Vivo에서 Microdialysis 메서드를 잘라 높은 분자 무게와 뇌 간 질 성 액체에서 큰 Extracellular 단백질을 수집 조사

요약

Vivo에서 microdialysis는 깨어, 자유롭게 행동 하는 동물에서 뇌 중간 유체 (ISF)에 존재 하는 분자의 컬렉션을 사용할 수 있습니다. ISF에 상대적으로 큰 분자를 분석 하기 위해 현재 문서 막 잘라 높은 분자 무게를 가진 프로브를 사용 하 여 microdialysis 프로토콜에 특히 초점을.

초록

Vivo에서 microdialysis 투 석 원리에 따라 깨어, 자유롭게 행동 동물에서 ISF를 수집 하는 강력한 기술입니다. Microdialysis은 상대적으로 작은 분자 아미노산 신경 전달 물질 등을 측정 하는 설립된 방법, 하는 동안 그것은 최근 사용 되었습니다 또한 ISF 잘라 높은 분자 무게를 가진 프로브를 사용 하 여 더 큰 분자의 역학을 평가 하 막입니다. 이러한 프로브 사용 시 microdialysis 프로브 내부 축적 된 압력을 피하기 위해 푸시 풀 모드에서 실행할 수 있다. 이 문서 단계별 프로토콜을 stereotaxic 수술 등 ISF에서 단백질을 수집을 microdialysis 라인을 설정 하는 방법을 제공 합니다. Microdialysis, 동안 체계적으로 또는 ISF에 직접 주입 하 여 마약 관리 될 수 있습니다. 역 microdialysis ISF에 화합물을 직접 주입 하는 기술입니다. Microdialysis 관류 버퍼에서 약물의 포함 ISF를 동시에 수집 하는 동안 프로브를 통해 ISF로 확산 수 있습니다. 예를 들어 타우 단백질을 측정 하 여 저자 picrotoxin의 역 microdialysis에 의해 자극 신경 활동 시의 레벨 변경 되는 방법을 보여 줍니다. 장점 및 microdialysis의 제한 사항 설명 확장된 응용 프로그램 함께 다른 비보에 방법을 결합 하 여 합니다.

서론

ISF 총 두뇌 양의 15-20%를 구성 하 고 신호 변환, 기판 운송 및 폐기물 허가¹에 대 한 중요 한 microenvironment를 제공 합니다. 따라서, 살아있는 동물에서 ISF 수집 능력 질병 메커니즘 뿐만 아니라 다양 한 생물 학적 과정에 대 한 큰 의미를 제공 합니다. Vivo에서 microdialysis 몇 가지 방법 중 하나는 샘플 및 계량 extracellular 분자 ISF에서 깨어에서 자유롭게 이동 하는 동물 이며 신경 과학 연구 분야^2,3에 유용한 도구 역할을 그로 인하여. 이 방법에서는, 반 투과성 막으로 microdialysis 프로브는 두뇌에 삽입 되 고 상대적으로 느린 흐름 속도에서 관류 버퍼와 함께 끼얹는다 (0.1-5 µ L/min). 이 관류 동안 ISF에 extracellular 분자 수 동적으로 농도 기온 변화도 따라 프로브로 확산 하 고 있는 dialysate로 수집 합니다. 이 문서에서는 샘플 두뇌에 ISF에 방법, 원리와 방법을 모두 적용할 수 있습니다 다른 기관에 적절 한 수정에 의해 필요한 경우.

Microdialysis 처음 고용....

프로토콜

모든 동물 연구 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 도쿄 대학에서 대학원 학부의 위원회에 의해 승인 했다.

1. 사전 수술

1. 수술 시작 하기 전에 모든 멸 균 상태를 유지 하기 위해 70% 에탄올과 닦아 합니다. 열 지원 난방 패드를 사용 하 여 것이 좋습니다.
2. Chloral 하이드 레이트 (400 mg/kg)의 복 주입 하 여 쥐를 anesthetize. 발가락 핀치를 수행 하 여 anesthetization를 확인 합니다. 적어도 24 h에 대 한 meloxicam SR 유도 및 복구 입찰 시 buprenorphine의 사용을 권장 합니다.
3. 수술 깎기로 머리를 면도. 마우스에 신생아 쥐 어댑터 귀 바와 코 클램프를 사용 하 여 마우스를 수정 합니다.
   참고: 그것은 중요 되도록 마우스 머리가이 단계에서 보안 측면-의해-측면을 이동 하지 않습니다.
4. 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.

