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방법 논문

Nanosensors 프로 테아 제 활동에 감지 비보에 비 침 투 적인 진단에 대 한

16.4K 조회수

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DOI:

10.3791/57937

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2018년 7월 16일

 ,  , 

이 논문에서

요약

프로 테아 제는 기본적인 생물학 과정 및 암과 같은 복잡 한 질병의 dysregulated 프로 테아 제 활동 드라이브 진행에 관련 된 단단히 규제 효소. 이 방법의이 목표 호스트 소변에서 감지 하 고 질병을 차별 분열 신호를 생산 하 여 효소 활동에서 vivo에서 측정 하는 nanosensors를 만드는 것입니다.

초록

프로 테아 제는 다기능 효소 펩 티 드 결합의 가수분해에서 전문 및 항상성 등 allostasis 광범위 한 생물 학적 과정을 제어. 또한, dysregulated 프로 테아 제 활동 pathogenesis 드라이브 이며 암;과 같은 질병의 기능 바이오 마커 따라서, 효소 활동에서 vivo에서 감지 하는 능력은 생물 의학 진단에 대 한 임상 관련 정보를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표 조사 효소 활동에서 vivo에서 소변에서 정량 신호를 생산 하 여 nanosensors를 만드는 것입니다. 이러한 효소 nanosensors의 두 가지 구성 요소 구성: 나노 및 기판. 대상 질병 사이트에 순환 반감기 및 기판 납품 증가를 나노 기능. 기판은 짧은 펩 티 드 순서 (6-8 AA), 대상 효소 또는 프로 테아의 그룹에 구체적으로 설계 된입니다. 기판은 나노 입자의 표면에 활용 하 고 탐지를 위한 형광 표식 같은 기자에 의해 종료 됩니다. Dysregulated 프로 테아 제 펩 티 드 기질 다니엘로 기자 프로 테아 제 활동의 한 biomarker로 정량화에 대 한 소변으로 필터링 됩니다. 여기는 매트릭스 metalloproteinase 9 (MMP9), 종양 진행 및 전이, 대 장 암 마우스 모델에서의 검출에 대 한 관련 된에 대 한 nanosensor의 건설에 설명 합니다.

서론

프로 테아 제 펩 티 드 결합의 가수분해를 전문화 하 고 항상성, 질병1, allostasis, 등 많은 생물 학적 과정을 중요 한 통제가 다기능 효소는. 프로 테아 제 활동의 변경된 상태 질병, 암 및 심장 혈관 질병, 프로 테아 제 임상 생체2,3으로 개발을 위한 매력적인 후보자를 만드는 등의 다양 한 상관 되었다. 또한, 프로 테아 제 활동은 별개에 기능적으로 연결 된 pathogeneses, 환자 결과 및4질병 예 후. 넓게, 바이오 센서 개발 되었습니다 다양 한 생물 학적 현상을 감지 하 고 질병, 암, 신경 질환, 전자 등 처리5,6,,78 , 9. 좀 더 구체적으로, 기판 기반 효소 센서 프로 테아 제 활동을 감지 하 여 진단 이미징10 fluorogenic 프....

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프로토콜

연구원의 교육 기관에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 기관 승인 다음 동물 실험을 수행 하는 데 필요한입니다. 또한, 표준 동물 보호 시설 (예를 들어, 챔버, 무 균 동물 후드, anesthetization, isofluorane 챔버 및 윤리적인 끝점 euthanization에 대 한 공동2 챔버)는이 제대로 수행 하는 데 필요한 실험입니다. 특별 한 교육 및 이러한 시설 지원 하나의 기관에 생리 연구 실험실 (PRL) 하 여 제공할 수 있습니다. 모든 동물 일 조지아 공대에 IACUC에 의해 승인 되었다 (프로토콜: A14100).

1. 산화 철 나노 입자 (IONP) 합성

참고: 안전: 전체 산화 철 나노 입자 합성 개인 보호 장비를 사용 하 여 수행 해야 합니다 및 아래 화학 증기 두건.

  1. 15 mL 원뿔 튜브에 1 mL의 30%는 30 분 동안 얼음 양동이에 수산화 암모늄을 진정.
  2. 250 mL 삼각 플라스 크 이온된 수로 세척 하 고 10 mL 두 배 증류수 (ddH2O) 추가. 볶음/열 접시에 얼음 목욕에서 플라스 크의 외부 잠수함 DdH2O는 플라스 크....

