라이브 셀 이미징 TGF-β/Smad3 신호 통로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 아 데 노 바이러스 기자 시스템을 사용 하 여

요약

여기, 우리는 아 데 노비 루스 기자 시스템을 사용 하 여 하는 TGF-β/Smad3 신호 활동의 라이브 셀 이미징에 대 한 프로토콜을 제시. 이 시스템 실시간 transcriptional 활동을 추적 하 고 두 단일 세포에 생체 외에서 그리고 살아있는 동물에 적용 될 수 있다모델.

초록

성장 인자 (TGF-β) β 신호 변환 세포 항상성에 필요한 많은 중요 한 기능을 조절 하 고 암 등 많은 질병에 overexpressed 일반적으로 있다. TGF-β는 강하게 연루 전이에 늦게 단계 암 진행 동안 철새 및 침략 적인 종양 세포의 하위 집합을 활성화. 신호 경로 분석에 대 한 현재 메서드 끝점 모델, 종종 생물 학적 이벤트의 신호 포스트-임시 측정을 시도 하 고 질병의 진보적인 성격을 반영 하지 않습니다에 초점. 여기, 라이브 셀에 transcriptional 활성화를 검색할 수 있는 TGF-β/Smad3 신호 전달 경로 대 한 소설 아 데 노비 루스 기자 시스템 특정을 설명 합니다. 광고 CAGA₁₂-Td-톰 기자를 활용 하 여, 우리 24 시간 시험관내의 MDA-MB-231 셀의 100% 감염 속도 얻을 수 있습니다. 형광 기자의 사용에 살아있는 단일 세포의 영상에 대 한 수 있습니다 transcriptionally 활성 셀의 직접 식별과 실시간. TGF-β와 감염 된 세포의 자극 transcriptionally 활성화 하 고 특정 한 생물학 기능에 관련 된 셀의 하위 집합만 표시 됩니다. 이 이렇게 높은 특이성 및 단일 세포 수준에서 감도 TGF-β 신호 vitro에관련 생물 학적 기능의 이해 향상을 수 있습니다. Smad3 transcriptional 활동 수도 있습니다 보고 vivo에서 에서 응용 프로그램을 통해 실시간으로 광고 CAGA₁₂-루크 기자. 광고-CAGA₁₂-루크 전통적인 안정적 transfected luciferase 셀 라인으로 동일한 방식으로 측정 될 수 있다. Vivo에서 이식 세포의 Smad3 transcriptional 활동 통해 기존의 IVIS 이미징 분석 하 고 종양 진행, TGF-β 신호 통로의 역학에 대 한 독특한 통찰력을 제공 하는 동안 라이브 모니터 수 있습니다. 우리의 프로토콜 설명 라이브 세포 신호 통로의 빠른 높은 처리량 이미징에 대 한 허용 하는 유리 기자 전달 시스템 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서. 이 메서드는 이미지를 기반으로 분석 및 기본 생물학 및 치료 개발에 대 한 과민 하 고 재현 가능한 방식으로 선물의 범위를 확장할 수 있습니다.

서론

변형 시키는 성장 인자 (TGF-β) β는 heterodimeric 유형 II의 구성 된 복잡 한을 통해 인간 발달에 연루는 필수적인 cytokine 이며 유형 I 수용 체¹. 유형 II 수용 체에 바인딩 결과 신규 모집과 인 산화의 유형 내가 차례로 다운스트림 Smad2/3 단백질^2,3phosphorylates 수용 체. 이 핵에 translocates 유전자 전사⁴규제 하는 복잡 한 형성 하 Smad4에 Smad2/3 단백질 바인딩 활성화. 항상성 조건 TGF-β/Smad 신호는 단단히 통제; 그러나, 많은 질병, 신호 통로 폐지 되 고 종종 overexpressed 질병^5,,67의 진행 하는 최고의. 최근 연구는 TGF-β 세포 응답은 이기종 및 TGF-β/Smad 활성 세포의 부분 모집단은 시간에 따른 방식으로^8,9생물 학적 기....

프로토콜

모든 동물 실험 동물 윤리 위원회는 멜버른의 대학에 의해 승인 되었다.

참고: 있는 adenoviral에 대 한 순서, 건설 및 세대 프로토콜 벡터 p광고-CMV-Td-톰, p광고-CMV-GFP 와 p광고 CAGA₁₂-뤽/Td-톰 이전 설명된^11,12, ¹³. 모든 벡터를 상업적으로 사용할 수 있습니다.