2. stereotaxic 수술 가이드 정 맥 주입에 대 한

1. Stereotaxic 장치에 마우스 및 신생아 쥐 어댑터를 설정 합니다. 이상 하 게 절 개 sagittally 피....

결과

자극 또는 반전 microdialysis^11,,1213, picrotoxin, GABA_A 수용 체 길 항 제 또는 테트로도톡신에 신경 활동을 억제, 나⁺ 채널 차단제 사용 되었습니다. 그것은 타우 릴리스 자극 되 면 신경 활동^13,14의 증가 의해 표시 되었습니다. 이러한 일관 된 이전 관측, 50 µ M picrotoxin (PTX) 깨어 C57B6/J 쥐에 역 microdialysis (더 자세한 내용 참조)를 통해 투여 될 때 증가 ISF 생 타우 차량 제어 (DMSO) (ELISA로 측정 레벨 비교 그림 2

토론

막 잘라 높은 분자 무게 Microdialysis 푸시 풀 모드에서 운영 될 수 있다, 따라서 그것은 중요 한 흐름 속도 정확 하 고 일정. 흐름 율에 부정확 공기 거품 생성 및 샘플 농도에 불일치의 원인이 될 수 있습니다. 흐름 일치 하지 않으면 누설에 대 한 모든 연결을 확인 합니다. 문제가 계속 발생 하는 경우 다시 시작 하는 새로운 프로브와 튜브를 필요할 수 있습니다.

Microdilaysis 프로브는 지속적으로 관류 버퍼에 의해 끼얹는다. 따라서, 하지 관류 버퍼에서 전체 균형에 도달 하는 extracellular 분자에 대 한 충분 한 시간이입니다. 결과적으로 dialysate에 농도 ISF에의 실제 농도 보다 훨씬 낮습니다. ISF에 분자의 진정한 농도 예측 하기 위해서는 제로 흐름 메서드는 자주 사용된^3,,51.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Univentor 820 Microsampler	Univentor	8303002	냉장 분획 수집기
주사기 펌프	KD scientific	KDS-101
롤러 펌프	Eicom 미세 투석	ERP-10
Raturn 독립형 시스템	BASi	MD-1409	자유 이동 시스템
이중 종 케이지 키트	BASi	CX-1600
AtmosLM 미세투석 프로브(샤프트 길이 8mm, 멤브레인 길이 2mm)	Eicom 미세투석	PEP-8-02	프로브, 가이드, 듀미 프로브 및 입체식 어댑터의 샤프트 길이는 동일해야 합니다.
미세 투석 가이드 (샤프트 길이 8mm)	Eicom 미세 투석	PEG-8
미세 투석 더미 프로브 (샤프트 길이 8mm)	Eicom 미세 투석	PED-8
뼈 나사	BASi	MD-1310
Super bond C & B 세트	Sunmedical		치과 시멘트
디지털 디스플레이 콘솔이있는 소형 동물 입체 기기	Kopf	모델 940	입체 운동 장치
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표준 이어 바 및 마우스 용 고무 팁 입체	Stoelting	51648
시그마		의 알부민 용액A7284-50ML	30% BSA 용액
FEP 튜빙 (70 cm)	Eicom 미세투석	JF-10-70	내부 부피 = 0.5 &마이크로; L/cm
테프론 튜빙 (50 cm)	Eicom 미세투석	JT-10-50	내부 부피 = 0.08 &마이크로; L/cm
Byton 튜브	Eicom 미세 투석	JB-30
인트라메딕 루어 찌르기 어댑터 23G	BD	427565	무딘 끝 바늘
롤러 튜브	Eicom 미세 투석	RT-5S	내부 볼륨 = 4 &마이크로; L
캡 너트	Eicom 미세 투석	AC-5
0.25 mL 마이크로 원심분리기 튜브(캡 포함	QSP	503-Q	튜브 분획 수집기
스테로택시 어댑터(샤프트 길이 8mm)	Eicom 미세 투석	PESG-8
연결 바늘	Eicom 미세 투석	RTJ
마우스 동물 목걸이	BASi	MD-1365
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Picrotoxin	Sigma	P1675
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