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Summary

Vivo에서 microdialysis는 깨어, 자유롭게 행동 하는 동물에서 뇌 중간 유체 (ISF)에 존재 하는 분자의 컬렉션을 사용할 수 있습니다. ISF에 상대적으로 큰 분자를 분석 하기 위해 현재 문서 막 잘라 높은 분자 무게를 가진 프로브를 사용 하 여 microdialysis 프로토콜에 특히 초점을.

Abstract

Vivo에서 microdialysis 투 석 원리에 따라 깨어, 자유롭게 행동 동물에서 ISF를 수집 하는 강력한 기술입니다. Microdialysis은 상대적으로 작은 분자 아미노산 신경 전달 물질 등을 측정 하는 설립된 방법, 하는 동안 그것은 최근 사용 되었습니다 또한 ISF 잘라 높은 분자 무게를 가진 프로브를 사용 하 여 더 큰 분자의 역학을 평가 하 막입니다. 이러한 프로브 사용 시 microdialysis 프로브 내부 축적 된 압력을 피하기 위해 푸시 풀 모드에서 실행할 수 있다. 이 문서 단계별 프로토콜을 stereotaxic 수술 등 ISF에서 단백질을 수집을 microdialysis 라인을 설정 하는 방법을 제공 합니다. Microdialysis, 동안 체계적으로 또는 ISF에 직접 주입 하 여 마약 관리 될 수 있습니다. 역 microdialysis ISF에 화합물을 직접 주입 하는 기술입니다. Microdialysis 관류 버퍼에서 약물의 포함 ISF를 동시에 수집 하는 동안 프로브를 통해 ISF로 확산 수 있습니다. 예를 들어 타우 단백질을 측정 하 여 저자 picrotoxin의 역 microdialysis에 의해 자극 신경 활동 시의 레벨 변경 되는 방법을 보여 줍니다. 장점 및 microdialysis의 제한 사항 설명 확장된 응용 프로그램 함께 다른 비보에 방법을 결합 하 여 합니다.

Introduction

ISF 총 두뇌 양의 15-20%를 구성 하 고 신호 변환, 기판 운송 및 폐기물 허가¹에 대 한 중요 한 microenvironment를 제공 합니다. 따라서, 살아있는 동물에서 ISF 수집 능력 질병 메커니즘 뿐만 아니라 다양 한 생물 학적 과정에 대 한 큰 의미를 제공 합니다. Vivo에서 microdialysis 몇 가지 방법 중 하나는 샘플 및 계량 extracellular 분자 ISF에서 깨어에서 자유롭게 이동 하는 동물 이며 신경 과학 연구 분야^2,3에 유용한 도구 역할을 그로 인하여. 이 방법에서는, 반 투과성 막으로 microdialysis 프로브는 두뇌에 삽입 되 고 상대적으로 느린 흐름 속도에서 관류 버퍼와 함께 끼얹는다 (0.1-5 µ L/min). 이 관류 동안 ISF에 extracellular 분자 수 동적으로 농도 기온 변화도 따라 프로브로 확산 하 고 있는 dialysate로 수집 합니다. 이 문서에서는 샘플 두뇌에 ISF에 방법, 원리와 방법을 모두 적용할 수 있습니다 다른 기관에 적절 한 수정에 의해 필요한 경우.

Microdialysis 처음 고용 되었다 1960 년대 그리고 이후 수집 등 아미노산 신경 전달 물질 두뇌에서 작은 분자를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 그러나, 차단 막 (100 kDa-3 MDa)는 높은 분자 무게 microdialysis 프로브의 최근 상업적인 가용성 확장 뿐만 아니라^{4,,56 ISF에 상대적으로 더 큰 단백질에의 응용 7}. 이 프로브를 사용 하 여 연구 발견을 주도하 고 있다 그 단백질 등 타우 α-synuclein 오래 있을 생각 했다 독점 세포질은 또한 순수 ISF^4,,58에 존재.

