데이터베이스 가이드-cytometry 골 골수성 세포 성숙의 평가 위한

Summary

MDS 진단 기준 형태학 또는 비 유익한 세포 유전학의 부재에 어렵습니다. MFC는 MDS 진단 과정을 구체화 도움이 될. 임상 연습에 유용 될, MFC 분석 기반으로 해야 합니다 매개 변수 충분 한 특이성 및 감도, 그리고 데이터 다른 연산자 사이 재현 되어야 합니다.

Abstract

프랑스 Cytometry 협회 (AFC)에서 시작 하는 작업 그룹 프랑스에서 골수성 질환 진단을 위한 multiparameter cytometry (MFC) 응용 프로그램을 조화 하기 위하여 개발 되었다. 여기에 제시 된 프로토콜 6 프랑스 진단 실험실 (대학 병원의 세인트 에티엔느, 그 르노 블, 클레르몽페랑, 니스, 그리고 릴과 인 바울은 Calmettes에 합의 하 고 2013 년 9 월과 11 월 2015 사이의 적용 했다 마르세유) 골 수 샘플 준비 및 데이터 수집의 표준화를 허용. 3 성숙 데이터베이스 neutrophil, monocytic, 및 erythroid 계보 골 수 기증자가 "건강 한" 개인 (개인 조 혈 질환의 증거 없이)에서 함께 개발 되었다. 각 골수성 혈통에 대 한 분석의 강력한 방법 일상적인 진단 사용 하기 위해 적용 해야 합니다. 새로운 경우 동일한 방식으로 분석 하 고 일반적인 데이터베이스와 비교 수 있습니다. 따라서, 양적 및 질적 phenotypic 이상이 확인 될 수 있다 고 정상적인 골 수 샘플의 데이터와 비교 하는 2SD 위에 병 리의 지표로 고려 되어야 한다. 주요 제한은 hybridoma 기술에 기반 하 고 현재 임상 진단에 사용 되는 방법으로 얻은 단일 클론 항 체를 사용 하 여 달성 하는 데이터 간의 높은 가변성입니다. 데이터 취득 기술 유효성 검사에 대 한 기준을 설정 MDS 진단에 대 한 MFC의 유틸리티를 개선할 수 있습니다. 이러한 기준의 설립 데이터베이스에 대 한 분석을 요구 한다. 데이터 분석에서 조사 주관의 감소는이 방법의 중요 한 장점입니다.

Introduction

Phenotypic 마커 골수성 세포에서 발생 하는 MDS 개시 및 진행 하는 동안 dysplastic 변화에 특정의 부재, 새로운 접근의 성숙 경로 (변경 된 식의 평가에 따라 최근 몇 년 동안에서 제안 되었습니다. 성숙한 골수성 세포의 생산 동안 골수성 항) 또는 다른 종류의 세포 골 수 (BM) 내에서 비정상적인 분포의 세포 구획^1,2.

이 문서는 BM 골수성 세포 구획 형성 증후군 (MDS) 또는 다른 골수성 혈액 질병에 관련 된에서 dysplastic 변화를 감지 하기 위해 MFC의 표준화 된 응용 프로그램에 대 한 새 메서드를 제공 합니다. 이 연구는 또한 성숙 데이터베이스를 사용 하 여 MFC 데이터 분석에 대 한 유틸리티를 보여 줍니다.

샘플 준비 절차, 데이터 수집, 데이터베이스를 사용 하 여 분석의 표준화 관련 BM 골수성 세포에서 dysplastic 변화에 가장 관련성이 높은 phenotypic 이상 식별을 수 있습니다. 따라서, 잘 분류 하 고 잘 인식 형식 (자동 인구 구분 (AP) 다이어그램, 히스토그램, 점 작)에 따라 통계적으로 선택한 하위 집합은 이후 분석에 사용할 수 있는 분석 전략 개발에 필요한 반올림합니다. MDS에서 강력한 phenotypic 이상이 발견 경우에 함께 또는 최소한의 형태 발육 이상 없이 cytogenetic aberrancies 없이 진단을 쉽게 것 이다. 차별 매개 변수 immunophenotypic 패널의 감소에 대 한 허용의 현재 점수², 임상 병 리 실험실에서 그들의 적용을 허용 단순화할 수 있습니다.

이 방법으로 MDS 진단³신호 cytometry 데이터의 주관적인 해석을 제한 합니다. 이 단계는 처리 흐름 데이터⁴를 분석 하기 위한 자동화 도구 개발을 위한 전제 조건입니다.

