방법 논문

설치류와 인간의 조직에 급성 Ictal 활동의 생성 및 요청 시 개시

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DOI:

10.3791/57952

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2019년 1월 19일

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1Division of Fundamental Neurobiology, Krembil Research Institute, 2Institute of Medical Science, Faculty of Medicine, University of Toronto, 3Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Division of Neurosurgery, Department of Surgery, University of Toronto, 5Division of Neurology, Department of Medicine, University of Toronto, 6Department of Physiology, University of Toronto

이 논문에서

요약

급성 발작 모델은 epileptiform 이벤트를 기본 메커니즘을 공부 하 고 중요 합니다. 또한, epileptiform 이벤트에 수요를 생성 하는 기능에는 그들의 개시를 기본 이벤트의 정확한 순서를 공부 하 매우 효율적인 방법을 제공 한다. 여기, 우리가 마우스 및 인간의 조직에 급성 4-aminopyridine 대뇌 피 질의 발작 모델을 설명 합니다.

초록

발작을 제어 의료 사회에 대 한 도전적인 문제에 남아 있다. 진행을 하려면 연구원은 광범위 하 게 발작 역학을 연구 하 고 그것의 근본적인 메커니즘을 조사 하는 방법이 필요 합니다. 급성 발작 모델 편리, electrophysiological 녹음을 수행 하는 기능을 제공 하 고 electrographic 발작 같은 (ictal) 이벤트의 큰 볼륨을 생성할 수 있습니다. 급성 발작 모델에서 유망한 결과 만성 간 질 모델 및 임상 시험을 다음 고급 수 있습니다. 따라서, 급성 모델을 충실 하 게 복제 한 임상의 electrographic 및 동적 서명에서 발작을 공부 하 고 임상 관련 연구 결과 만들기 위한 필수적인 것. 인간 조직에서 준비 하는 급성 발작 모델에서 ictal 이벤트 공부도 임상적으로 관련 된 연구 결과 만들기 위한 중요 하다. 이 문서의 주요 초점이 이다 vivo에서 그리고 생체 외에서 연구 뿐만 아니라 마우스 및 인간의 조직 ictal 이벤트 생성에 그것의 다양성으로 인해 대뇌 피 질 4 AP 모델에. 이 문서에 메서드 또한 0 Mg2 + 모델을 사용 하 여 나포 유도의 다른 방법에 설명 하 고 제공 하는 장점에 대 한 자세한 개요와 다른 생성 된 epileptiform 같은 활동의 한계 급성 발작 모델입니다. 또한, 이용 하 여 상업적으로 이용 가능한 optogenetic의 마우스 긴장, 짧은 (30 ms) 빛 펄스 ictal 이벤트 저절로 발생 동일 하 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 감마 아미노 버터 산 (조미료) 신경 전달 물질의 30-100 ms 퍼프 ictal 이벤트를 동일 저절로 발생 하는 트리거를 인간의 조직에 적용할 수 있습니다. Ictal 이벤트 요청 시 급성 발작 모델에 트리거 수 발작 개시 역학 기초 및 잠재적인 안티 발작 치료를 효율적으로 평가 하는 이벤트의 정확한 순서를 관찰 하는 새로운 기능을 제공 합니다.

서론

급성 발작 모델 성공적으로 electrographic 서명 ictal 이벤트 발작을 경험 하는 개인의 뇌 파 (EEG)에의 연상을 재현할 수 있습니다. 연구원은 대리 모 알선으로 이러한 ictal 같은 이벤트 (여기 'ictal 이벤트' 라고 함)을 사용 하 여 발작 이벤트1. 임상, ictal 이벤트 발작 이벤트에 대 한 신뢰할 수 있는 프록시 이후 발작 신경 장애는 뇌에서 발생 하는 역할. 간 질 모니터링 장치, 신경과 두뇌의 epileptogenic 영역을 확인 하 고 절제2격리 ictal 이벤트 감지 시 의존 합니다. 집중 치료 단위에 의사 ictal 활동 평가 진정 환자3에서 지속 되는 발작 활동을 모니터링 합니다. 간 질 환자의 30%는 사용 가능한 약물4,5, 저항 하는 마약 및 약물 유발 발작을 포함 하는 의학 케이스의 10%는 의료 사회에 대 한 도전적인 문제 될 남아 발작을 제어 3표준 치료 응답 하지 않는. 이 미국 인구의 10%는 prospected 그들의 일생에서 한 발작 이벤트를 경험 하 고 3%는 간 질6를 개발 것으로 예상 된다, 사회에 대 한 심각한 우려를 제공 합니다.

