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방법 논문

라이브 셀 이미징 TGF-β/Smad3 신호 통로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 아 데 노 바이러스 기자 시스템을 사용 하 여

8.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57926

⸱

2018년 7월 30일

 ,  ,  , 
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기, 우리는 아 데 노비 루스 기자 시스템을 사용 하 여 하는 TGF-β/Smad3 신호 활동의 라이브 셀 이미징에 대 한 프로토콜을 제시. 이 시스템 실시간 transcriptional 활동을 추적 하 고 두 단일 세포에 생체 외에서 그리고 살아있는 동물에 적용 될 수 있다모델.

초록

성장 인자 (TGF-β) β 신호 변환 세포 항상성에 필요한 많은 중요 한 기능을 조절 하 고 암 등 많은 질병에 overexpressed 일반적으로 있다. TGF-β는 강하게 연루 전이에 늦게 단계 암 진행 동안 철새 및 침략 적인 종양 세포의 하위 집합을 활성화. 신호 경로 분석에 대 한 현재 메서드 끝점 모델, 종종 생물 학적 이벤트의 신호 포스트-임시 측정을 시도 하 고 질병의 진보적인 성격을 반영 하지 않습니다에 초점. 여기, 라이브 셀에 transcriptional 활성화를 검색할 수 있는 TGF-β/Smad3 신호 전달 경로 대 한 소설 아 데 노비 루스 기자 시스템 특정을 설명 합니다. 광고 CAGA12-Td-톰 기자를 활용 하 여, 우리 24 시간 시험관내의 MDA-MB-231 셀의 100% 감염 속도 얻을 수 있습니다. 형광 기자의 사용에 살아있는 단일 세포의 영상에 대 한 수 있습니다 transcriptionally 활성 셀의 직접 식별과 실시간. TGF-β와 감염 된 세포의 자극 transcriptionally 활성화 하 고 특정 한 생물학 기능에 관련 된 셀의 하위 집합만 표시 됩니다. 이 이렇게 높은 특이성 및 단일 세포 수준에서 감도 TGF-β 신호 vitro에관련 생물 학적 기능의 이해 향상을 수 있습니다. Smad3 transcriptional 활동 수도 있습니다 보고 vivo에서 에서 응용 프로그램을 통해 실시간으로 광고 CAGA12-루크 기자. 광고-CAGA12-루크 전통적인 안정적 transfected luciferase 셀 라인으로 동일한 방식으로 측정 될 수 있다. Vivo에서 이식 세포의 Smad3 transcriptional 활동 통해 기존의 IVIS 이미징 분석 하 고 종양 진행, TGF-β 신호 통로의 역학에 대 한 독특한 통찰력을 제공 하는 동안 라이브 모니터 수 있습니다. 우리의 프로토콜 설명 라이브 세포 신호 통로의 빠른 높은 처리량 이미징에 대 한 허용 하는 유리 기자 전달 시스템 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서. 이 메서드는 이미지를 기반으로 분석 및 기본 생물학 및 치료 개발에 대 한 과민 하 고 재현 가능한 방식으로 선물의 범위를 확장할 수 있습니다.