MDS에 있는 spliceosome 돌연변이를 MDS 형 특정 epigenetic 한정자와 협력 하는 클론 조 혈 줄기 세포 (HSC) 무질서의 이질적인 그룹으로 구성 됩니다. 그것은 지금, HSC 돌연변이, 함께 다른 메커니즘 MDS 이상, 정도 벗어난 면역 중재 염증 등 악성 HSCs는 BM의 실질 microenvironment 사이 상호 작용에에서 관련 된 알려져 있다. 그러나, 이러한 메커니즘 제대로 이해 남아 있다. MDS의 넓은 임상과 생물학이 도전 진단과 최적의 치료의 선택은. 지난 10 년간에서 여러 연구 MFC는 종종 더 많은 형태, 기술적, 경제적 제약 보다 발육 이상² 감지에 민감한 어렵게이 기술을 표준화, 결과 따라 자주 하는 ³통역 경험입니다. 또한, 그것은 불분명 얼마나 MFC는 다른 비 클론 BM에서 경우 또는 최소한의 형태 발육 이상 없이 및 cytogenetic 변칙의 부재 또는 hypocellular MDS, 낮은 폭발 카운트와 같은 경계선 경우 MDS 향해 균형 팁 수 있습니다. 골 수 오류 장애 (즉., aplastic 빈 혈). 그것은 또한 급성 골수성 백혈병 (AML) 폭발의 초과 MDS의 경계선 경우를 구분 하기 어려운 남아 있다. 모든 이러한 이유로, MFC 테스트 MDS 최종 진단에 임상 지침 통합 하지 않습니다. 2011 년에 미국 국립 종합 암 네트워크 (NCCN) CD34 + 세포의 비율, 발작 야행성 hemoglobinuria 클론의 검색 및 hypocellular MDS⁵에서 세포 독성 T 세포 클론의 존재의 추정에 대 한 MFC를 권장. 이러한 두 가지 후자의 경우는 또한 임상 데이터 면역 치료⁶이러한 환자 들의 좋은 반응을 보여왔다 때문에 치료 목표를 포함 한다. 국제 작업 그룹 (IWG) 권고를 인용 2017 NCCN 가이드라인, 나열 MDS 진단 하지만 모든 사양⁶하지 않고 공동 기준 사이에서 MFC에 의해 탈 선 immunophenotyping 탐지. 또한, 최근 발표 된 WHO 분류 규정 MFC 결과 혼자 결정적인 형태학 및 cytogenetic 데이터⁷의 부재에서 MDS의 기본 진단 설정 충분 하지 않습니다. 그러나 MFC 골수성 세포의 dysregulation 성숙 패턴을 보여주는 고 질병 과정에서 특정 시간에 환자에 대 한 정상에서 "거리"를 측정 하는 추가 테스트로 사용할 수 있습니다.

이 방법은 MFC immunophenotyping를 사용 하 여 MDS 또는 dysplastic 이상으로 다른 골수성 질환에서 진단 구체화 BM 골수성 세포에서 형성 평가에 관심이 있는 임상 실험실에서 적용 됩니다.

Protocol

아래 나열 된 프로토콜은 "위원회 회의 드 보호 des Personnes" (독립적인 윤리 위원회)에 의해 승인 되었습니다 Sud Est 1 대학 병원의 세인트 에티엔느, 프랑스에서.

1. Cytometer 설정

참고: cytometer 설정 EuroFlow 절차 "EuroFlow 표준 운영 프로토콜 (SOP) 계기 설치 및 보상 (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php)에 따라 프랑스 흐름 권장 사항에 따라 수행 했다.