만성 간 질 모델에서 발작을 공부 하 고 비싼, 힘 드는, 이며 종종 준비7개월 걸릴. 또한 자유롭게 이동 하는 동물에 electrophysiological 녹음을 수행 하기가 어렵습니다. 인간 임상 시험 추가 복잡 한 환자 동의 참가자 들의 배경과 도덕적이 고 윤리적인 고려 사항 관련된8에 변화에 관련 된로 서 비슷한 문제, 직면 한다. 급성 발작 모델, 다른 한편으로은 유리한 그들은 상대적으로 비용 효율적인 준비를 편리 하 고 많은 양의 연구9ictal 이벤트를 생성할 수 있기 때문에. 또한, 그래서 조건이 발작 역학과 관련 된 기본 이상 공부 하는 데 필요한 electrophysiological 녹음을 수행 하기 위한 이상적인 조직 안정 된 위치에 고정 됩니다. 그들은 생물 학적 재료 모든 고유한 요소 및 캡처할 수 있는 시 냅 스 연결 두뇌의 구성 신경 네트워크의 구성에 기반으로 하기 때문에 급성 발작 모델에 철에 (컴퓨터) 모델을 통해 유리한 유지 심지어는 가장 상세한 컴퓨터에 의해10모델. 이러한 기능을 효율적으로 잠재적인 안티 발작 치료에 대 한 검사 및 만성 간 질 모델 및 임상 시험에서 추가 조사를 위해 그들을 전진 하기 전에 예비 결과 만드는 것을 급성 발작 모델 있습니다.

일반적으로 급성 발작 모델 하이퍼 고르기 조건에 복종 된 정상 뇌 조직에서 파생 됩니다. 건강 한 뇌 조직에 임상 관련 ictal 이벤트를 유도, 그것은 두뇌 위험 상태11 에서 최적으로 기능을 이해 하는 것이 중요 여기 (E)와 (I) 억제 있는 균형된12. E의 중단-내가 균형 ictal 이벤트 침전 하이퍼 고르기 발작 상태로 이어질 수 있습니다. 따라서,이 개념 프레임 워크 내에서 두 가지 주요 전략 두뇌에서 분할 영역 (생체 외에서) 또는 (vivo에서) 모든 두뇌 준비 ictal 이벤트를 생성: 억제 ("disinhibition") 감소 또는 증가 여기 ("비-disinhibition")입니다. 그러나, ictal 이벤트는 매우 주문 하 고 이벤트를 통합 하는 신경 네트워크 활동13,14GABAergic 수의 영향을 필요로 하는 동기화. 이러한 이유로 비 disinhibition 모델은 격리 된 신경 네트워크에서 생성 ictal 이벤트에 대 한 가장 효과적인 생체 외에서 두뇌 슬라이스15, disinhibition 모델 체 외에 일반적으로 활동 급상승으로 이어질 반면 같은 interictal 처럼 급상승의 연상. 또한,이 개념적 프레임 워크 내에서 순간 동기화 이벤트를 트리거할 수 있습니다 또한 안정적으로 ictal 이벤트16. 사실, ictal 이벤트 때 위험 상태 전환 (이 하 "분기") 포인트1817 신경 시스템 적용 된 어떤 작은 섭 동에 의해 트리거될 수 있습니다. 전통적으로,이 물결은 전기 자극에 의해 유도 했다. 그러나 신경 과학, optogenetics의 최근 개발, 지금 위험 상태 전환16유도 하 더 우아한 전략을 제공 합니다.