서론

변형 시키는 성장 인자 (TGF-β) β는 heterodimeric 유형 II의 구성 된 복잡 한을 통해 인간 발달에 연루는 필수적인 cytokine 이며 유형 I 수용 체1. 유형 II 수용 체에 바인딩 결과 신규 모집과 인 산화의 유형 내가 차례로 다운스트림 Smad2/3 단백질2,3phosphorylates 수용 체. 이 핵에 translocates 유전자 전사4규제 하는 복잡 한 형성 하 Smad4에 Smad2/3 단백질 바인딩 활성화. 항상성 조건 TGF-β/Smad 신호는 단단히 통제; 그러나, 많은 질병, 신호 통로 폐지 되 고 종종 overexpressed 질병5,,67의 진행 하는 최고의. 최근 연구는 TGF-β 세포 응답은 이기종 및 TGF-β/Smad 활성 세포의 부분 모집단은 시간에 따른 방식으로8,9생물 학적 기능에 대 한 책임을 증명 하고있다. 종종 평균 TGF-β/Smad 효과10을 quantitate만 세포 활동의 스냅샷을 제공 하는 고정된 끝점 분석 실험의 사용을 포함 하는 TGF-β/Smad 신호의 일반적인 세포 분석. 그러나이 방법,, 수 있습니다 정확 하 게 대표 하지 질병의 진행 하는 동안 생리 적인 상태에서 TGF-β/Smad 신호 분자 행동. 이미지 기반 라이브 셀 캡처 공간 및 시간 이해 세포 및 생물 학적 과정의 역동성의 분석.

우리의 목표는 TGF-β/Smad 아 데 노비 루스 기반 시 약을 사용 하 여 신호의 라이브 셀 이미징에 대 한 중요 한 높은 처리 방법을 개발 했다. 여기, 우리 Smad3 CAGA 모티브 바인딩 시퀀스와 luciferase (루크) 또는 Td-토마토 (Td-톰) 리포터 유전자를 표현 하는 아 데 노비 루스 인간 유 방 암 세포 선 MDA-MB-231 감염. Adenoviral 기자 시스템 암 세포 라인에 100% 감염 속도에서 발생할 수 있는 플라스 미드 소개에 대 한 신속 하 고 저렴 한 방법을 제공 합니다. Adenoviral 기자 시스템은 또한 성공적으로 적용 되었습니다 기존의 플라스 미드11transfect 하기 어려운 셀 라인에. 이 프로토콜에서 TGFβ/Smad 신호 통로의 라이브 셀 이미징 달성을 재현할 수 및 비 침범 성 과정 설명 합니다 및 모두 에서 vivo에서 체 외.

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프로토콜

모든 동물 실험 동물 윤리 위원회는 멜버른의 대학에 의해 승인 되었다.

참고: 있는 adenoviral에 대 한 순서, 건설 및 세대 프로토콜 벡터 p광고-CMV-Td-톰, p광고-CMV-GFP 와 p광고 CAGA12-뤽/Td-톰 이전 설명된11,12, 13. 모든 벡터를 상업적으로 사용할 수 있습니다.

1. 바이러스 Titer 결정 50% 조직 문화 감염 복용량 (TCID50)를 사용 하 여

  1. 1 x 106 DMEM + 10 %FBS 미디어 10 ml에서 HEK293A 셀을 준비 합니다.
  2. 바닥이-96-잘 빠진 셀 문화 접시의 각 음에 세포 현 탁 액의 100 µ L 씨.
  3. 완전 한 매체에서 바이러스의 1: 100 희석의 1 mL를 준비 합니다. 열 1의 각 음에 희석된 바이러스의 11 µ L를 추가 합니다.
  4. 1의 최종 희석까지 세포 현 탁 액의 100 µ L와 희석된 바이러스의 11 µ L를 혼합 하 여 96 잘 접시에 직접 직렬 10 희석 수행 x1012 에 도달. 세포는 비 점착이이 단계에서 웰 스 간에 전송 되는 셀의 수 일정 하 게 유지.
  5. 11 µ L 10의 높은 희석으로 시작 하는 각 열에 각 희석의 플라스틱4. 피 펫 팁을 바이러스 성 입자의 크로스 오버를 제한 하려면 각 희석 바꿉니다.
  6. 부정적인 통제로 열 12 완전 한 바이러스 무료 미디어의 11 µ L를 추가 합니다.
  7. 10% CO2와 37 ° C에서 7-10 일 동안 접시를 품 어.
  8. 현미경을 사용 하 여, cytopathic 또는 세포 독성 효과의 징후를 표시 하는 각 열에는 우물의 수 점수. 감염의 어떤 표시 든 지 있으면 잘 긍정을 고려 하십시오.
  9. 리드와 Muench (1938) 통계 방법14를 사용 하 여 각 희석에 대 한 긍정적인 우물의 분수를 계산 합니다.
  10. 비례 거리 (PD)를 사용 하 여 계산: (A-50)/(A-B), A는 위의 또는 50% 비율 응답 및 B는 50% 미만 비율 응답
  11. TCID50 를 사용 하 여 계산: 10X-PD, 여기서 X는 희석 50% 보다 큰 응답을 주는.
  12. 다음을 사용 하 여 바이러스 titer 계산: 0.69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL

2. 아 데 노비 루스 나 결정

  1. 씨 1.0-1.5 x 500 μ와 105 MDA-MB-231 셀 DMEM 문화 포함 된 미디어 5% FBS 12의 각 음에 잘 접시 (35% 셀 confluency, 총에서 6 우물).
  2. 광고-CMV-Td-톰 주식 0, 250, 500, 2500에 필요한 및 다음 수식을 사용 하 여 5000 나의 볼륨 계산: 나 = (볼륨 [μ] PFU/μ x) / 셀 수. 1 x 1010 (PFU/mL), 바이러스 감염의 볼륨의 titer와 광고-CMV-Td-톰 에 대 한 필요한 MOIs 있으며 0, 3.75, 7.5, 37.5, 75 μ 각각.
  3. 직접 철저 한 혼합과 우물에 바이러스 성 재고를 pipetting 여 섹션 2.2에 광고-CMV-Td-톰 의 계산 볼륨 세포를 감염.
  4. 24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
  5. 우물에서 미디어를 제거 하 고 즉시 5 분 동안 10% 포 르 말린의 500 μ와 셀을 수정.
  6. 우물에서 포 르 말린을 발음 하 고 PBS의 500 μ와 웰 스를 한 번 씻어.
  7. 5 분 동안 Hoechst 솔루션의 500 μ와 세포 핵 얼룩.
  8. Hoechst 솔루션을 제거 하 고 세척 PBS 3 번 500 μ와 우물.
  9. 이미지 Td 토마토 단백질 및 세포 핵에 형광 현미경 200 배 확대를 사용 하 여 신호. 554에서 Td 토마토 단백질을 자극 및 352에서 Hoechst 염료 nm.
  10. ImageJ 나 Td 토마토15의 100% 감염에 필요한 작업을 사용 하 여 이미지를 분석 합니다.

3. 듀얼-아 데 노 바이러스 전달 라이브 단일 셀에

  1. 씨 1.0-1.5 x 500 μ와 105 MDA-MB-231 셀 DMEM 문화 포함 된 미디어 5% FBS 12의 각 음에 잘 접시 (35% 셀 confluency, 총에서 2 웰 스).
  2. 광고-CMV-GFP 의 75 μ를 가진 세포를 감염 (titer = 5 x 109 PFU/mL) 및 광고 CAGA12-Td-톰 의 7.5 μ (titer = 5 x 1010 PFU/mL)를 100% 감염 양성을 달성할 수 있는 2500만.
  3. 아 데 노비 루스 감염 직후 또는 TGF-β의 우물 (10 mg/mL 재고 있음, 최종 농도 5 ng/μ) 당 0.25 μ 없이 셀을 취급 합니다.
  4. 24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
  5. 단계 대조 형광 현미경 이미지 라이브 셀입니다. 470 nm와 554에서 Td 토마토 단백질 GFP를 자극 nm.
  6. 세포를 해결 하 고 얼룩 세포 핵 단계 1.6-1.9에에서 설명 된 대로.
  7. Td-토마토 단백질 영상과 Hoechst 형광 현미경을 사용 하 여 얼룩. 352에 Hoechst 염료 자극 nm.
  8. ImageJ를 사용 하 여, GFP와 Td-토마토의 비율15셀을 계산 합니다.