1. 월별 악기 설치
   1. cytometer 켭니다. 모든 액체 레벨 적절 한 고 디바 6.1.3 인지 확인 합니다. 응용 시작 수행: 메뉴 모음에서 선택 ' Cytometer | 응용 시작 '. '확인' 메시지가 표시 되 면 클릭 합니다. 적어도 30 분을 위해 따뜻한 cytometer 허용.
   2. 성능 체크-중부 표준시 구슬
      참고:이 단계에 대 한 준비 12 75 m m 폴리스 티 렌 튜브, CST 구슬과 칼 집 액체 ( 재료의 표참조).
      1. 12 x 75 m m² 폴리스 티 렌 튜브 라벨 '중부 표준시 '. 부드러운 반전 또는 매우 부드러운 vortexing에 의해 제공 된 비드 유리병을 믹스. 레이블이 지정 된 튜브에 추가: 0.35 mL 칼 집 액체과 중부 표준시 구슬의 1 방울. 소용돌이 관 부드럽게 수집을 진행. 경우에 즉시 인수 하지 어둠 속에서 2-25 ° C에서 최대 8 h에 대 한 튜브를 저장 합니다.
      2. 성능 검사: 메뉴 모음에서 선택 ' Cytometer | 중부 표준시 '.
      3. 중부 표준시 모듈의 '설정' 탭에서: 기본 4-2 H-2V 구성에서 칸 토 II를 확인 하 고 또한 초기 중부 표준시 구슬의 현재 많은 사용 하 여 만든이 구성에 대 한 있는지 확인. 초기 계획을 존재 하지 않는 경우 중부 표준시 구슬 IFU를 참조 하십시오. 이 초기 기간이 만료 되지 않은 확인: ' 설정 관리 ', 드롭 다운 메뉴에서 ' 확인 성능 ' 을 선택 합니다.
      4. '튜브를 수동으로 로드' 를 확인 하 고 '실행'을 클릭 합니다. 로트 번호 표시를 확인 합니다. 부드럽게 소용돌이 희석된 구슬 위에 준비 하 고 프롬프트가 표시 되 면, 희석된 비즈 로드 '확인'을 클릭 합니다.
      5. 성능 검사 완료 되 면 확인 Cytometer 성능을 전달 합니다. '보고서 보기'를 클릭 합니다. 결과 통과 하지 못한 경우 성능 검사를 다시 실행 합니다. 성능 추적 보고서 날짜와 PDF 형식으로 보고서를 저장 합니다.
   3. '형광 PMT 전압' 무지개 구슬 (자료 테이블)을 조정 합니다.
      참고: 대상 값에 Euroflow 표준 운영 절차 (SOP) "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads" 권리 규정 됩니다. 이 SOP는 Euroflow 사이트 (www.euroflow.org;; 공공 영역에 사용할 수 프로토콜 탭을)입니다.
      1. 를 통해 새 실험을 만듭니다 ' 월간 악기 설치 날짜 | 표본 '.
      2. ', 광학 매개 변수 및 형광 (FITC, PE, PerCPCy5.5, PE Cy7, 송출, APC H7, V450, V500), 관 우려에 해당 선택 하 고 원하는 수집 매개 변수를 확인 (로그, A, H/W 또는). (실험의 ' Cytometer 설정 ' 에 마우스 오른쪽 클릭) 현재 중부 표준시 설정을 적용 합니다. 10, 000에서 FSC 매개 변수에 대 한 임계값을 설정 합니다.
      3. Cytometer, 해제 보상 형광 대상 MFI 설정; PMT 전압을 설정 하는 동안 이 위해 '관리자', ' 보상 사용 ' 옵션을 체크 해제 하 여 비활성화 보상 '보상' 탭으로 이동.
      4. 모든 필요한 점 플롯 워크시트 ' 대상 MFI' 만들기 (n = 2; FSC SSC, FITC PE 대 대), 히스토그램 (n = 8; 한 히스토그램 각 형광 검출기) 및 피크 값 (MFI와 CV) 각 형광 채널에 대 한 참조를 보여주는 통계.
      5. 8-피크 레인 보우 구슬 교정 입자 증류수와 사용 하기 전에 소용돌이의 1 mL에 1 방울을 희석. '낮은' 흐름 속도에서 8 피크 레인 보우 비즈 솔루션 기록 없이 취득. 경우에 즉시 인수 하지 어둠 속에서 최대 8 h 2-25 ˚C에 대 한 튜브를 저장 합니다.
      6. 게이트 내의 비즈 SSC 이항 점 작 대 FSC에서 ' 인구 P1' 와 PE 이항 점 작 대 FITC에서 8 또는 7 피크 (밝은 피크 또는 다음 아래쪽, 그것 "20180302_7th_ Euroflow 문서에 규정 되어 Peak_Target_Values_Rainbow_Beads")이이 게이트 인구 P2 이름을.
      7. 8 봉우리 무지개 구슬 서 스 펜 션의 수집을 계속 하 고 대상 MFI 값 "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads" Euroflow 문서에 따르면 도달 모든 형광 채널에서 PMT 전압 조정.
      8. 8 또는 7 피크에 대 한 대상 MFI 값에 도달 하면, 일단 달성 대상 MFI와 해당 최종 PMT 값을 기록 합니다. 5000 이벤트를 수집 하 고 데이터를 기록 합니다.
         참고: 단계 1.2.3 (성능 체크-무지개 구슬 PMT 값 확인)에 아래 사용 PMT 값이 있어야 합니다.
      9. 인쇄 워크시트 ' 대상 MFI' 및 악기 설정 화면 및.jpg 그림으로 저장 하는 이러한 값을 기록 합니다.
         주: "새로운" 튜브를 만들 때 가끔 PMT 값 다 예기치 않게. 이 위해, PMT의 이중 확인이 필수적입니다. 때마다 노트, ' 대상 MFI' 값 및 PMT 값 올바른지 확인을 PMT 값 비교!
      10. '응용 프로그램 설정'을 저장 합니다. 브라우저에서 ' Cytometer 설정 '에 마우스 오른쪽 단추로. 드롭 다운 메뉴에서 ' 응용 프로그램 설정 '을 선택 하 고 저장 합니다. '확인'을 클릭 합니다. 메시지가 나타나면, 임계값 값을 유지 하려면 예를 클릭 합니다.
          참고: 기본 이름을 사용 하 여 응용 프로그램 설정을 저장 합니다. 설정 이름을 하지 마십시오.
   4. Lysed 씻어 피 (LWB) 'FCS' 및 'SSC 전압' 을 조정 합니다.
      참고:이 단계는 건강 한 자원 봉사자, lysing 솔루션 (자료 테이블) 및 세척 버퍼에서 말 초 혈액 (PB) 샘플의 50 µ L 필요 합니다.
      1. Pipets 50 관으로 PB의 µ L. 갓 희석된 lysing 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 실시간에 10 분 동안 품 어
      2. 540 x g에 5 분 동안 원심 분리기.
      3. 튜브에 약 50 µ L 잔여 볼륨을 떠나 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음. 부드럽게 혼합 하 고 필터링 된 세척 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다.
      4. 540 x g에 5 분 동안 원심 분리기.
      5. 한 번 더 단계 1.1.4.3–1.1.4.4를 반복 합니다.
      6. 필터링 된 세척 버퍼의 250 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합.
      7. 레인 보우 비즈 인수 위해 만든 실험에서 만드는 새로운 ' 견본 | 새 워크시트 ': 이중 파라메트릭 SSC A / FSC-A 그래프를 그릴.
      8. 셀을 취득, SSC 이항 점 작 대 FSC에 림프 톨 게이트, 문이 림프 구 인구에 대 한 다음과 같은 말은 대상 값에 도달 하는 FSC 그리고 SSC 전압 조정: FSC: 55000 (범위 50000-60000) 및 SSC: 13000 (11000 –15,000 범위).
      9. 취득 하 고 약 10000 이벤트와 데이터를 기록 합니다. 문이 림프 톨에 대 한 평균 FSC 그리고 SSC 대상 값을 확인 합니다. 필요한 경우 FSC 그리고 SSC 전압을 재조정 하 고
      10. 화면을 인쇄 하 고 가져온 대상 채널 값의 인쇄를 저장 합니다.
   5. 형광 보상 설정입니다.