Microdialysis 프로브를 사용 하 여 큰 차단 막 (일반적으로 1000 kDa)와 어려움 중 하나는 내부 압력 프로브에 축적 한 유체 손실에 더 취약 하는 것입니다. Microdialysis 프로브는 여기에 사용 되는이 문제를 방지 하려면 독특한 구조가. 압력 것입니다 하지 쌓아이 구조 때문에, 따라서 이러한 프로브 microdialysis perfuse (= push) 프로브 및 프로브 콘센트에서 dialysate 오는 수집 롤러/연동 펌프에 주사기 펌프를 사용 하 여 “푸시-풀” 모드에서 작동 해야 (= 풀) ⁹ (푸시와 풀 펌프, 압력 프로브에 환기 구멍을 취소 해야 하는 있지만 시스템은 기술적으로 구동 풀 펌프에 의해). 이 문서는 가이드 정 맥 주입의 stereotaxic 수술으로 시작 하 고 1000 kDa 차단 막과 microdialysis 프로브를 통해 ISF를 수집 하기 위해 microdialysis 라인을 설정 하는 방법에 설명 합니다.

Protocol

모든 동물 연구 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 도쿄 대학에서 대학원 학부의 위원회에 의해 승인 했다.

1. 사전 수술

1. 수술 시작 하기 전에 모든 멸 균 상태를 유지 하기 위해 70% 에탄올과 닦아 합니다. 열 지원 난방 패드를 사용 하 여 것이 좋습니다.
2. Chloral 하이드 레이트 (400 mg/kg)의 복 주입 하 여 쥐를 anesthetize. 발가락 핀치를 수행 하 여 anesthetization를 확인 합니다. 적어도 24 h에 대 한 meloxicam SR 유도 및 복구 입찰 시 buprenorphine의 사용을 권장 합니다.
3. 수술 깎기로 머리를 면도. 마우스에 신생아 쥐 어댑터 귀 바와 코 클램프를 사용 하 여 마우스를 수정 합니다.
   참고: 그것은 중요 되도록 마우스 머리가이 단계에서 보안 측면-의해-측면을 이동 하지 않습니다.
4. 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.