4. 살아있는 단일 세포 신호에 상처 분석 결과 치유

  1. 씨 4-5 105 MDA-MB-231 셀 1ml x DMEM 문화 포함 된 미디어 FBS는 6의 각 음에 잘 접시 5% (50% 셀 confluency, 총에서 2 웰 스).
  2. 광고 CAGA12-Td-톰 의 22.5 μ를 가진 세포를 감염 (titer 5 x 1010 PFU/mL, 나 = = 2500).
  3. 24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
  4. 두 개의 교차 라인 P200 피 펫 팁을 사용 하 여 각의 셀 계층에 스크래치.
  5. 우물에서 오래 된 미디어를 제거 하 고 FBS 미디어 또는 잘 (10mg/mL 재고 있음, 최종 농도 5 ng/μ) 당 TGF-β의 0.5 μ 없이 신선한 5%의 2 개 mL를 바꿉니다.
  6. 5 분 동안 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓고 단계 대조 현미경에 100 배 확대를 사용 하 여 선택한 상처 영역에의 이미지.
  7. 24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
  8. 전에 같은 분야에서 상처 폐쇄의 이미지를 가져가 라.
  9. 세포를 해결 하 고 단계 1.6-1.9에에서 설명 된 대로 세포 핵 얼룩 상처 영역에 비 상처 영역에 형광 현미경 200 배 확대를 사용 하 여 Td 토마토 신호를 시각화.
  10. 상처에 ImageJ 소프트웨어15를 사용 하 여 비 상처 영역 Td-토마토 긍정적인 세포의 비율 계량.

5. 생체 외에서 Luciferase 분석 결과

  1. 3-5 x 5% 포함 된 DMEM 미디어의 1 mL에 104 MDA-MB-231 셀의 셀 서 스 펜 션 준비 FBS.
  2. 세포 현 탁 액의 2.5 μ와 감염 광고 CAGA12-루크 (titer 5 x 1010 PFU/mL, 나 = = 2500).
  3. 씨는 96로 감염 된 세포에 3000 셀/100 µ L/잘 잘 플레이트.
  4. 24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
  5. 우물에서 오래 된 미디어를 제거 하 고 신선한 5 %FBS 미디어와 함께 또는 없이 잘 (재고 1 mg/mL, 최종 농도 1 ng/μ) 당 TGF-β의 0.1 μ의 100 µ L를 바꿉니다 및 TGF-β 억제제 잘 (재고 7 mg/mL 당 0.17 μ의 유무에 최종 농도 12 ng/μ) (소설 TGF-β ligand 트랩 단백질, 첸 그 외 여러분, 게시 되지 않은 작업).
  6. 24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
  7. Thaw luciferase 분석 결과 시스템 기판 밖으로 하 고 1 x 셀 문화 세포 시 약 두 배 증류수 (DDW)에서 준비.
  8. 96 웰 스에서 미디어를 제거 하 고 30 분에 대 한 부드러운 동요와 궤도 셰이 커를 사용 하 여 얼음에 1 x 셀 문화 세포의 용 해 버퍼의 50 μ와 웰 스를 lyse.
  9. 불투명 luciferase 접시에 각 우물에서 30 μ lysate의 전송 및 실내 온도를 따뜻하게 접시 허용.
  10. 루미 노 소프트웨어에서 새 프로토콜을 만듭니다. 주입 전후 측정 1 인젝터를 선택 합니다. 1 주입 하기 전에 측정을 설정 지연 측정 및 통합 시간에 대 한 s. 주입 측정 후 설정 주입 볼륨 1의 지연 측정에 40 µ L를 주입 후 5 s s 통합 시간. 확인을 선택 하 여 설정을 확인 합니다.
  11. DDW로 인젝터 튜브를 놓고 사용 하기 전에 인젝터 튜브 청소 프라임 설정에서 인젝터 1 단추를 클릭 합니다. 다음 DDW와 공기 튜브에서 모든 솔루션을 플러시 인젝터 1의 두 개의 추가 소수 다음 장소에서 인젝터 튜브를 제거 합니다. 인젝터 튜브를 반딧불 기판 및 프라임 기판 준비를 두 번 다시 넣으십시오.
  12. 루미 노에 예제와 함께 불투명 luciferase 접시를 놓고 소프트웨어에 옵션 을 선택 합니다. 관심의 웰 스를 선택 하 고 적용을 클릭 합니다. Luciferase 신호 측정을 시작 을 누릅니다.
  13. 측정 완료 되 면 제거 하 고 접시 물으로 린스. 인젝터 관으로 공기와 반딧불 기판 관으로 다시 프라임 인젝터 1로 튜브를 배치 하 여 모든 나머지 기판을 복구 합니다. DDW로 인젝터 튜브를 놓고 두 개의 추가 소수 모든 나머지 기판의 인젝터 튜브 청소를 수행 합니다.

