은 쥐 해마 절편의 개략도를 보여줍니다. CA1 피라미드 뉴런의 수지상 수목화에 대한 CA3 피라미드 세포 축삭 프로젝트에서 유래한 Schaffer 담보(Sch C). 마이크로피펫은 개체군 급증(PS)을 기록하기 위해 피라미드층(str pyramidale)에 배치되었고, 필드 흥분성 시냅스후 전위(EPSP)의 수상돌기 기록을 위해 방사층(str radiatum)에 배치되었습니다. 자극 전극은 Schaffer 담보 내에 배치되었습니다. (B) 이 패널은 20ms 간격으로 동일한 자극 전극을 통해 가해지는 쌍의 자극에 의해 유발된 PS를 보여줍니다. 두 번째 자극(PS2)에 대한 집단 반응은 첫 번째 자극(PS1)에 대한 반응보다 진폭이 작습니다. (C) PS는 비선택적 GABAA 수용체 NAM(녹색 막대)인 β-CCM의 부재(검은색 막대) 및 존재 하에 기록되었습니다. β-CCM은 피드포워드 GABAergic 억제를 부분적으로 차단하여 두 번째 PS2의 진폭을 향상시켰습니다. 막대는 평균의 표준 오차를 나타내고 *** 데이터는 p <0.01로 매우 유의합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 경쟁적(억제 또는 변위) 분석에서 얻은 일반적인 결합 결과. 변위 결합 곡선이 생성되며, 이로부터 IC(50)와 Ki가 결정될 수 있습니다. IC50은 방사성 리간드의 특정 결합의 50%를 치환하는 경쟁 리간드의 농도이고, Ki(약물에 대한 억제 상수)는 방사선 리간드가 존재하지 않을 경우 수용체의 50%를 차지하는 경쟁 리간드의 농도입니다. Ki는 Cheng-Prusoff 방정식
를 사용하여 IC50에서 계산됩니다.
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그림 9: 주요 GABAA 수용체 아형에서 리간드 결합을 사용하여 경쟁적 변위 결합을 수행했습니다. 친화도(nM)는 [3H]플루마제닐 결합 분석법과 다른 인간 GABAA 수용체 서브유닛 조합으로 일시적으로 transfection된 HEK293 세포의 멤브레인을 사용하여 측정되었습니다. 히스토그램 표현은 α5β3γ2 수용체에서 Ki가 가장 낮은 화합물 RO493851에서 관찰된 민감도의 차이를 명확하게 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10: 수용체의 차등 GABA 민감도. 거미 플롯에 대한 수용체 GABA EC50의 플롯과 추정 서브유닛 조성의 표현은 서로 다른 서브유닛의 역할을 비교하는 효율적인 방법을 제공합니다. γ2 subunit의 도입은 수용체 민감도의 감소와 관련이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 11: 변조기의 효과 조사. (A) 이 패널은 자동화 시스템을 제어하는 데 사용되는 아이콘 시퀀스를 보여줍니다. 두 개(A/D) 아이콘은 컨트롤(녹색)과 변조기 노출 중(빨간색)의 녹음에 해당합니다. (B) 이 패널은 이러한 서열 동안 GABAA 수용체를 발현하는 세포에 기록된 전형적인 전류를 보여줍니다. 변조기의 효과를 평가하기 위해 먼저 고정된 농도의 GABA(녹색 흔적)에 노출되어 유발된 반응을 측정한 다음 먼저 GABA에 노출된 다음 GABA와 변조기(빨간색 흔적)에 노출되는 순서로 측정했습니다. 십자형 커서(청록색 및 파란색)를 배치하면 측정값이 구분되고 파란색 십자 표시는 두 기록 조건 간의 최대 차이를 나타냅니다. 제어 조건과 변조기 상태 간의 비율은 분석 소프트웨어에서 자동으로 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 12: 3번의 반복이 있는 히트 플롯. 이 패널은 인간 α5β3γ2 GABAA 수용체에서 96개 화합물에 대해 얻은 변조 효과의 3가지 반복에 해당하는 열 그래프를 보여줍니다. 0.5에서 1.2 사이의 대조군에 대한 테스트 응답의 비율은 대조군과 크게 다르지 않은 것으로 간주되었으며 녹색 점으로 표시되었습니다. 0.5 미만의 비율은 억제 효과를 나타내는 것으로 간주되었으며 파란색 점으로 표시되었습니다. 1.2 이상의 비율은 반응을 향상시키는 것으로 간주되었으며 빨간색 점으로 표시됩니다. 세 개의 독립적인 녹음 사이의 패턴의 유사성에 주목하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 13: α1β2γ2에서 카운터 스크리닝. (A) 이 패널은 추정되는 하위 단위 조직의 표현을 보여줍니다. 다음 패널은 (B-D) 비교 가능한 농도의 GABA 및 유사한 농도의 조절제(100μM)를 사용하여 인간 α5β3γ2 및 α1β2γ2에서 (F-H)에서 양성 알로스테릭 조절제의 효과에 대한 평가를 보여주며, 이는 이러한 실험에서 테스트된 화합물의 특이성을 강조합니다. (E) 이 패널은 또한 추정되는 하위 단위 조직의 표현을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 14: PAM 감도 및 수용체 조성. α1β2γ2 및 (E-H) α5β3γ2 수용체에서 일련의 디아제팜 효과(A-D) 농도의 효과를 측정하면 겉보기 친화도에서 거의 10배의 차이가 나타납니다. 또한 α1β2γ2 수용체에서 더 빠른 탈감작과 함께 반응 시간 과정에 대한 서브유닛 구성의 영향에 주목하십시오(예: 패널 D 및 H 참조). α1β2γ2 및 α5β3γ2 수용체가 GABA에 대해 서로 다른 친화도를 나타내므로(그림 10 참조) 두 수용체 사이의 작용제 농도는 유사한 활성화 범위에 있도록 조정되었습니다. (I) 이 패널은 제어 조건 대비 통일로 정규화된 전류 진폭의 폴드 증가 플롯을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 15: T7 및 CMV promotor를 포함한 발현 플라스미드. 이 패널은 Xenopus 난모세포(오른쪽 상단 패널)와 세포주에서 발현되는 플라스미드를 보여줍니다. 오른쪽 하단 패널은 패치 클램프 기록 전극과 함께 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질 주입된 전형적인 HEK-293 세포를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자 Frédéric Knoflach와 Maria-Clemencia Hernandez는 제약 회사인 F. Hoffmann-La Roche AG(4070 Basel, Switzerland)의 직원입니다. 저자 Daniel Bertrand는 HiQScreen Sàrl 6, rte de Compois, 1222 Vésenaz Geneva, Switzerland의 직원으로 제약 회사에 스크리닝 시설을 제공합니다.