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결과

대부분의 인구는 IONPs의 평균 직경 40-50 nm에서 범위는 주위에 이다. Pegylation, 후이 크기 범위는 약 6 시간13 생체 내에서 의 순환 반감기 ( 그림 2a참조). 특정 크기 범위에 대 한 선택 하 고 싶다면 하나 하나 다른 직경을 가진 IONP 분수 분리 하 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 수 있습니다. 가장 하 여 나노 입자 dextran의 외부 층에 의해 함께 개별 구형 철 산화물 나노 입자 가교 된으로 표시 됩니다. 13  IONPs의 솔루션 없이 촉진 하 고 가벼운 브라운 컬러로 반투명 표시 됩니다. 성공적인 펩 티 드 활용 후 흡 광도 스펙트럼 분석 형광 기자의 최대 여기 파장에서 독특한 흡 광도 피크를 발표할 예정 이다. FITC, 경우이 것 가운데.......

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토론

이 방법은 나노 코어를 활용 하는 프로 테아 제 기판으로 구성 된 활동 기반 nanosensors의 개발을 설명 합니다. 쪼개진된 펩 티 드 제품은 5 nm23 및 비 침 투 적인 신호를 생성 하는 소변으로 필터의 신장 크기 여과 한계 보다 작은 때문에 분해 분열의 이벤트 "pharmacokinetic 스위치", 불리는. 따라서, 그것은 유체역학 반경 5 보다 큰 나노 입자 또는 운반대를 사용 하는 것이 중요, 아무것도 작은 신장으로 빠르게 삭제 됩니다 및 소변 신호를 혼동. 때문에 그들은 FDA 승인, 잘 용납 하 고 3-5 시간 순환 반감기 pegylated IONPs 사용 합니다. 13 nanosensors 공식화에서 또 다른 중요 한 고려 사항은 펩 티 드 기질 어 금 니 비율을 못. 24 , 25 오프 대상 프로 테아 제 펩 티 드.......

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공개 사항

박사 Kwong 공동 설립자 이며 Glympse 바이오, 제품 개발은 컨설턴트가이 문서에서 설명 하는 연구와 관련 된 역할을 한다. 이 연구는 그의 개인 재정 상태에 영향을 수 있습니다. 이 계약 조건 검토 되었고 조지아 공대의 상충 정책에 따라 승인

감사의 글

이 작품은 NIH 감독의 새로운 혁신 상 수상 (제에 의해 투자 되었다 DP2HD091793)입니다. NSF 대학원 연구 장학 프로그램 (보조금 번호 Q.D.M.는 지원 DGE-1650044). B.A.H는 국립 연구소의 건강 GT BioMAT 훈련 그랜트 보너스 번호 5T32EB006343에서 조오지 아 기술 대통령의 친교에 의해 지원 됩니다. G.A.K.는 버로우즈 환영 기금에서 과학적인 인터페이스에서 경력 수상을 보유 하고있다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2 & 마이크로; m 주사기 필터VWR4652
18G 니들VWR89134-024
15 mL 원추형VWR89039-670
250 mL 삼각 플라스크VWR89000-362
교반 막대VWR58949-006
핫 플레이트/마그네틱 교반기VWR97042-634
빙초산VWR97064-482
소 혈청 (BSA)의 알부민Thermo FisherA13100
철 (III) 염화물 육수화물시그마236489
철 (II) 염화물 테트라 하이드레이트시그마44939
에피클로로히드린시그마45340-500ML-F
DMF 시그마D4551
암모늄 수산화물시그마320145-500ML
수산화 나트륨 펠릿시그마221465-500G
EDTA시그마E9884
붕산 나트륨시그마B9876
L-시스테인시그마168149-100G
트리스 HCl시그마T5941
트리스 베이스시그마T6066
PBS 정제SigmaP4417
DextranPharmacosmos5510 0020 9006
Amicon 15 mL 10k 필터, 24 pkMilliporeUFC901024
Amicon 15 mL 30k 필터, 24 pkMilliporeUFC903024
Amicon 15 mL 100k 필터, 24 pkMilliporeUFC910024
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalNanoZS
Slide-A-Lyzer 투석 카세트LifeTech66130
Dynabeads MyOne TosylactivatedLifeTech65501
SIALife Tech22349
PEG 20kLaysan BioMPEG-SH-20K-1g
Fluorescein 항체 [2A3]GeneTexGTX10257
Hiload 16/600 superdex 200GE 헬스케어45-002-490
플레이트 리더FisherBTCYT5M
BD 인슐린 주사기FisherNC0872854

참고문헌

  1. Lopez-Otin, C., Bond, J. S. Proteases: Multifunctional enzymes in life and disease. Journal of Biological Chemistry. 283 (45), 30433-30437 (2008).
  2. Hua, Y., Nair, S. Proteases in cardiometabolic diseases: Pathophysiology....

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