이 문서에서 설명 하는 방법 둘 다 생체 외에서 ( 프로토콜의 1 단계) 및 연구를 위한 vivo에서 ( 프로토콜의 2 단계) 급성 발작 모델에 주문형 ictal 이벤트를 생성 하는 방법을 보여 줍니다. 그들은 포함 하는 뇌 영역, 발작 유도 방법, 연구 유형, 및 종;의 선택 그러나, 초점은 학문 종류의 다양 한에 그 다양성으로 인해 급성 4-AP 대뇌 피 질의 발작 모델의 권장된 선택에 있을 것입니다. 급성 체 외에 4 AP 발작 모델 electrophysiological 녹음에 대 한 높은-품질 두뇌 분할 영역을 준비 하는 표준 프로토콜에 기반 하 고 이미징 연구19. 이러한 프로토콜 이미 체 외에 코로나 두뇌 분할 영역 somatosensory 모터 피 질에서 마우스16,20 와 인간21수 있도록 사용 되었습니다. 수정 이러한 유형의 뇌 조각 ictal 이벤트를 생성 하는 이전 증명16 및 상세 프로토콜 아래에 설명 되어 있습니다. 급성 vivo에서 4 AP 대뇌 피 질의 발작 모델 연구22이미징에 대 한 한 craniotomy를 준비 하는 표준 프로토콜을 기반으로 합니다. 수정 없음 (유리 슬라이드) 창에서 craniotomy를 다음 설치입니다. 대신, proconvulsant 에이전트 (4-ap = 연합 뉴스) 동물 일반 마 취는 하는 동안 ictal 이벤트를 유발 하는 노출된 피 질에 몸에 붙이기도 적용 됩니다. 우리의 지식, 우리의 그룹이 급성 vivo에서 대뇌 피 질의 발작 모델 마우스16,23에서 개발을 먼저 했다. 급성 vivo에서 4 AP 대뇌 피 질의 발작 모델 성인 쥐에서 준비 청소년 조직에서 생체 외에서 의 조각 모델을 보완 하기 위해 개발 되었다. 성인 vivo에서 발작 모델 결과의 복제 2D 두뇌 슬라이스 (대 3 차원 전체-뇌의 비 생리 적 조건에 대하여 고유한 문제를 해결 하 여 슬라이스 모델에서 연구 결과 일반화 하는 데 도움이 구조)와 청소년 및 성인 조직 간의 생리 적인 차이.

온-디맨드 ictal 이벤트 개시의 메서드는 picospritzer 또는 optogenetic 전략으로 신경 전달 물질의 어느 퍼프를 사용 하 여 보여 줍니다. 우리의 지식 최선을 다 해 우리의 그룹 사용 하 여 신경 전달 물질을 통해 picospritzer16인간의 조직에 ictal 이벤트 시작 하 처음 이다. Optogenetic 전략, C57BL/6 쥐 긴장 transgenes 표현 사용 기존의 변형이입니다. Channelrhodopsin-2 (ChR2) GABAergic 수 또는 glutamatergic 피라미드 세포의 표현 ictal 이벤트 요청 시 짧은 광 펄스를 생성 하는 옵션 기능을 제공 합니다. 적합 한 optogenetic 쥐 긴장 마우스 기공을 GABA 전송 promotor (VGAT)24또는 마우스 thymus 세포 항 원 1를 사용 하 여 피라미드 세포를 사용 하 여 두 수에 ChR2을 표현 하는 상용 C57BL/6 변형 포함 promotor (Thy1)25. 블루와 피 질에 각각 GABAergic 신경 또는 glutamatergic 뉴런을 활성화 하는 기회를 제공 하는 이러한 상용 VGAT ChR2 및 Thy1 ChR2 마우스 (470 nm) 빛. 급성 발작 모델에 주문형 ictal 이벤트를 생성 하는 기능 발작 개시 역학을 연구 하 고 효율적으로 평가 하는 잠재적인 안티 발작 치료에 새로운 기회를 제공할 수 있습니다.

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프로토콜

환자와 관련 된 모든 연구는 헬싱키의 선언에 따라 대학 건강 네트워크 연구 윤리 위원회에 의해 승인 프로토콜에서 수행 되었다. 절차와 관련 된 동물 동물 관리에 캐나다 위원회 지침에 따라 되었고 Krembil 연구 연구소 동물 관리 위원회에 의해 승인.