2. stereotaxic 수술 가이드 정 맥 주입에 대 한

1. Stereotaxic 장치에 마우스 및 신생아 쥐 어댑터를 설정 합니다. 이상 하 게 절 개 sagittally 피부에 메스를 사용 하 여 두개골.　혈액과 젖은 면봉을 사용 하 여 두개골에 결합 조직 닦아내십시오.
2. 뇌 아틀라스를 사용 하 여 관심사의 뇌 영역에 대 한 좌표를 결정 합니다. 측정을 시작 하기 전에 있는지 확인 그 중간 스트레이트 드릴 비트 수 있도록 A P을 이동 하 고 전체 시간 중간 봉합에 남아 있다.
   참고:이 문서에 대 한 좌표를 사용 하 여 (A / p:-3.1 m m, M/l:-2.5 m m, D/v:-1.2 m m, 12도) 후부 해 마를 대상으로.
3. 레벨 두개골 A-P
   1. Stereotaxic 프레임의 조작에 드릴을 연결 합니다. 부드럽게 람다 접촉 될 때까지 훈련을 낮은 고 복 부의 좌표를 기록 합니다. Bregma에 대 한이 절차를 반복 합니다.
      참고: 두개골을 파괴 하는 때 bregma의 수직 측정은 람다의. 아니라면, 그에 따라 코 클램프의 높이 조정 합니다. 두개골을 파괴 되 면, 후 bregma에 앞쪽/후부, 측면 좌표를 기록 합니다.
4. 레벨 해골 왼쪽-오른쪽
   1. 좌표에 드릴 bregma에서 이동 (A / p-3.1 m m, M/l:: + 2.0 m m), 낮은 두개골에 드릴 및 세로 좌표를 기록. 좌표에 대 한 다음이 절차를 반복 (A / p-3.1 m m, M/l::-2.0 m m).
      참고: 두개골을 파괴 하는 경우는 중간에서 두 개의 등거리 점의 수직 측정이. 그렇지 않으면, 귀 바의 높이 조정 합니다.
5. 대상 좌표에 신중 하 게 버 구멍 (A / p-3.1 m m, M/l::-2.5 m m) 가이드 정 이식 하. 버 구멍의 지름을 가이드 정 맥 주입을 위해 충분히 큰 경우, 첫 번째와 겹치는 다른 구멍을 드릴 합니다. (Contralateral 오른쪽) 정수 리 뼈에 다른 구멍을 드릴 하 고 1.10 (참조 그림 1B)에 치과 시멘트를 확보 하는 데 도움이 뼈 나사를 삽입 합니다.
6. 면도날에 의해 1.5 mL 원심 분리기 튜브의 뚜껑의 뒷면에서 원형 잠금 조각을 삭감 하 고 ‘크라운 ‘. 이 크라운 치과 시멘트 피부에 확산 방지 하기 위해 사용 됩니다. 2.5 단계에서 만든 버 구멍 원 ( 그림 1참조) 내에서 유지 되도록 그것을 두개골에 놓습니다.
7. 가이드 정 stereotaxic 어댑터의 짧은 팔에 둬서 stereotaxic 어셈블리를 설정 하 고 캡 너트를 사용 하 여 고정. 전극 클램프 stereotaxic 어댑터의 긴 팔을 설정 합니다. (참조 그림 1A) stereotaxic 기구의 조작에 연결 합니다.
8. 12도 (참조 그림 1B)에 의해 조작 팔에 D V stereotax 어셈블리를 회전 합니다. 1.6에서 만든 버 구멍 가이드 정을 이동 합니다. 삽입 가이드 정 천천히 두뇌에 1.2 m m로 낮추어.
   참고: 조사 각도 특정 해 마; 다른 지역 다른 각도 또는 아무 각도 모두 필요할 수 있습니다. 정확한 좌표 뇌 아틀라스를 참조 하십시오. 때문에, 두개골의 표면 건조 하지 시멘트 충실 하지 것입니다 경우 시멘트 모자 제거 될 수 있다
9. 완벽 하 게 커버 가이드 정 및 뼈 나사를 그들 만큼의 두 금속 부분에 크라운 내 치과 시멘트를 추가 합니다. 거기 노출 두개골의 일부인 경우 추가 치과 시멘트를 적용 합니다.
10. 치과 시멘트 완전히 건조 될 때까지 기다립니다 (12 ~ 20 분). 전극 클램프에서 stereotaxic 어댑터를 제거 합니다. 캡 너트를 제거 하 고 더미 프로브 stereotaxic 어댑터를 장착 하 고 캡 너트를 고정.
11. Stereotaxic 장치에서 마우스를 놓고 마우스 개별 장에 혼자 집.
    참고: 마우스 하지 맡겨야 한다 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지. Microdialysis의 날까지 매일 마우스를 확인 합니다. 마우스는 고통에 있을 경우 carprofen 같은 NSAIDs를 받습니다. 2 주 대기 이므로 수 면-각 성 연구에 필요한 마우스 익숙해집니다 새로운 환경¹⁰하지만 연구의 짧은 회복 기간 (예를 들어, 1-2 일)를 요구할 수 있습니다.