      참고: 단일 스테인드 보상 제어 대상 MFI 설정 후 설정 해야 합니다 그리고 FSC/SSC 설정 설립 되었습니다. 이 단계는 건강 한 자원 봉사자, 보상 입자 (자료 테이블)에서 PB lysing 솔루션 및 버퍼 세척 필요 합니다. 형광 보상 행렬 및 그들의 참조 인구를 설치 하는 데 사용 하는 형광 색소 활용 된 항 체 시 약의 목록 표 1에 나열 됩니다.
      1. 형광 보상을 설정에 사용 될 시 약 당 하나의 튜브 라벨 (FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, V450, V500, PECy7-CD117, APC-H7-CD10, APC H7-CD14 및 APC H7-CD71)와 "빈/흠 없는" 관.
      2. 피펫으로 50 µ L PB 각 관으로 또는 "부정적인" 보상 입자의 + 보상 제어 튜브에 "긍정적인" 보상 입자의 1 방울 1 방울의 표 1에 나와.
      3. 튜브를 항 체 시의 적절 한 금액을 추가 합니다. 필터링 된 세척 버퍼 튜브 당 100 µ L의 최종 볼륨에 도달 하 여 부드럽게 혼합 추가 합니다. RT, 빛에서 보호에서 15 분 동안 품 어.
      4. 만 셀 튜브에에서 갓 희석된 lysing 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 부드럽게 혼합. RT, 빛에서 보호에서 10 분 동안 품 어.
      5. 540 x g에 5 분 동안 원심 분리기.
      6. 각 관에서 잔여 볼륨을 약 50 µ L를 떠나 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음. 부드럽게 혼합. 필터링 된 세척 버퍼의 2 개 mL를 추가 합니다.
      7. 540 x g5 분 원심
      8. 각 관에서 잔여 볼륨을 약 50 µ L를 떠나 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음. 필터링 된 세척 버퍼 튜브 당 250 µ L의 최종 볼륨에 도달 하 여 부드럽게 혼합 추가 합니다.
      9. 보상 컨트롤을 만듭니다.
         1. 메뉴 모음에서 만든 무지개 구슬 수집에 대 한 실험을 선택 합니다. 새 를 만듭니다 ' 견본 | 보상 설치 | 보상 컨트롤 만들기.
         2. 결과 대화 상자에서 ' 포함 별도 흠 없는 제어 튜브/잘 ' 확인란을 선택 합니다. FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, HV450, HV500 일반 보상 (안 레이블 전용) 컨트롤을 만듭니다. PE-Cy7-CD117, APC-H7-CD10, APC H7-CD14 및 APC H7-CD71에 대 한 레이블 관련 보상 컨트롤을 만듭니다. '확인'을 클릭 합니다.
         3. 새 워크시트에 bi 패라메트릭 SSC A / FSC-A 그래프 만들고 세포 (P1)에 해당 하는 각 관에 감지 될 것 이다 고 긍정적인 피크에 대 한 P2 게이트 그릴 형광 색소 히스토그램 게이트를 그릴 합니다. 흠 없는 제어 튜브를 제외 하 고 p 2에 이벤트 수를 시각화 하기 위해 계층 구조 그래프와 선택 ' 인구 계층 표시 '(오른쪽 클릭)를 표시 합니다.
         4. 브라우저에서 보상 컨트롤 견본을 확장 합니다.
         5. 소용돌이 흠 없는 세포 준비 위, 3-5 미 설치는 cytometer에서 준비 된 흠 없는 세포. 유량을 조정 '매체 ' ' 데이터 수집 '을 클릭 합니다. FSC-A vs SSC-A 점 플롯에서 림프 구 인구를 완벽 하 게 포괄 하는 P1 게이트를 조정 합니다. P1에 마우스 오른쪽 단추로. '모든 보상 제어에 적용'을 선택 합니다.
         6. '수집' 대시보드에서 클릭 '레코드 데이터 ' 5000 이벤트를 얻으려고. 모든 단색 스테인드 제어 셀 P2 간격 게이트 긍정적인 인구 포함을 확인 합니다.
         7. PE-Cy7 및 APCH7 튜브에 대 한 히스토그램을 P3 간격 게이트를 추가 하 고 그것은 부정적인 인구를 포함 하 고는 P2 긍정적인 인구 포함.
         8. 보상을 계산 합니다. 메뉴 모음에서 선택 ' 실험 | 보상 설치 | 보상을 계산 '. 보상 매트릭스 이름: '보상 데이트'. '링크 및 저장'을 선택 합니다.
         9. 카탈로그 응용 프로그램 설정에서 보상 매트릭스를 저장: 클릭 'Cytometer 설정 | 응용 프로그램 설정 | 저장 ', 보상 행렬 '보상 날짜' 이름 및 '확인'을 클릭 합니다.
         10. 브라우저에서 ' Cytometer 설정 '를 클릭 합니다. 관리자에서 오른쪽 아래 모서리에 '보상' 탭을 클릭 합니다 인쇄를 이동 합니다.
             참고:이 정보 또한 카탈로그에서 검색할 수 있습니다.
         11. 보상 매트릭스의 제어 합니다.
             1. 믹스 한 튜브에 모든 단일 스테인드 튜브 (APCH7 선택).
             2. 새로운 견본을 추가 '보상 확인 날짜'라는 새로운 실험을 만들이 실험의 ' Cytometer 설정 ' 에 오른쪽 클릭 하 고 를 선택 ' 링크 | 연결 끊기 | 응용 프로그램 설정 ' 1.1.3.10 단계에 저장. 새로운 설정으로이 관에서 50000 이벤트를 취득 합니다.
             3. 새로운 글로벌 워크시트 적용 됩니다. 1 점 플롯 FSC-A/SSC-A를 만들고 세포를 시각화 하기 위해 게이트를 그리기 및 n (n-1) x / 2 다른 플롯 림프 톨 게이트 2-2 매개 변수를 시각화에 초점을 맞춘.
2. 매일 악기 설치
   1. cytometer 켭니다. 모든 액체 레벨 적절 한 고 디바 6.1.3 인지 확인 합니다. 응용 시작 수행: 메뉴 모음에서 선택 ' Cytometer | 응용 시작 '. '확인' 메시지가 표시 되 면 클릭 합니다. 적어도 30 분을 위해 따뜻한 cytometer 허용.
   2. 성능 체크-중부 표준시 구슬: 반복 단계 1.1.2.1–1.1.2.5.
   3. 성능 검사-무지개 구슬 PMT 값의 확인.
      1. ' 무지개 구슬 ' 로 폴리스 티 렌 튜브 라벨 고 로트 번호 사용에서 하나 인지 확인 합니다. 철저 하 게 믹스 레인 보우 구슬 유리병. 무지개 구슬 준비, 이온 또는 증 류 된 물 1 mL를 무지개 구슬의 1 방울을 추가 합니다. 빛 으로부터 보호 합니다.
         참고: 인수를 진행 하십시오 또는 취득까지 2-8 ˚C에서 튜브를 저장.
      2. 새 실험 만들기: ' 무지개 구슬 날짜 '.
      3. 보정을 연결: 마우스 오른쪽 클릭 ' Cytometer 설정 '에 ' 연결 설정 '을 선택, 단계 1.1.5.9.9에서에서 만든 적절 한 보상 매트릭스 선택한 '덮어쓰기'를 선택.
      4. 보상의 연결을 해제: ' Cytometer 설정 '클릭 마우스 오른쪽, '이전 연결된 설정에서 연결 해제' 를 선택 하 고 '확인'을 클릭 합니다.
      5. ' 응용 프로그램 설정 '적용: ' Cytometer 설정 '클릭 마우스 오른쪽, ' 응용 프로그램 설정 '을 선택, 월별 설치 중 단계 1.1.3.10에서에서 만든 설정을 적용 및 선택 '보상 값 유지 '.
      6. '보정 사용'을 선택 취소 합니다.
      7. 무지개 구슬에 대 한 워크시트 서식 파일 실험에서 새로운 견본을 만듭니다. '낮은' 인수에 튜브를 얻을.
      8. 구슬 수집 동안 P1 게이트 내의 비드 인구를 포함 하도록 조정 합니다. 내의 비드 인구를 포함 하도록 / PE A FITC A 점 음모에 P2 게이트를 조정 합니다. 10000 이벤트를 기록 합니다.
      9. MFI와 P2 인구에 대 한 가져온 CV 값은 프로토콜의 미리 정의 된 대상에 되는지 확인 합니다. 그렇지 않은 경우는 cytometer 세척 하 고 작업을 다시 시작. PDF 형식으로 보고서를 저장 합니다.