6. 셀 라이브 신호 이미징에 비보에 대 한 준비

  1. 종양 이식 전에 h 48 175 cm2 플라스 크 (총에서 10 플라스 크)에 2-3 106 MDA-MB-231 셀 배 씨. 셀에 20 mL의 5%를 포함 된 DMEM 미디어 문화 FBS 37 ° c, 10% CO2.
  2. 24 시간 후, 추가 300 μ의 광고 CAGA12-루크 (titer 5 x 1010 PFU/mL, 나 = = 2500) 각 플라스 크에. 또 다른 24 h에 대 한 문화에 셀을 계속.
  3. 이식의 날, 오래 된 미디어를 제거 하 고 한 번 20 mL PBS, pH 7.4의와 아 데 노 바이러스 감염 세포를 씻어. 플라스 크에 0.05% 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 추가 하 고 모든 플라스 크의 표면에 트립 신 수 있도록 약간 플라스 크를 흔들어. 37 ° C, 3 분 동안 10% CO2 배양 기에 있는 플라스 크를 놓습니다.
  4. FBS-포함 된 DMEM 미디어의 8 mL 플라스 크에 추가 하 여는 트립 신을 끄다. 유리 시 약 병에 모든 셀 정지를 전송 합니다.
  5. hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산 하 고 두 50 ml 원심 분리기 튜브 107 셀 x 4.8 전송.
  6. 트립 신을 제거 하 여 720 ml 신선한 FBS DMEM 미디어의 셀 resuspend RT 5 분에 대 한 400 x g에서 셀 원심
  7. 살 균 5 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 160 μ 추가 Matrigel (10% 총 matrigel 중지).
  8. 얼음에 세포 이식까지 유지.

7. Orthotopic 주입

  1. 그리고 무게 12 SCID 마우스 제어 및 치료 그룹 (6 쥐/그룹)으로 마우스를 무작위로 할당.
  2. 무 균 환경을 유지 하기 위하여 살 균 바이오-캐비닛에 주입을 수행 합니다. Anaesthetize 1 L/분 장소 열 패드 마우스의 산소 흐름 속도 2.5-4.5 %isoflurane 사용 하 여 마우스와 눈 연 고 각 막의 손상을 방지 하려면 양쪽 눈에 윤 활의 한 방울을 분배. isoflurane에 연결 코 콘으로 주 둥이 배치 하 여 마 취를 유지 하는 동안 부정사 위치에 열 패드를 마우스를 수정.
  3. 핀치를 발 끝에 대 한 반응의 부족에 의해 마 취의 성공을 확인 합니다. 1 L/min 산소 주입의 신호에 대 한 1.5-2.5%의 유지 보수 복용량 isoflurane를 줄입니다.
  4. 80% 에탄올으로 담근 면봉을 사용 하 여 중간 선 양쪽에 제 4 젖꼭지에서 피부를 청소.
  5. 촉진을 통해 4번째 유 방 지방 패드를 찾아서 더 조직을 노출 하는 지방 패드를 짠 다.
  6. 잘 아래로 pipetting으로 세포 현 탁 액을 혼합. 부드럽게 27 G 인슐린 주사기로 세포 혼합물의 50 µ L를 발음 하 고 유 방 지방 패드는 마우스의 양쪽에 주입.
  7. 뚱뚱한 패드의 붓기에 대 한 느낌으로 성공적인 주입을 확인 합니다. 부드럽게 지방 패드를 분리 하 고 감 금 소에 다시 마우스를 놓습니다.
  8. 새 장을 얻기 위해 의식 그리고 다음 3 일 동안 지주 방에 다시 감 금 소를 배치 마우스 수 있도록 적어도 30 분 동안 히트 패드에 둡니다.