3. Microdialysis 설치

1. 검색의 품질 확인: 채우기 증류수 waterand와 일회용 1 ml 주사기 byton 튜브를 사용 하 여 프로브의 콘센트 (짧은 포트)에 연결. 손가락으로 환기 구멍을 커버 하 고 프로브를 물에 부드럽게 주사기 플런저를 우울 하 게. 확인 그 물 프로브 입구에서 나타나고 microdialysis 막의 표면에 아무 누설도 있다.
   1. 활성화 프로브: 프로브 에탄올 (70-100%)에서 막 2 초 동안 잠수함. 그런 다음, 달 이다 증류수 프로브로 다시 주사기로 다시.
2. 관류 버퍼의 준비: 대상 분자는 튜브의 접착을 방지 하기 위해 추가 하 여 BSA diluting 인공 CSF (1.3 m CaCl₂m, 1.2 m m MgSO₄, 3 m KCl m, 0.4 m m KH₂포₄, 25mm NaHCO_{3와 4%로 30 %BSA 솔루션} , 122 mM NaCl, pH = 7.35), CSF, 즉시 사용 하기 전에 전해질 농도 밀접 하 게 일치. 0.1 µ m 기 공 크기와 주사기 필터 장치를 통해 관류 버퍼 필터링.
   참고: 4 %BSA 단백질을 고정에 대 한 복구 향상 하지만 특히 높은 BSA 바인딩 있는 화합물에 대 한 화합물의 배달을 제한할 수 있습니다. 이것은 특정 인스턴스³BSA (0.15%) 등의 낮은 농도 사용의 장점 중 하나 이다. 유의 하십시오 소용돌이 또는 저 어 접시에 의해 흥분 할 때 BSA 아주 쉽게 집계 수 있습니다. 이러한 집계 프로브 또는 막 숨 구멍 방해할 수 있습니다. 이 집계를 제한 하는 BSA 솔루션을 준비할 때 주의 사용 하 여
3. 입구와 출구 (참조 그림 1C)에 대 한 두 별도 줄을 준비 하 고 연결 바늘으로 두 라인을 연결. 관류 버퍼 가득 일회용 3 mL 주사기를 무뚝뚝한 끝 바늘을 사용 하 여 튜브의 입구 끝으로 연결. 관류 버퍼 전체 튜브 주사기 펌프를 실행 하 여 입력 합니다.
4. 주사기 펌프를 중지 하 고 단계 3.3 (참조 그림 1C)에서 활성화 된 microdialysis 프로브 입구 선과 콘센트 선 사이 연결 바늘을 바꿉니다. 이 교체 하기 전에 프로브에 cap 너트를 넣어.
5. 롤러 펌프에 콘센트 배관에 롤러 튜브를 탑재 합니다. 10 µ L/min에서 주사기 펌프 그리고 약간 느린 흐름 율 (9.5-9.8 µ L/min)에 롤러 펌프를 시작 합니다. 조사 들어가면 복구에 영향을 미칠 수 있습니다 전체 배관에서 모든 기포를 제거 되었는지 확인 합니다.
6. 1.2 단계에서와 같은 방법에 단계의 1.12 마우스를 anesthetize. 마우스 칼라는 목 주위를 넣어. 캡 너트 및 더미 검색 제거 하 고 천천히 가이드 정 통해 3.4에서 microdialysis 프로브를 삽입 하 고 캡 너트를 고정.
7. 장소는 새 장에 마우스 무료 이동 시스템 및 밧줄 칼라 마우스 연결. 계속 주사기 펌프 및 롤러 펌프 3.5 이상 1 h 단계에서 표시 된 유량에서 실행.
   참고: 깨어 동물에서 ISF 컬렉션을 달성,이 기사 사용 무료 이동 시스템 케이지 자체 왜곡에서 튜브를 유지 하는 동물의 움직임에 응답 합니다. 또는 액체 회전 다양 한 회사에서 사용할 수는 또한 사용 될 수 있다.
8. 롤러 펌프 먼저 중지 한 다음 주사기 펌프. 원하는 흐름 속도 설정 합니다. 주사기 펌프 20% 롤러 펌프 보다 더 빠르게 실행 합니다.
   참고: 예를 들어, 1 µ L/min에서 실행 하는 경우 주사기 펌프에서 작동 1.2 µ L/분 최적의 유량 각 분자에 대 한 실험적으로 결정 되어야 한다.
9. ISF 샘플 수집: 냉장된 분수 수집기에 콘센트 배관의 자유로운 끝을 배치.
   참고: 적절 한 샘플 볼륨 분석 실험 분석에 사용에 따라 다릅니다.
10. 실험의 완료 후 프로브를 제거 합니다. (Anesthetize는 마우스 필요에 따라.)  마우스 복구 단계 2.11에서 같은 방식으로 처리 합니다. HPLC 등 ELISA 방법으로 수집 된 ISF를 분석 합니다.
11. Microdialysis 후 전체 배관 세척, 입구를 연결 하 고 다시 연결 프로브를 대체 하 여 콘센트 튜브 바늘 및 전체 배관에 희석된 표 백제를 실행 하 고 물으로 플러시. 건조와 반복된 사용을 위해 그것을 저장 합니다.
    그러나 참고: 튜브의 다른 유형은 수락 가능 하다,, 관류 버퍼에 BSA는 작은 직경 튜브를 방해할 수 있습니다, 그리고 따라서 이러한 튜브는 단일 사용으로 간주 됩니다. 튜브 착용 될 수 있다 또는 여러 사용 후 막힌 그래서 확인 흐름 속도 일관 된 사용 하기 전에 때마다.