2. BM 샘플 준비

참고: 셀 세척 얼룩 절차 전에 프로토콜을 수행 합니다.

1. 15 mL 원심 분리기 튜브로 기본 샘플의 600 µ L 플라스틱.
2. 추가 버퍼 세척의 10 mL (PBS + 0.5 %BSA [> 98% 순수 BSA] + 0.09% 할머니₃ 필터링 솔루션, pH 7.4). 세포 현 탁 액을 피 펫을 사용 하 여 잘 혼합.
3. 540 x g (워시 1)에서 5 분 동안 원심 분리기. 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 버리십시오.
4. 단계 2.2-2.3 (세척 2)를 반복 합니다.
5. 버퍼를 세척의 400 µ L에서 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
6. 백본 마커 얼룩. FACS 분석, 환자 데이터와 "백본" 식별을 위한 폴 리 프로필 렌 튜브에 백본 항 체의 전체 볼륨을 전송. 세척된 샘플 (패널에 모든 튜브를 작성 하는 데 필요한 세척된 샘플의 볼륨)의 350 µ L를 추가 합니다. 피 펫을 사용 하 여 잘 혼합.
   참고: 백본 표면 막 얼룩 ( 표 2에서 같이)에 대 한 항 체의 전체 볼륨을 계산 합니다.
7. 같은 양의 FACS 분석, 환자 데이터와 "튜브 번호 1" 확인에 대 한 3 폴 리 프로필 렌 튜브 샘플 백본 혼합 플라스틱 "튜브 번호 3". 필요한 경우 세척 버퍼를 사용 하 여 튜브 당 200 µ L의 최종 볼륨에 도달.
   주의: 튜브;의 벽에는 샘플의 어떤 흔적을 남기지 않으려고 조심 그렇지 않으면,이 세포는 스테인드 하지 것입니다. 필요한 경우 소용돌이 세포와 원심 분리기 튜브.
8. 각 관에서 항 체에 지정 된 표 2세포 표면 마커 (백본 마커) 제외에 대 한 감독의 적절 한 볼륨을 추가 합니다. 피 펫을 사용 하 여 잘 혼합. 빛에서 보호 하는 RT에 30 분 동안 품 어.
9. Lysing 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다. 피 펫을 사용 하 여 잘 혼합. 빛에서 보호 하는 RT에 10 분 동안 품 어.
10. 540 x g에 5 분 동안 원심 분리기. 각 관에서 잔여 볼륨을 약 50 µ L를 떠나 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 버리십시오. 피 펫을 사용 하 여 잘 혼합.
11. 버퍼 셀 펠 릿을 세척의 2 개 mL를 추가 합니다. 피 펫을 사용 하 여 잘 혼합.
12. 단계 2.10-2.11 (세척 2)를 반복 합니다.
13. 540 x g에 5 분 동안 원심 분리기. 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 삭제 하 고 다시 PBS의 200 µ L에서 셀 펠 릿을 일시 중단. 피 펫을 사용 하 여 잘 혼합.
14. 착 색 직후 셀, 선호, 취득 또는 교류 cytometer에서 측정 될 때까지 1 시간 더 이상에 대 한 빛에서 보호 된 4 ℃에서 저장.

