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방법 논문

임상 드레싱 평가 대 한 돼지 모델에서 가혹한 화상 상해

9.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57942

⸱

2018년 11월 6일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Medical Sciences, National Defense Medical Center, 2Department and Graduate Institute of Biology and Anatomy, National Defense Medical Center, 3Department of Gerontological Health Care, National Taipei University of Nursing and Health Sciences, 4Division of Rheumatology/Immunology/Allergy, Department of Internal Medicine, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center, 5Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Tri-Service General Hospital, 6Department of Nursing, Yuanpei University, 7Department of Physiology and Biophysics; Graduate Institute of Physiology, National Defense Medical Center, 8Division of Urology, Department of Surgery, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center

이 논문에서

요약

밀접 하 게 모방 화상 상해의 모드 하려면 임상 관찰과 동물 모델에서 연구 사이 상호 작용. 이 연구에서 가혹한 화상 상해의 돼지 모델 생리 및 병 태 생리 설정에서 실험적인 드레싱을 평가 하기 위해 설립 되었다.

초록

상처 치유는 동적 복구 프로세스 이며 인간의 삶에 가장 복잡 한 생물 학적 과정 이다. 화상 부상에 대응, 생물 학적 경로 변경 지연된 상처 치유의 결과로 염증 응답 손상. 절단과 같은 불리 한 결과에 지도 하는 당뇨병 환자에서 발생 자주 장애인된 상처 치유. 따라서, 드레싱 화상 상처 수리를 홍보에 유익한 효과가 필요 합니다. 그러나, 화상 상처 치료에 대 한 연구는 적절 한 동물 모델의 부족으로 인해 제한 됩니다. 우리의 이전 연구 최소 침 습 수술 기법을 사용 하 여 쥐와 돼지 모델에서 상처 치유 성능 증명. 상처 수축 제거 가혹한 화상 상해의 돼지 모델을 설명 하기 위해이 연구 목적 그리고 더 밀접 하 게 다시 epithelialization 및 새로운 조직 형성의 인간 과정에 근접. 이 프로토콜 일관 된 화상 상처를 만들고 돼지 모델에서 실험적인 드레싱의 치료에서 치유 하는 부상을 성능 검사에 대 한 자세한 절차를 제공 합니다. 6 화상 상처 만들어진 대칭 등에 있는 4 개의 층의 임상 드레싱 덮여 있었다: 실험 재료, 방수 필름 내부 중간 계층, 거 즈, 외부 중간 층의 내부 연락처 계층 그리고 접착 석고의 바깥 레이어입니다. 실험 완료 되 면 상처 폐쇄, 상처, 지역과 밴쿠버 흉터 규모 점수는 시험 되었다. 샘플에서는 각 동물 후 희생에서 절제 하는 피부의 조직학 준비 했다 고 되며 고 오신 얼룩을 사용 하 여 스테인드. 상처 치유의 맥락에서 각 드레싱의 항균 활동 또한 시험 되었다. 임상 돼지 모델에서 상처 드레싱의 응용 프로그램 epithelialization, 세포 증식과 신생의 프로세스와 관련 하 여 치유 하는 인간의 상처의 생물 학적 과정을 모방 합니다. 따라서,이 돼지 모델에는 가혹한 화상 상해에서 임상 드레싱의 효과 평가 하기 위해 배우기 쉬운, 비용 효과, 및 강력한 방법을 제공 한다.

서론

화상 상해 염증 성 프로세스를 시작 하 고 환자의 삶의 질에 부정적인 영향의 결과로, 사고 직후 수많은 신체 기능에 영향을 미치는 복잡 한 병 적인 효과 유도 한다. 장애인된 상처 치유 상당한 사망률 그리고 사망 환자 중 당뇨병 mellitus1,2와 발생합니다. 화상 부상으로 대부분의 환자는 화상 상처 debridement, 강력한 opioid 진통제3의 사용에도 불구 하 고 극심 한 과정으로 알려져 있는 동안 통증을 경험.