Representative Results

Discussion

막 잘라 높은 분자 무게 Microdialysis 푸시 풀 모드에서 운영 될 수 있다, 따라서 그것은 중요 한 흐름 속도 정확 하 고 일정. 흐름 율에 부정확 공기 거품 생성 및 샘플 농도에 불일치의 원인이 될 수 있습니다. 흐름 일치 하지 않으면 누설에 대 한 모든 연결을 확인 합니다. 문제가 계속 발생 하는 경우 다시 시작 하는 새로운 프로브와 튜브를 필요할 수 있습니다.

Microdilaysis 프로브는 지속적으로 관류 버퍼에 의해 끼얹는다. 따라서, 하지 관류 버퍼에서 전체 균형에 도달 하는 extracellular 분자에 대 한 충분 한 시간이입니다. 결과적으로 dialysate에 농도 ISF에의 실제 농도 보다 훨씬 낮습니다. ISF에 분자의 진정한 농도 예측 하기 위해서는 제로 흐름 메서드는 자주 사용된^3,,515. 이 메서드는 흐름 속도 변경 하 여 농도 측정 합니다. 농도 및 유량 사이 반비례 관계가 있다. 따라서, 분자의 완벽 한 복구를 나타내는 제로 흐름 이론에 다시 지 수 곡선을 바탕으로 대상 분자의 농도 확인할 수 있습니다. 그러나, 복구 세포 막 또는 분자의 hydrophobicity 또는 다른 단백질 상호 작용 등 다양 한 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 그리고 하나 명심 해야 한다 이론적인 0에 농도 반드시 되지 않을 수 있습니다. ISF에 진정한 농도 것과 같습니다.

프로브 삽입 뇌에 심각한 지역 상해를 발생합니다. 이 이유에서 첫 번째 여러 분수 추가 분석에서 일반적으로 제외 됩니다. 심각한 상해의 일반적인 릴리스 ISF (작성자의 게시 되지 않은 관찰)로 때문에 사실, 해 마에 ISF 타우 단백질의 수준을 가능성이 첫 번째 9-15 시간에 안정 되지 않습니다. 프로브 삽입 손상 후 복구 대상에서 대상에 따라 다릅니다. 파일럿 연구는 각 대상 샘플을 분석 해야 합니다 경우 확인 하려면 정상 수준에 도달 하는 경우를 결정 하기 위해 수행 되어야 한다. 이 microdialysis 샘플링에 대 한 “시작 지점을”을 결정합니다. 샘플링에 대 한 끝점은 대상이 더 이상 (일반적으로 3-5 일 후 microdialysis 프로브 주입; 하지 가이드 주입) 안정 된 상태에서. 시작 및 끝 각 대상에 대 한 각 대상에 대 한 각 연구소에 의해 실험적으로 결정 되어야 합니다.

Microdialysis는 약물 치료와 결합 될 때 특히 유용 합니다. 약물은 체계적으로 관리 하거나 ISF에 직접 들어갈 수 있습니다. 리버스 microdialysis 직접 프로브를 통해 작은 화합물을 infuses 한 방법입니다. 투 석 양방향으로 발생합니다. 따라서, 관류 버퍼에서 약물의 포함 microdialysis 프로브 주변 조직에 비록 그것의 확산 수 있습니다. 이 메서드는 작은 화합물 및 동시 컬렉션 ISF의 로컬 관리를 사용할 수 있습니다. 역 microdialysis 보다 적게 침략 적 정 맥을 통해 압력 주입에 비해 이며 대상 지역에 약의 더 일정 한 농도 유지할 수 있습니다.