3. 데이터 수집

1. 디바 소프트웨어에 새로운 실험을 열고 이름, 샘플 및 날짜 유형의 이름을 바꿉니다.
2. 3 튜브를 포함 하는 새로운 견본을 만듭니다. 각 관에 사용 되는 항 체 실험 레이아웃에 지정 합니다.
3. ' Cytometer 설정 '에 오른쪽 클릭, ' 응용 프로그램 설정 ' 을 선택 하 고 월별 설치 (단계 1.1.3.10)에서 얻은 값을 적용.
4. 새로운 글로벌 워크시트를 열고 점 플롯 만들기: SSC-A / FSC-A, SSC A / CD45 HV500 A, SSC-A / A FITC, SSC A / PE A, SSC-A / CD34-PerCP-Cy5.5, SSC-A / CD117-PECy7-A, SSC-A / APC-A, SSC-A / APCH7-A, SSC-A / HLA-DR-HV450-. SSC-A/FSC-A 점 플롯 내의 셀 선택 게이트를 만듭니다. SSC-A/CD45-BV500-A 점 플롯에서 게이트 선택 4 인구를 만듭니다: granulocytes, monocytes, 폭발, 및 림프 톨. 이전에 만든 점 플롯에이 인구를 프로젝트.
5. 1.1.5.9.11.3 단계에서 설명한 대로 보상 제어를 위한 새로운 글로벌 워크시트를 만듭니다.
6. '매체' 수집 및 기록 500000 이벤트/튜브 튜브를 얻을. 기술 검증 (보상 및 적절 한 얼룩의 평가), 후 FCS3.0 파일로 데이터를 내보냅니다.

4. 데이터 분석

참고: 다음과 같이 건강 한 기증자 및 조 혈 질환에 대 한 어떤 증거도 없이 개인 사용된 파일을 했다 정상 BM 데이터베이스를 생성 하는 Neutrophils_NM에 대 한 18 파일에서 11 데이터베이스 Monocytes_NM 데이터베이스에 대 한 18 파일 및 18에서 14에서 10 NRC_NM 데이터베이스에 대 한 파일입니다. 파일 삭제 다양 한 기술적 문제를 보여준 대표적인 결과 섹션에 제시 된으로. 파일은 개별적으로 호 중구 계보 (프로필 Neutrophils_Maturation.inp), 그림 2에 대 한 그림 1A(1-3) 에 묘사 된 다양 한 전략에 부합 하는 Infinicyt 소프트웨어 (자료 테이블)를 사용 하 여 분석 A monocyte 계보 (프로필 Monocytes_Maturation.inp), 및 그림 3A(1-2) erythroid 세포 계보 (프로 파일 NRC_Maturation.inp).