다른 포유류와 달리 돼지 인간 epithelialization, 세포 증식 및 신생 과정에 관한 여러 해 부와 생리 적인 특성을 공유. 이 돼지 특정 절차 및 연구, 잠재적으로 더 나은 모델을 만들고 그들은 쥐에 있는 유망한 결과 설명 하는 후속 연구에서 자주 사용. 이러한 특징은 전 임상 시험에서 주요 종족으로 돼지의 증가 사용에 이르렀다. 최근, 생물 의학 연구에 심혈 관 질환, 비뇨 기, 외피, 존경 및 소화 시스템의 급속 한 증가4,,56관찰 되었습니다. 이 연구 상처 수축 제거 하 고 새로운 조직의 형성과 인간의 상처 치유 과정의 더 가까운 근사치를 제공 하는 가혹한 화상 상해의 돼지 모델을 설명 하는 것을 목표로. 6 화상 상처에 돼지의 척추의 각 측면에 3 등, 대칭으로 만들어졌습니다. 다음으로, anexperimental 드레싱 인간의 상처 치유 (그림 1) 복제에 적응 될 수 있는 가혹한 화상 상해의 돼지 모델에서 시험 되었다. 상처는 4 개의 층의 구성 되는 임상 드레싱으로 덮여 있었다: 실험 재료의 내부 연락처 계층, 방수 필름 내부 중간 계층, 거 즈, 외부 중간 층 및 접착 석고의 외부 층. 방수 필름 세균 감염을 방지 하 고 가스 드레싱 침투를 허용 하는 동안 습 한 상처 환경을 유지 합니다. 거 즈의 외부 중간 레이어 방수 필름에 적용 되었고 접착성 고 약의 외부 층에 의해 보호. 실험의 완성, 폐쇄 상처, 상처 및 밴쿠버 흉터 규모 (VSS) 점수는 시험 되었다. 샘플에서는 각 동물 후 희생에서 절제 하는 피부의 조직학 준비 했다 고 hematoxylin와 (그가) 오신 얼룩을 사용 하 여 스테인드. 상처 치유의 맥락에서 각 드레싱의 항균 활동 또한이 모델에 시험 되었다. 우리의 이전 연구는 상처 치유 성능을 최소 침 습 수술 방법7을 사용 하 여 쥐와 돼지 모델에서 설명 했다. 6 각 돼지 내 등에서 상처를 굽기 때문에, 각 실험 드레싱 테스트 하 고 치유 과정에 돼지 등 다양 한 관광 명소에 상처와 관련 된 편견을 최소화 하기 위해 모든 위치에서 평가 했다. 따라서,이 연구에 가혹한 화상 상해의 돼지 모델 임상 드레싱의 평가 대 한 새로운 접근법을 제공 하 고 화상 상해에 대 한 새로운 치료의 개발을 용이 하 게. 이 연구는 화상 상처 치유의 이상 밝히기 위해 중요 한 도구를 제공 합니다.

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프로토콜

동물 주제와 관련 된 절차는 국가 방위 의료 센터, 대만 (R.O.C)에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 이 연구는 실험실 동물 센터 국가 방위 의료 센터에서 실시 되었다. 돼지 20 및 25 kg 사이 무게는 되었습니다 성공적으로 계측이 프로토콜을 사용 하 여.

1. 인간 취급을 동물의 적응

  1. 시설에 도착, 후 려 동물 집 하지만 그들이 서로 상호 작용.
  2. 동물 음식과 물에 대 한 광고 libitum 액세스를 제공 합니다.
  3. 동물 적어도 1 주일 동안 하루에 한 번 처리 하 여 실험 연구실을 동물 시설에서 인간 취급 및 운송에 돼지를 적응.
  4. 구역 질, 구 토, 그리고 위장 체액의 열망을 방지 하기 위해 수술 전에 적어도 12 시간 동안 동물을 빨리.

2입니다. 진정

  1. 화상 상처 창조 하기 전에 동물을 통해 Zoletil 50 (25 mg/kg) 정 맥 주사 진정.

3. 삽 관 법 및 환기

  1. 테이블 및/또는 sternal 위치에 트롤리에 동물을 놓습니다.
  2. 구두 분산기와 동물의 입을 엽니다.
  3. 문 턱의 부족 휴식 또는 삼 키는 반사의 존재는 삽 관 법, 마스크 isoflurane 진정 작용을 유도 하는 것으로 돼지를 방해.
  4. 잠재적인 합병증을 방지 하기 위해 수술 중 생리 신호 모니터에 혈압, 심장 박동 및 체온을 모니터링 합니다.