1. 프로토콜 i: 급성 발작 모델 체 외에

  1. 해 부 솔루션 및 인공 중추의 준비
    1. Carbogenate 초순 (이 물 18.2 ㏁의 저항으로 필터링) carbogen (95% O2/5% CO2) 5 분을 돌 거품 디퓨저 (수족관 통풍 장치) 공기를 사용 하 여.
      참고: 공기 돌 carbogen 탱크의 레 귤 레이 터를 통해 표준 실리콘 튜브에 연결 수 있습니다. 공기 돌, 사용할 수 없는 경우 인감 실리콘 튜브의 끝을 종료 하 고 밖으로 거품 carbogen 가스 carbogenate 솔루션을 허용 하도록 물개에 있는 작은 구멍을 찌 르 지.
    2. 초순의 표 1 용액을 용 해 하 여 절 개 솔루션을 준비 합니다. CaCl2 그것을 분해 수 있도록 적어도 5 분 carbogenated 되어 솔루션에 추가 합니다.
      참고: 또는, 추가 CaCl2 먼저, 불포화 용액에 쉽게 녹 일 수 있다. 액체 형태로 솔루션 300-320 mOsm/L와 carbogen 포화 되 고 후 7.4의 산도가지고 있어야 합니다.
      1. 0-4 ° c.를 해 부 솔루션을 진정 하룻밤 냉장고에서 솔루션을 두고 또는 솔루션 1 시간 냉동 실에 놓고 지속적으로 온도 모니터링 합니다.
        주: 해 부 솔루션은 최대 3 박; 저장 될 수 있다 나중에 삭제 합니다.
      2. Carbogenate 사용 하기 전에 5-10 분에 대 한 해 부 솔루션.
        참고: 이상적으로, 솔루션 비 자금으로 표시 하거나 또는 사용 하기 전에 비 자금으로 전환.
    3. 초순에 표 2 (또는 표 3 인간의 실제) 용액을 용 해 하 여 설치류 인공 척수 (실제)을 준비 합니다. Carbogenate 사용까지 35 ° C에가 열 물 욕조에 그것을 동안 실제 솔루션이입니다. CaCl2 그것을 분해 수 있도록 적어도 5 분 carbogenated 되어 솔루션에 추가 합니다.
      참고: 또는, 추가 CaCl2 먼저 불포화 용액에 쉽게 녹 일 수 있다. 액체 형태로 솔루션 290-320 mOsm/L와 carbogen 포화 되 고 후 7.4의 산도가지고 있어야 합니다. 솔루션에 실험의 기간에 따라 1, 2, 또는 4 L 볼륨 여야 한다. 4 하루 종일 (8 h) 실험에 대 한 확인 합니다. 실제 여야 한다 신선한 각 하루; 1 일 이상 보관 하지 마십시오.
  2. 마우스 해 부 뇌 조직 수집 하
    참고: 인간의 조직에 대 한 다음 단계 (단계 1.3)는 vibratome와 함께 두뇌 분할 영역 만들기를 진행 합니다. 뇌 조직의 큐브 모양의 블록 (1 c m3) 프로시저 앞에서 설명한26,27을 사용 하 여 신경 외과에서 얻을 수 한다.
    1. 모든 도구와 동물 해에 필요한 자료를 수집 합니다. 동물 해 준비 하는 작업 영역을 설정 합니다.
      1. 비어 있지 않은 있도록 carbogen 탱크 (95% O2/5%CO2)를 확인 하십시오. 미만 500 psi 압력 남아의 경우 실험 전에 가스 실린더를 교체 합니다.
      2. 제조업체의 설명서에 따라 vibratome (진동 블레이드 조직 slicer) 보정. 1 m m의 절단 진폭과 0.12 m m/s의 절삭 속도를 설정 하는 vibratome를 조정 합니다.
        참고: 최적의 설정은 각 개별 진동 조직 블레이드 커터;에 대 한 다를 수 있습니다. 그러나, 일반적으로 진폭 높은 해야 하 고 절삭 속도 낮은 되어야 합니다.
      3. 실제와 뇌 조각 인큐베이션 챔버 (즉, 뇌 조각 골키퍼)와 carbogen와 거품. 35 ° c.에 설정 물 욕조에 부 화 챔버 장소
        참고: 설치류 뇌 조각 및 인간 두뇌 분할 영역에 대 한 인간의 실제 쥐 실제 사용 합니다.
    2. 어느 섹스 13 d (p13) 21 d (p21, p0은 출생의 날짜)의 나이 사이 소년 마우스를 가져옵니다.
    3. Sodium pentobarbital (체중의 55 mg/kg)의 복 주사와 마우스 anesthetize 마우스는 마 취 깊이 발가락 핀치 반사의 결핍에 의해 표시 된 대로, 일단 목을 벨 한 빠른 움직임에 마우스를 즉시 수 의사 승인 단두대 악기를 사용 합니다.