역 microdialysis를 시작 하기 전에 전체 배관의 내부 볼륨 치료 및 샘플 컬렉션의 타이밍을 계산 하기 위해 계정에가지고 한다. 예를 들어이 문서에서 사용 되는 전체 배관의 내부 볼륨은 91.5 µ L (각 튜브의 내부 볼륨에 대 한 재료의 표 참조). 따라서, 유량 1.0 µ L/min 인 경우에, 그것은 걸립니다 91.5 분 분수 수집기를 도달 하는 약물을 포함 하는 관류 버퍼에 대 한. 다른 한편으로, 약물을 체계적으로 전달 하는 경우 (이 경우 56.5 µ L) 콘센트 배관의 내부 볼륨 고려 되어야 한다.

Microdialysis 메서드 vivo에서 다른 기술을 통해 여러 가지 이점을 제공합니다. 예를 들어 세포내와 세포 외 단백질 가능성이 뇌 homogenates에 의하여 이루어져 있다, 하는 동안 microdialysis 특히 세포 외 단백질에서에서 수집 ISF 합니다. 둘째, 단일 microdialysis 프로브 같은 동물에서 다른 시간에 ISF를 수집할 수 있습니다. 각 샘플에서 대상 농도 % 기준선에 정규화 될 수 있습니다. 이 상대적인 차이 비교할 수 있도록 동물 사이 절대 농도 정규화 합니다. 이 연구의 힘을 증가 하 고 일반적으로 다음 약물 관리/조작 하는 단백질 수준에 상대적 차이 비교 했을 때 실험에 필요한 동물 수를 감소 시킨다. 다른 한편으로, microdialysis의 주요 제한 대상 분자의 크기의 제한 이다.

Microdialysis 다른 기술로 vivo에서 결합 될 수 있다. 예를 들어 regulatable 유전자 변형 쥐에 microdialysis를 수행 대상 단백질¹⁶의 비보에 매출을 예측할 수 있습니다. EEG, 측정의 조합 역 microdialysis¹¹동안 전기 활동을 측정 하기 위해 사용 되었다. 그리고 동시에 ISF¹⁷를 수집 하는 동안 뇌의 신경 활동의 optogenetics 사용 조작.

Materials

The Univentor 820 Microsampler	Univentor	8303002	Refrigerated fraction collector
Syringe pump	KD scientific	KDS-101
Roller pump	Eicom microdialysis	ERP-10
Raturn Stand-Alone System	BASi	MD-1409	Free-moving system
Dual species cage kit	BASi	CX-1600
AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm)	Eicom microdialysis	PEP-8-02	Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical.
Microdialysis guide (shaft length 8 mm)	Eicom microdialysis	PEG-8
Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm)	Eicom microdialysis	PED-8
Bone screw	BASi	MD-1310
Super bond C&B set	Sunmedical		Dental cement
Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console	Kopf	Model 940	Stereotaxic apparatus
Mouse and neonatal rat adaptor	Stoelting	51625
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic	Stoelting	51648
Albumin solution from bovine serum	Sigma	A7284-50ML	30% BSA solution
FEP tubing (70 cm)	Eicom microdialysis	JF-10-70	Internal volume = 0.5 µL/cm
Teflon tubing (50 cm)	Eicom microdialysis	JT-10-50	Internal volume = 0.08 µL/cm
Byton tube	Eicom microdialysis	JB-30
Intramedic luer stab adaptor 23G	BD	427565	Blunt end needle
Roller tube	Eicom microdialysis	RT-5S	Internal volume = 4 µL
Cap nut	Eicom microdialysis	AC-5
0.25 mL microcentrifuge tube with cap	QSP	503-Q	Tubes for fraction collector
Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm)	Eicom microdialysis	PESG-8
Connection needle	Eicom microdialysis	RTJ
Mouse animal collar	BASi	MD-1365
High Speed Rotary Micromotor kit	FOREDOM	K.1070	Drill
Picrotoxin	Sigma	P1675
Screw driver for bone screws
Scalpel
Cotton swab
Surgical clipper