4입니다. 마 취

  1. 유도 하 고 유지 하는 마 취; 가급적 이면 tiletamine 및 zolazepam (25 mg/kg + 25 mg/kg)의 근육 주사를 통해 동물을 anesthetize.
  2. 때 근육의 이완, 턱의 손실에 의해 특징 및 종을 reflexed, endotracheal 튜브와 함께 동물을 넣어야 관찰 되었다.
  3. 0.5-2.5의 기화 설정에서 마 취 상태에서 모든 돼지를 유지 % (v/v) isoflurane 수술의 끝까지.
  4. 수술 전에 뒷 다리 발가락 스푼으로 통증이 반사를 테스트 하 여 마 취의 깊이 검사 합니다. 필요한 경우 추가 마 취를 추가 하거나 몇 분 동안 기다립니다. 수술 내내 정기적으로 통증이 반사를 확인 하십시오.

5입니다. 수술 부위의 살 균

  1. 면도 하 고 양쪽에 겨드랑이를 척추 칼럼에서 약 25 cm 폭의 지역 동물의 피부를 청소.
  2. Povidone-요오드 스크럽 (75 mg/mL) 약 5 분으로 moisturized 피부를 문질러.
  3. Povidone-요오드 비누 젖은 살 균 gauzes를 사용 하 여 피부에서 제거 합니다.
  4. Povidone-요오드 로션 (100mg/mL)으로 피부를 소독.
  5. 세균성 전송 및 외과 사이트의 후속 오염 줄이기 위해 불 임 수술 커튼으로 동물을 커버.

6. 화상 상처 만들기

  1. 수술 마킹 펜을 사용 하 여 대칭으로 돼지의 등에서 6 화상 상처의 센터를 표시. 각 화상 상처 사이의 거리는 최소 상처 (그림 1A)의 반경 보다 큰 확인 하십시오.
  2. 글 리세 린 50 mL와 수정된 납땜와 온도 모니터링 하는 데 그것에 전자 온도계를 삽입. 뜨거운 철 약 9 cm2 (그림 1B)의 평면 영역을 소유한 다.
  3. 핫 플레이트 (그림 1C) 137-139 ° C에 철을가 열.
  4. 30 초 (그림 1C)에 대 한 어떤 힘을 적용 하지 않고 표시 된 지역에는 철을 배치 하 여 6 획 일 한 화상 상처를 만듭니다.
  5. 0.9% 식 염 수 솔루션 (그림 1D) 화상 상처를 씻어.
  6. 상처 크기를 측정 하 고 photomicrography (그림 1E)에 의해 상처를 기록 합니다.

7입니다. 드레싱의 준비

  1. 직접 접촉을 통해 4 층 임상 드레싱의 내부 연락처 레이어와 각 상처를 커버. 이 계층에 대 한 대문자 포함 된 드레싱 또는 대체 물질 (그림 1 층)을 사용 합니다.
  2. 세균 침투 (그림 1 층)에 대 한 장벽으로 임상 드레싱에 방수 필름을 적용 합니다.
  3. 거 즈 (0.5 ㎝ 두께)와 각 상처를 커버 하 고 드레싱 (그림 1G)의 중간 계층 역할을 종이 테이프로 해결.
  4. 접착성 고 약의 외부 층으로 거 즈를 보호 합니다. 드레싱의 변위를 피하기 위해 몸통에이 레이어를 확장 (그림 1 H-1J).

8. 사후 관리 및 레코딩 측정

  1. 모든 8-12 h, 1 주일에 대 한 마 취에서 회복 하기 전에 잠재적인 통증을 줄이기 위해 시작에 대 한 통증 관리에 대 한 buprenorphine (0.1 mg/kg, 메신저)와 돼지를 주사.
  2. 피드와 물 돼지 무료로 이용할을 수 있습니다.
  3. 처음 10 일 동안 2 일 마다 임상 드레싱을 변경 하 고 다음 6 주 동안 일주일에 두 번 공부.
  4. 깨끗 하 고 임상 드레싱을 다시 적용 하기 전에 상처를 측정. 드레싱 변경 시 마 취약을 관리 합니다.
  5. 처음 10 일 동안 2 일 마다 상처 치유 속도의 비교에 대 한 photomicrography에 의해 상처를 기록 하 고 다음 6 주 동안 일주일에 두 번 공부.
  6. 상처 다시 epithelialization 또는 수축 앞에서 설명한 방법에 따라 원래 상처 크기의 백분율로 계산 합니다. 상처 폐쇄의 분석은 눈 멀게 하는 이중 방식으로 실시 됐다.
  7. 4 개의 변수를 이루어져 있는 VSS를 사용 하 여 화상 흉터를 측정: vascularity, 높이 (두께), 유연성, 및 0, 7, 21, 및 42 후 굽기 일에 착 색. 각 변수는 4 ~ 6 가능한 점수. 총 점수 범위는 0에서 14, 0의 점수를 반영 하는 그것에 의하여 정상적인 피부.