1. 호 중구에 대 한 분석의 전략 -Neutrophils_NM 데이터베이스 건설 
   1. CD34 + neutrophil 커밋된 폭발 CD34 + CD117 + HLADR + 낮은 CD10-CD13 + CD11b-이벤트 (그림 1A.1)을 선택할 수 7 게이츠의 교차로 사용 하 여 식별 합니다. 인구 계층 트리에서 '호 중구' 탭에 이러한 이벤트를 할당 하 고 그 후 남은 이벤트 (회색)의 디스플레이에서 (파란색으로 표시) 이러한 셀을 제거 하려면이 탭을 선택을 취소.
   2. CD117 + CD34-CD13 + CD11b-HLADR +A(2) 그림 1에서처럼 6 게이츠의 교차로 사용 하 여 낮은 호 중구 선구자를 분리 하 고 '호 중구' 탭에 할당 합니다.
   3. 더 성숙한 호 중구 4 문, CD45dim SSCint-안녕하세요 CD117-HLADR-세포의 차별과 그들의 임무는 '호 중구' 탭에 대 한 수의 교차를 사용 하 여 식별 합니다.
   4. 나머지 이벤트, 중 성구만을 표시, 유지 다음 를 클릭 하 여이 인구를 내보내기 선택을 취소 ' 파일 | 수출 ' 하 고 모든 필요한 매개 변수는 확인 하 고 FCS 파일로 데이터를 저장할 확인.
   5. 구성 된 모든 내보낸된 FCS 파일 병합 된 파일에서 각 부분 모집단에 대 한 마커의 표현의 강도 평가 하 여 품질 검사를 수행 합니다. AP를 사용 하 여 각 파일에 대 한 중앙값 및 SD 곡선, 각 부분 모집단에 대 한 음모 제거 2SD 곡선 (대표적인 결과 섹션에서 세부 사항을 참조) 이외의 경우 (그림 1B).
   6. "호 중구" 표시와 결과 구성된 파일에서 APS 다이어그램 (그림 1C 왼쪽)에서 성숙 통로 그릴 하 고.cyt 파일로 저장 합니다.
      참고: 비교 다이어그램 성숙 정규화 된 데이터베이스에 대해 표시 하는 Neutrophils_NM 데이터베이스에 포함 된 모든 파일에서 모든 매개 변수는 시각화 수 있습니다. 그림 2C, 오른쪽에에서 표시 하는 다이어그램 Neutrophils_NM 데이터베이스에 포함 된 모든 파일을 보여줍니다 (n = 11) 2에 SD 그룹의 중앙값과 비교.
2. Monocytes-Monocytes_NM 데이터베이스 건설에 대 한 분석의 전략
   1. Monocytic 계보 셀을 식별 (CD117 CD64 + + 안녕하세요 HLADR + 안녕) 4 개의 게이트 (그림 2A)의 교차로 사용 하 여. 인구 계층 트리에서 'Monocytic' 탭에 이러한 이벤트를 할당 합니다.
   2. Monocytic 셀만을 표시, 유지, 나머지 이벤트 다음 를 클릭 하 여이 인구를 내보내기 선택을 취소 ' 파일 | 수출 ' 하 고 모든 필요한 매개 변수는 확인 하 고 FCS 파일로 데이터를 저장할 확인.
   3. 구성 된 모든 내보낸된 FCS 파일 병합 된 파일에서 각 부분 모집단에 대 한 마커의 표현의 강도 평가 하 여 품질 검사를 수행 다음 2SD 곡선 (대표적인 결과 섹션에 있는 세부 사항) 외부 경우 제거 (그림 2 B)입니다.
   4. "Monocytic" 셀 표시와 결과 파일에서 APS 다이어그램 (그림 2C 왼쪽)에서 성숙 통로 그릴 하 고 이것을.cyt 파일로 저장.
      참고: 비교 다이어그램 성숙 정규화 된 데이터베이스에 대해 표시 하는 Monocytes_NM 데이터베이스에 포함 된 모든 파일에서 모든 매개 변수는 시각화 수 있습니다. 그림 2C, 오른쪽에에서 표시 하는 다이어그램 Monocytes_NM 데이터베이스에 포함 된 모든 파일을 보여줍니다 (n = 10) 2에 SD 그룹의 중앙값과 비교.
3. Nucleated 레드 셀 (NRCs)-NRC_NM 데이터베이스 구조 분석의 전략
   1. CD34 + erythroid 저지른 폭발 CD34 + CD117 + HLADR + 낮은 CD105 + CD33-CD36 + CD71 + 이벤트 (그림 3A(1))의 선택을 허용 하는 7 개의 게이츠의 교차로 사용 하 여 식별 합니다. 인구 계층 트리에서 "NRC" 탭에 이러한 이벤트를 할당 한 다음 나머지 이벤트 (회색)의 디스플레이에서 (빨간색에서 표시) 이러한 셀을 제거 하려면이 탭을 선택을 취소 합니다.
   2. 더 성숙한 NRCs의 CD45-차별을 허용 하는 4 개의 게이츠의 교차로 사용 하 여 식별 / SSClow CD36 흐리게 + + 안녕하세요 CD71 + 안녕하세요 + CD105 세포. "NRC" 탭 (그림 3A(2))에 이러한 이벤트를 할당 합니다. 혈소판 (CD36 + 안녕 SSClow 세포) NRC 인구 (그림 3A(2))에서 제거 해야 합니다.
   3. NRC 셀만을 표시, 유지, 나머지 이벤트 다음 를 클릭 하 여이 인구를 내보내기 선택을 취소 ' 파일 | 수출 ' 하 고 모든 필요한 매개 변수는 확인 하 고 FCS 파일로 데이터를 저장할 확인.
   4. 구성 된 모든 내보낸된 FCS 파일 병합 된 파일에서 2SD 곡선 (대표적인 결과 섹션에 세부 정보 참조) (외부 케이스의 제거 다음, 각 부분 모집단에 대 한 마커의 표현의 강도 평가 하 여 품질 검사를 수행 그림 3 B)입니다.
   5. "NRC" 셀 표시와 결과 파일에서 APS 다이어그램 (그림 3C, 왼쪽)에서 성숙 통로 그릴 하 고 이것을.cyt 파일로 저장.
      참고: 비교 다이어그램 성숙 정규화 된 데이터베이스에 대해 표시 하는 NRC_NM 데이터베이스에 포함 된 모든 파일에서 모든 매개 변수는 시각화 수 있습니다. 그림 3C, 오른쪽에에서 표시 하는 다이어그램 NRC_NM 데이터베이스에 포함 된 모든 파일을 보여줍니다 (n = 14) 2에 SD 그룹의 중앙값과 비교.
4. BM 골수성 격실 성숙 데이터베이스를 사용 하 여에 성숙의 평가
   1. 관심의 혈통에 해당 하는.cyt 파일을 열고 (즉,., 호 중구 혈통, monocytic 계보에 대 한 Monocytes_NM_GMFF.cyt 및 erythroid 계보에 대 한 NRCs_NM_GMFF.cyt에 대 한 Neutrophils_NM_GMFF.cyt).
   2. 관심의 혈통에 해당 하는 탭 아래의 '성숙' 탭에서 마우스 오른쪽 단추로 클릭 (' 호 중구 | Monocytic | NRC') 성숙 성숙 데이터베이스를 저장 하 고.
   3. 새로운 FCS 파일 열고 분석을 수행 하는 이전에 설명 된 대로 (호 중구, 단계 4.2.1, Monocytic 세포에 대 한 4.1.1–4.1.3 단계 고 nrc가 대 한 4.3.1–4.3.2 단계).
   4. 관심사의 인구에 대 한 성숙 경로를 그립니다.
   5. '도구' 탭 (데이터베이스 분석)에서 해당 데이터베이스를 열고 해당 성숙 데이터베이스와 분석 인구를 비교 합니다. 사용 가능한 데이터베이스와의 호환성에 대 한 데이터 확인: 완전 한 호환성 (녹색 삼각형); 대부분의 경우 불일치 (노란색 삼각형); 매개 변수 이름에 부분 호환성 그리고 호환성 (빨간 삼각형)입니다.
   6. 데이터 호환 또는 부분 호환 있다면, 소프트웨어 ' 성숙 정규화 차이 ' 다이어그램을 만듭니다. ' 매개 변수 밴드 성숙 차이 '시각화 '다이어그램' 탭에서 새 다이어그램을 열고, '성숙' 을 클릭 하 고 얼마나 많은 매개 변수를 표시, 클릭을 선택 '확인' 및 다이어그램 표시 됩니다. 마우스 오른쪽 단추로 클릭 다이어그램; 데이터 시각화, 데이터베이스 시각화 및 성숙 다이어그램 시각화에 변경할 수 있습니다.
   7. 새 파일 및 데이터베이스에 포함 된 데이터 간의 차이의 의미를 시각화 하려면 구성 확대 ( ' 성숙 정규화 차이 ' 를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 '확대'적용).