1. 바이러스 Titer 결정 50% 조직 문화 감염 복용량 (TCID₅₀)를 사용 하 여

1. 1 x 10⁶ DMEM + 10 %FBS 미디어 10 ml에서 HEK293A 셀을 준비 합니다.
2. 바닥이-96-잘 빠진 셀 문화 접시의 각 음에 세포 현 탁 액의 100 µ L 씨.
3. 완전 한 매체에서 바이러스의 1: 100 희석의 1 mL를 준비 합니다. 열 1의 각 음에 희석된 바이러스의 11 µ L를 추가 합니다.
4. 1의 최종 희석까지 세포 현 탁 액의 100 ....

결과

단일 세포 생체 외에서 이미징 라이브

정확 하 게 평가 아 데 노비 루스 기반 시 약을 사용 하 여 단일 세포에서 TGF-β/Smad 신호의 활성화, 그것은 먼저는 최적의 다양성의 감염 (MOI) 각 셀 라인을 결정 하는 것이 중요. 최적의 나 셀의 100%는 아니 현재 cytopathic 또는 세포 독성 효과 adenoviral 감염에 대 한 긍정적인 결정 됩니다. 이 결정, 우리는 긍정적인 감염의 감 적으로 constitutively 활성 광고-CMV-Td-톰 기자를 사용 합니다. 아 데 노 바이러스 감염 세포의 비율이 나 의존 하는 방식으로 0에서 5000 나에 증가 되었다. 2500만에서 MDA-MB-231 셀 (그림 1A, 1B)에 100 %Td.......

토론

TGF-β/Smad3 단일 라이브 셀에 신호의 실시간 이미징에 대 한 수 있도록 기술을 개발 했습니다. 이 새로운 방법을 사용 하 여, 우리는 이전 확인 셀의 하위 인구 동적 TGF-β/Smad3 transcriptional 활동 향상 된 내 습 및 마이그레이션⁸에 연결. 이 방법은 Smad3 인 산화의 서쪽 오 점 등 TGF-β 신호에 대 한 전통적인 분석 실험에 개선 및 TGF-β는이 포착 하 여 유전자 발현을 대상 TGF-β/Smad3 종양 인구 내의 신호 및 강조의 단일 세포 생물학의 중요성입니다. 또한, 시간이 소모 및 비싼 핵 전 좌 수와 같은 단일 셀 이미징의 대체 방법에서 수행 하는 경우 라이브 세포와 유전자 전사^16,17에 항상 번역 하지 않을 수 있습니다. 이러한 메서드는 신호 변환의 업스트림 경로 검사 하는 것이 중요, 아 데 노비 루스 기자 시스템 생물학 기능에.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	ThermoFisher	1881024	37°C에서 웜; C 사용 전 수조
태아 소 세럼	Scientifix Life	FBS500-S	사용 전 열 비활성화
재조합 인간 TGF-β 1	PEPROTECH	100-21	DDW의 분취량으로 10 mg/mL에서 최종 농도
Hoechst-33258	Tocris Bioscience	5117	PBS로 희석하여 1 &mu에서 최종 농도 만들기; L/mL
Luciferase Reporter Assay Kit	Promega	197897	사용 전 PBS에서 5배 희석
Luminometer	Promega	9100-002
위상차 형광 현미경 OLYMPUS		IX50
원심분리기	eppendorf	5810 R
VivoGl Luciferin	Promega	P1041
IVIS Lumina III In Vivo 이미징 시스템	PerkinElmer	CLS136334
0.5% Trypsin-EDTA (10x)	ThermoFisher	15400-054	0.05%(1x)로 희
5x 시약	Promega	E153A	, DDW에서 1x로 희석
10% 포르말린	Sigma-Aldrich	F5554-4L
, HEK 293A,	ThermoFisher	R70507
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
PRKDC-SCID	동물 자원 센터	SCIDF6
Matrigel	Corning	354234
Isoflurane	Zoetis	26675-46-7
에탄올	Chem-supply	EA043-10L-P
리프레시 나이트 타임	알레르간	1750D	윤활 눈 연고
<강력>용액 < / 강>			< 강>조성 < / 강>
인산염 완충 식염수 (PBS)			NaH 2 < / sub>PO 4 < / sub>.2H 2 < / sub>O (4 mM); NaHPO4 (16mM); 염화나트륨(0.12M)
FBS-DMEM			5 % 열 비활성화 FBS; 10 μ g/mL 페니실린; 100 &뮤; g/mL 스트렙토마이신

PBS 세포 배양 용해에서 석