9. 세균 성장 실험 후 화상 조직의

  1. 면봉 항균 테스트 후 굽기 일 0, 7, 21, 및 42에 대 한 상처.
  2. 100 mL의 멸 균 생리 식 염 수 0.9%와 부드럽게 균일 현 탁 액을 달성 하는 소용돌이에 면봉을 놓습니다.
  3. 직렬로 희석 (10− 1– 10−5)는 homogenate와 선택적이 고 비선택적 미디어, 각 희석의 100 μ를 각각 접시.
  4. 24-72 시간 동안 37 ° C에서 호 기성 조건 하에서 모든 희석을 품 어.
  5. 혈액 한 천 배지 호 기성 그람 양성 균을 5% 양 혈액 보충에 모든 희석에서 각 10 μ의 플레이트 triplicate aliquots.
  6. 확산 또는 형성 하는 식민지의 수를 결정 하는 데 하룻밤 한 천 배지 표면에 균일 하 게 샘플을 붓는 하 여 샘플을 품 어 단위 (CFUs).
  7. 밤새 부 화 후 번호판을 읽기. 양 혈액 한 천 배지를 반전 하 고 마커 및 작은 눈금자를 사용 하 여 4 개의 동등한 사분면으로 접시의 바닥을 나눕니다.
  8. 해 부 현미경의 스테이지 위에 접시를 놓고 각 접시에 식민지를 계산 합니다. 정의 함으로써, 식민지 최소 300 CFU 열거할 수 있어야 합니다.
  9. 3 복제의 각 세균성 식민지를 계산 합니다. 3의 평균 값을 복제를 계산 합니다. 접시 당 CFU 최종 희석 비율 평균 값을 곱하여 결정 합니다.

10. 안락사와 조직 고정

  1. 정 맥 주사 나트륨 pentobarbital 안락사 솔루션 (80-120 mg/kg)의 과다.
  2. 일괄적 화상 상처 조직의 기본 근육 및 unwounded 조직 주변을 포함 하는 절단을 수행 합니다.
  3. 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린으로 조직 수정.
    1. 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS) 및 4 ° c.에 게 90 mL에 포름알데히드 (37%)의 10 mL를 혼합
    2. 조직 정착 액을 전송 하 고 모든 조직 정착 액에 완전히 몰입 하 되도록 컨테이너 소용돌이. 정착 액의 30 배 조직 볼륨 이어야 합니다.
    3. 4 ˚C에서 티슈를 하룻밤 수정.
  4. 조직 에탄올 탈수 하 고 파라핀 블록에 포함. 통에 4 ˚C에서 다음 단계를 수행 합니다.
    1. 30 분 동안 PBS로 2 회 세척.
    2. 탈수 조직 70% 에탄올과 8 시간, 80% 에탄올 하룻밤, 95% 에탄올에 대 한 8 시간, 그리고 100% 에탄올에서 하룻밤.
    3. 추가 8 시간 동안 100% 에탄올에 티슈를 품 어.
    4. 30 분 동안 각 크 실 렌의 세 가지 변화에 조직을 품 어.
    5. 갓 녹은 (52 ° C) 왁 스로는 크 실 렌을 대체 하 고 52 ° c 오븐에서 1 시간 동안 품 어.
    6. 신선한 왁 스는 왁 스를 바꿉니다 및 3 시간, 52 ° c 오븐에서 품 어 다음 한 번 더 교체 고 하룻밤 52 ° C에서 품 어.
    7. 1 시간, 조직 각 왁 스의 두 더 많은 변화를 품 어 하 고 조직을 포함 4 ° c.에 저장
  5. 컷 하 고 그, 파라핀 포함 섹션 얼룩 통해 100× 확대와 함께 가벼운 현미경 시각화.
    1. 로타리 톰을 사용 하 여 파라핀 섹션을 만듭니다.
    2. 3 분 동안 각 크 실 렌의 3 개의 변경 섹션을 dewax.
    3. 3 분, 100%, 95%, 80%와 70% 에탄올 각 티슈를 rehydrate 하 고 증류수에 담가.
    4. 10 분 동안 hematoxylin와 stain 고 실행 하는 수돗물에 씻어.
    5. 5 분 동안 0.1% 염 산 에탄올과 분화 하십시오 그리고 수돗물에 씻어.
    6. 1 분에 0.5% 오신와 얼룩.
    7. 2 분 동안 70%, 80%, 95%, 및 100% 에탄올 각 티슈를 탈수.
    8. 크 실 렌로 얼룩이 지 고 건조 한 증기 두건에서.