8. IVIS 이미징

  1. 생활 이미지 소프트웨어를 엽니다.
  2. IVIS 시스템 제어판에서 IVIS 시스템 초기화 버튼을 클릭 하 여 초기화 합니다. 온도 기호를 녹색 밝혀 졌 때까지 기다립니다.
  3. 컨트롤 패널에서 Luminescent 이미징 모드를 선택 합니다.
  4. Isoflurane 마 취 약 실 및 IVIS 시스템을 켭니다.
  5. 1 L/min 산소 2.5-4.5 %isoflurane 사용 하 여 쥐를 anaesthetize. Anaesthetized, 유지 보수에 대 한 1.5-2.5%에서 isoflurane 설정. 복 (i.p.) 주입에 의해 쥐로 D-소의 150 밀리 그램/kg 체중을 주사.
  6. IVIS 시스템으로 마우스를 즉시 전송, 온도 제어 이미징 플랫폼에 그들을 배치 하 고 원뿔에 그들의 코를 장소.
  7. 컨트롤 패널에서 시퀀스 설정 버튼 클릭 하 고 중간 Binning선택.
  8. 다음과 같이 이미지 노출 시간 설정: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, 그리고 120 s. 시작 소 주사 후 약 3 분 영상 신호를 시작 될 때까지 이미지를 계속 (일반적으로 약 20 분 걸릴 것 이다).
  9. 코 통해 isoflurane 마 취를 유지 하면서 IVIS에서 쥐를 제거 하 고 50 µ L PBS 또는 50 µ L TGF-β 신호 전달 억제제 (50 μ g/종양) 종양 내 주입을 통해 마우스를 치료.
  10. 장에 다시 쥐를 넣고 30 분 이상 열 패드에 그들을 두고. 다음 지주 방에 케이지를 놓습니다.
  11. IVIS 치료 다음 날 위에서 설명한 절차를 이미지를 반복 합니다.

9. 데이터 분석

  1. 오픈 생활 이미지 소프트웨어에 파일을 저장.
  2. 보기 를 사용 하 여 이미지 정보를 찾기 | 이미지 정보입니다.
  3. 같은 노출 시간과 비슷한 시간 포인트에서 촬영 한 사진을 선택 합니다. 그룹으로 사진을 로드 합니다.
  4. 강도 정상화 이미지 조정 에서 개별 상자 선택을 취소 합니다.
  5. 강도 분석을 광자 모드를 선택 합니다. 투자 수익 도구에 관심 영역 (ROI) 버튼을 선택 하 여 신호 강도 수량화 합니다.
  6. 발광 신호를 포함 하는 지역에 투자 수익 원을 드래그 하 고 신호 강도 얻으려고 측정 버튼을 클릭.