Results

K-EDTA 응고 제에는을 걷이 54 BM 샘플 연구에 포함 됐다. MFC 데이터는 환자에 대 한 어떤 정보가 없을 경우에 분석 되었다. 회고전 연구 BM 샘플 (5 남성 및 47.4 [35-48]의 중간 나이 2 여성, 11 (8 남성과 57.9 [35-72]의 중간 나이로 3 여성) 조 혈 질환의 증거 없는 개인과 다양 한 36 경우 7 건강 한 기증자 로부터 나타났다 병 적인 조건: 1 경우 빈 혈과 낮은 크 수준, 3의 경우 빈 혈과 높은 크 수준, 빈 혈, 염증의 경우 8 1 경우 빈 혈으로 인 한 비타민 B₁₂ 결핍, 빈 혈 ± 4 경우 기인한 다른 cytopenias 간 손상, 자가 면역 용 혈 3 경우, idiopathic thrombocytopenic 혈관 5 경우, 대 식 세포 활성화 증후군 1 경우, 림프 종 치료 (최소 잔여 질병 < 0.01%) 후 완전 한 사 함 3 경우, 7의 경우 혈액 장애 (4 MDS, 1 급성 골...

Discussion

BM aspirate의 품질 최종 결과에 영향을 줄 수 있습니다. BM aspirate의 hemodilution 창시자의 부재로 인해 성숙의 다른 단계에 있는 세포 또는 선구자 세포의 분포를 왜곡 수 있습니다. 아마 채용 방법 lysing 대량 흐름 cytometric 분석에서 hemodilution에 대 한 BM aspirates의 정상화에 도움이 됩니다. 또한, cytometry 의해 BM 골수성 dysplasia의 평가 위한 중요 한 단계는 샘플 처리 및 얼룩, 데이터 수집 및 해석^2,3. 샘플 처리 및 얼룩 BM 수확 후 72 h까지 수행 되어야 한다. 데이터 한다 취득, 선호, 얼룩 직후 또는 교류 cytometer에서 측정까지 1 시간 더 이상에 대 한 빛에서 보호 4 ° C에서 샘플을 저장할. 데이터베이스 기반 해석 BM 골수성 세포 성숙의 주관적인 평가 피할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II 유세포 분석기	BD Biosciences, CA, USA	SN:	3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; 모델 번호 : 320002001	저속 원심 분리기; 용량 60 FACS 튜브
10 µ의 피펫; L 및 200&마이크로; L
파스퇴르 피펫
15 mL 팔콘 튜브
폴리 프로필렌 튜브 FACS
마우스 Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	클론 L243 마우스 BALB / c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	클론 HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	클론 CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	클론 L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	클론 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	클론 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, 미국 캘리포니아333143		클론 D12 마우스 BALB/c IgG2a, κ D12, 형광 색소 APC (예 : 최대 650 nm / Em max 660nm
마우스 Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	클론 HI10A Mouse BALB / c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	클론 E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	클론 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ 형광 색소 PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
마우스 Anti-Human CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	클론 UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
마우스 Anti-Human CD14	BD Biosciences, 미국 캘리포니아641394		클론 MoP9 마우스 BALB/c IgG2b, κ 형광 색소 APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	클론 CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	클론 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex 최대 496 nm/ Em 최대 578 nm)
마우스 Anti-Human CD33		345800	클론 P67.6 마우스 BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	클론 M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
용해 용액 10x Concentrate (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS& T IVD beads	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Spain	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
보상 입자 Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva 소프트웨어 버전 6.1.2 및 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
인산염 완충 식염수 정제	R& D Systems, 미국 미니애폴리스	5564
소 혈청 알부민 ( BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Sodium azide 99%	Sigma-Aldrich, France	199931
Infinicyt 소프트웨어 버전 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spain