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결과

화상의 지속 시간이 30 초 뜨거운 철에 의해 잘 정의 된 여백 원형 되었고 홍 (그림 1D)의 변죽으로 균일 하 게 창백한 상처에 결과. 각 동물 내는 등에 6 화상 상처 있었다. 화상 상처의 배치는 그림 1 K에서에서 묘사 했다. 화상 상처 했다 완전히 모자 포함 된 드레싱으로 덮여 흉터 형성 후 굽기 일 0, 7, 21, 및 42의 깊이 평가 하는 데 사용 하 고 다시 epithelialization에 의해 결정으로 총 검사. 화상 상처 후 굽기 일 42에 총 검사에 따라 다시 epithelialized 했다. 이 동물에 상처 크기는 상처 치유 속도 (그림 2A)를 결정 하기 위해 평가 되었습니다. 상처 지역 9, 10, 8, 및 3 c m2 에 있었다 후 굽기 일 0, 7, 21, 및 ...

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토론

현재 연구 가혹한 화상 상해의 돼지 모델을 설립 하 고 캡이 포함 된 드레싱을 사용 하 여 모델을 검사. 우리의 결과이 돼지 모델 항균 속성을 포함 하 여 실험적인 드레싱의 임상 성능 모니터링에 사용할 수 있습니다 것이 좋습니다. 상처 치료 속도, 상처 폐쇄 및 항균 활동 또한 VSS, H & E 얼룩, 및 항균 테스트를 사용 하 여 분석 되었다. 동물 화상 모델의 사용은 화상 상해의 이상 검토 하는 귀중 한 도구로 개발 되었습니다. 쥐-특정 시 약의 높은 번호와 복구에서 활성 분자 신호 경로 발견 하, 유전자 변형 쥐를 얻기의 실용적인 측면을 포함 하 여 실험 과목으로 쥐를 사용 하 여 특정 생물 학적 이득이 있다 프로세스입니다. 그러나, 동물 화상 모델에서 쥐를 사용 하 여의 주요 단점은 인간의 상처 치유 과정을 완전히 실패입니다. 다시 epithelialization은 빠른 방식으로9에 상처 수축에 따라 강하게 쥐에서 치유 하는 상처를 인간8

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 연구는 세 배 서비스 종합 병원;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 국가 방위 의료 센터, 대만 (TSGH-C107-042); 사역의 과학 및 기술, 대만 (대부분 106-2314-B-016-014); 국가 방위 의료 센터 (MAB-106-055; MAB-106-010; MAB-107-064).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
진정제:
KetamineMerial2528 ESP10 mL 바이알
AzaperoneChina chemical & pharmaceutical47W406100 mL 바이알
아트로핀 동양 화학 작품IN1208021mL 바이알
<강력한>마취제:
틸레타민+졸라제팜VirbacBC915mL 바이알
이소플루란백스터N002A225100mL 바이알
<강력한>수술:
이발기Moser--
포비돈 요오드 스크럽 용액Ever starHA1612024 L barrel
Modified iron--
0.9% 식염수CHI SHENGKC130500 mL 바이알
거즈중국 외과 드레싱 센터MO1590008010 x10 cm
CAPSCoreLeader Biotech Co., Ltd, Taipei, Taiwan--
Paper 테이프3MNDC-8333-1530-012.5cm x 9.1m
방수 필름3MNDC-8333-1600-4010cm x 10m
접착 석고영 화학 물질BH142601510cm x 10m
<강>해부:
표준 샤프/뭉툭한 직선 가위 쌍(14cm)Shinetec 악기ST-S114-
ショルスティックション (12.5 cm)シュイテックスタンST-H012-
핸들 (# 4)シュイテッST-H004-Surgical
Blade(# 21)シュイテッククシューズST-B021-
Post-Fixation& 저장:
50 ml 플라스틱 원심분리기 튜브 Falcon352070-10
% 중립 완충 포르말린Leica3800604EG-
<강한>세균 성장 실험 
Blood 한천 플레이트(BAP) (5% 양 혈액이 함유된 TSA) CMP-90mm 모노
クシュール

참고문헌

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