      참고: 나트륨 pentobarbital 주입 기관 지침에서 권장 하는 절차에 따라 준비 합니다.
    4. 잘린된 머리를 안정 하 고 부드럽게 시작 마우스의 눈 사이 두개골을 노출로 두 피의 전체 길이 따라 절 개를 중간에 마우스의 코를 잡으십시오. 두개골은 면도칼으로 적용 하는 압력에 의해 압축 되지 않습니다 확인 하십시오. 면도기의 가장자리의 모서리를 사용 하 여 절단된 정밀도 증가.
    5. 손가락을 사용 하 여 두개골을 노출 하는 마우스의 피의 날개 떨어져 확산. 를 사용 하 여 면도기의 가장자리의 신선한 코너 두개골;의 중간 선 따라 절 개 대뇌 피 질과 어떤 접촉을 피하기 위해 주의 지불 합니다.
    6. 마우스의 잘린된 머리를 안정화 하는 페 트리 접시에 눈 소켓으로 삽입 가시 집게 감기 (0-4 ° C)로 가득 해 부 솔루션. 머리 해 부 솔루션에 빠져들 완벽 하 게 확인 하십시오.
    7. 스프린터 집게의 두 번째 세트를 사용 하 여 부드럽게 벗 겨 마우스의 두 피, 그것을 박 리 하 여 코 뼈를 제거 하 고 두개골의 뒤로 (꼬리 쪽)를 제거 합니다.
      참고: 청소년 마우스의 코 뼈는 매우 부드럽고 쉽게 깨지지.
    8. 마이크로 주걱을 사용 하 여 시 신경, trigeminal 신경, 척수를 잘라. 그런 다음, 마이크로 주걱을 사용 하 여 부드럽게는 두개골에서 뇌를 분리. 뇌 해 부 솔루션으로 가득 페 트리 접시에 완전히 빠져들 둡니다.
  3. 대뇌 피 질의 조각 somatosensory 모터 피 질에서의 준비
    1. 감기 (0-4 ° C)의 ~ 150 mL vibratome의 버퍼 트레이 채우기 해 부 솔루션.
      참고: 필요에 따라 조각화 절차 동안 낮은 온도 유지 하는 데 필요한 때까지 냉동 실에 버퍼 트레이 유지.
    2. 마우스 또는 인스턴트 접착제 접착제를 사용 하 여 vibratome 단계 (견본 홀더/트레이)에 인간의 뇌 조직 접착제. 마우스에 대 한 (즉, 소 뇌) 두뇌의 작은 부분을 꼬리를 잘라 편평한 견본 홀더 (얼굴을 천장에 두뇌의 rostral 측면 허용)에 쉽게 붙어 있을 수 있도록.
      참고: 또는 수평 마우스 뇌 조각 준비 될 수 있다 (뇌의 복 부 측 천장 직면 한다) 견본 홀더에 뇌의 등 쪽 측을 접착제로 하 여28.
    3. 부드럽게 버퍼 트레이에 (뇌 조직)와 견본 홀더를 놓습니다. 뇌의 등 쪽 부분 vibratome의 블레이드를 직면 하고있다 확인 하십시오.
      참고: 그것은 뇌 공기에 노출 되는 시간을 최소화 하기 위해 중요 한입니다.
  4. 뇌 조직의 구분 및 수집
    1. 복 부 방향으로 등 쪽에 vibratome를 사용 하 여 450 μ m 두꺼운 조각으로 두뇌를 슬라이스. 그것은 조각화 하는 동안 두뇌 남아 견본 쟁반에 완전히 고정 된 확인 하십시오.
      1. 후 각 전구를 제거 하는 쥐의 뇌에서 첫 번째 컷을 확인 합니다. 그런 다음 할 후속 상처 somatosensory 모터 지역 (嗅와 bregma 사이 대략 중간에 위치한) 관찰 때까지.
        참고: 필요에 따라 슬라이스 얇은 (200 μ m) 조각 신체 callosum somatosensory 모터 지역에는 두뇌의 코로나 보기에 나타날 때까지 두뇌는 가까운.
    2. 넓은 구멍 전송 피 펫을 사용 하 여 코로나 조각 (450 μ m)와 추위 (0-4 ° C)를 포함 하는 페 트리 접시에 잠수함 somatosensory 모터 영역을 포함 하는 수집 해 부 솔루션.
    3. 새로운 면도날을 사용 하 고 조각에서 어떤 과잉 조직을 잘라. 쥐에서 코로나 조각에 대 한 (즉, 신체 callosum) neocortical commissure 바로 아래를 잘라 가로 수행 합니다. 톱 모션; 잘라 하지 마십시오 단순히 조직에 잎에 압력을 적용 하 고 부드럽게 조직을 세부 브러시를 사용 하 여. 코로나 조각의 움직임을 최소화 해야 합니다.