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결과

단일 세포 생체 외에서 이미징 라이브

정확 하 게 평가 아 데 노비 루스 기반 시 약을 사용 하 여 단일 세포에서 TGF-β/Smad 신호의 활성화, 그것은 먼저는 최적의 다양성의 감염 (MOI) 각 셀 라인을 결정 하는 것이 중요. 최적의 나 셀의 100%는 아니 현재 cytopathic 또는 세포 독성 효과 adenoviral 감염에 대 한 긍정적인 결정 됩니다. 이 결정, 우리는 긍정적인 감염의 감 적으로 constitutively 활성 광고-CMV-Td-톰 기자를 사용 합니다. 아 데 노 바이러스 감염 세포의 비율이 나 의존 하는 방식으로 0에서 5000 나에 증가 되었다. 2500만에서 MDA-MB-231 셀 (그림 1A, 1B)에 100 %Td...

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토론

TGF-β/Smad3 단일 라이브 셀에 신호의 실시간 이미징에 대 한 수 있도록 기술을 개발 했습니다. 이 새로운 방법을 사용 하 여, 우리는 이전 확인 셀의 하위 인구 동적 TGF-β/Smad3 transcriptional 활동 향상 된 내 습 및 마이그레이션8에 연결. 이 방법은 Smad3 인 산화의 서쪽 오 점 등 TGF-β 신호에 대 한 전통적인 분석 실험에 개선 및 TGF-β는이 포착 하 여 유전자 발현을 대상 TGF-β/Smad3 종양 인구 내의 신호 및 강조의 단일 세포 생물학의 중요성입니다. 또한, 시간이 소모 및 비싼 핵 전 좌 수와 같은 단일 셀 이미징의 대체 방법에서 수행 하는 경우 라이브 세포와 유전자 전사16,17에 항상 번역 하지 않을 수 있습니다. 이러한 메서드는 신호 변환의 업스트림 경로 검사 하는 것이 중요, 아 데 노비 루스 기자 시스템 생물학 기능에...

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공개 사항

저자는 충돌의 관심을 보고.

감사의 글

이 작품은 H JZ를 국가 건강 및 의료 연구 위원회 (NHMRC)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. TMBW는 Templestowe 로타리와 치료에 대 한 식사 파트너에 호주 정부에서 오스트레일리아 대학원 포상 및 호주 로타리 건강에서 앤 헨 더 슨 최고 최대 장학금 받는 사람입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMThermoFisher188102437°C에서 웜; C 사용 전 수조
태아 소 세럼Scientifix LifeFBS500-S사용 전 열 비활성화
재조합 인간 TGF-β 1PEPROTECH100-21DDW의 분취량으로 10 mg/mL에서 최종 농도
Hoechst-33258Tocris Bioscience5117PBS로 희석하여 1 &mu에서 최종 농도 만들기; L/mL
Luciferase Reporter Assay KitPromega197897사용 전 PBS에서 5배 희석
LuminometerPromega9100-002
위상차 형광 현미경 OLYMPUSIX50
원심분리기eppendorf5810 R
VivoGl LuciferinPromegaP1041
IVIS Lumina III In Vivo 이미징 시스템PerkinElmerCLS136334
0.5% Trypsin-EDTA (10x)ThermoFisher15400-0540.05%(1x)로 희
5x 시약PromegaE153A, DDW에서 1x로 희석
10% 포르말린Sigma-AldrichF5554-4L
, HEK 293A,ThermoFisherR70507
MDA-MB-231ATCCCRM-HTB-26
PRKDC-SCID동물 자원 센터SCIDF6
MatrigelCorning354234
IsofluraneZoetis26675-46-7
에탄올Chem-supplyEA043-10L-P
리프레시 나이트 타임알레르간1750D윤활 눈 연고
<강력>용액 < / 강>< 강>조성 < / 강>
인산염 완충 식염수 (PBS)NaH 2 < / sub>PO 4 < / sub>.2H 2 < / sub>O (4 mM); NaHPO4 (16mM); 염화나트륨(0.12M)
FBS-DMEM 5 % 열 비활성화 FBS; 10 μ g/mL 페니실린; 100 &뮤; g/mL 스트렙토마이신
PBS 세포 배양 용해에서 석

참고문헌

  1. Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
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