    4. 사용 순간 따뜻한 (35 ° C) 실제가 가득한 두 번째 페 트리 접시 (레이어 1-6) 피 질을 포함 하는 코로나 조각의 지 느 러 미 부분을 전송 하는 넓은 구멍 전송 피 펫 (~ 1 s). 다음, 신속 하 게 따뜻한 (35 ° C) carbogenated 실제를 포함 하는 인큐베이션 챔버 슬라이스 전송.
      참고: 실제와 페 트리 접시에 전송 목적 넓은 구멍 피 펫과 두뇌 분할 영역을 전송 하는 동안 보육 실 해 부 솔루션의 이전을 최소화 하는. 인큐베이션 챔버의 다른 뇌 조각 계속 여러 우물 조직 활용 합니다.
    5. 두뇌와 기관 지침에 따라 동물 시체의 나머지 부분을 삭제 합니다.
  5. 보육 및 유지 보수
    1. 30 분 동안 35 ° C에 외피 상공에 약간 빠져들 뇌 조각을 두십시오. 그런 다음, 물 목욕에서 인큐베이션 챔버를 제거 하 고 실내 온도 (20-25 ° C)로 돌아갈 수 있도록. 1 h electrophysiological 녹음을 수행 하기 전에 복구 두뇌 분할 영역에 대 한 기다립니다.
      주: 아래 보육 실에서 뇌 조각 수집 없습니다 기포는 확인 하십시오. 기포는 조직 손상을 공기 인터페이스. 인간의 뇌 조직의 적절 한 실제와 잘 carbogenated 보육 실에서 24 시간까지 저장할 수 있습니다 하는 동안 마우스 뇌 조각 6-8 시간, 유지할 수 있습니다.
  6. 표면 외피 층의 electrophysiological 녹음
    참고: Ictal 이벤트 extracellular 로컬 필드 가능성 (LFP) 녹음 두뇌 조각에서 관찰 된다. 뇌 조각의 LFP 관찰 하 고 인터페이스 형식 챔버29 또는 침수 다중 전극 배열 (MEA) 시스템16기록 수 있습니다. 절차는 앞에서 설명한16 되었으며 추가 세부 정보는 아래에서 설명 합니다.
    1. 넓은 구멍 전송 피 펫 또는 세부 브러시 사용 하 여 치과 족집게를 사용 하는 장소에서 개최 되는 약간 큰 미리 잘라 렌즈 종이에 두뇌 슬라이스를 이동. 녹음 실에는 렌즈 종이 (뇌 조각에 휴식 하 고)를 전송 하 고 하프 화면 위치에 그것을 확보.
    2. 실행된 따뜻한 (35 ° C), carbogenated (~ 1 물방울/s) 3 mL/min의 속도로 뇌 조각을 통해 녹음 챔버를 통해 실제 perfusate. 디지털 온도계를 사용 하 여 녹음 실 한지 33-36 ° c.
    3. 당겨 유리 전극 (1.5 m m의 외부 직경)와 붕 규 산 유리 배관에서 1-3 m ω의 임피던스를 끌어당기는 사람을 사용 하 여. 백필 실제와 유리 전극 (~ 10 µ L) 해밀턴 주사기를 사용 하 여. 팁 손상 되 면 전극을 즉시 삭제 합니다.
      참고: Bleach 실버 와이어 (5 분) 그리고 녹음 시 잡음과 드리프트를 최소화 하기 위해 실제 다시 채워진 유리 전극에 빠져들 수 실버 와이어의 최소한의 부분 (즉, 팁) 허용. 해밀턴 주사기 필요한 경우 유리 전극에서 어떤 과잉 실제를 제거 합니다.
    4. 사용 20 X 스테레오 현미경 정확 하 게 가이드 녹음 유리 전극은 표면에 대뇌 피 질의 레이어 (2/3)를 사용 하 여 수동 조작. 기록/보기 뇌 조각의 전기 활동 표준 소프트웨어와 컴퓨터에.
      참고: 실행 가능한 (고품질) 뇌 조각 적용된 전기 자극 (100 µs, 30-300 µ A) 또는 광 펄스 (30 ms, 10 mW/m m2) optogenetic 조직에 대 한 응답으로 강력한 갖는 잠재력을 전시할 것 이다.
  7. 발작 같은 활동의 유도
    1. 실제 뇌 조각 이상 포함 하는 100 µ M 4-aminopyrimidine (4-AP) perfuse 4-4-AP 100 µ M와 실제 perfusate를 달성 하는 실제의 100 mL를 100 µ L 100 m m 4 AP 재고 솔루션의 추가 100 m m 4-AP.의 재고 솔루션으로 만들기 위해 물 8.5 mL에 AP의 80 mg을 디졸브.
      참고: 또는 사용 0 Mg2 + 실제 (표 4), 포함 된 없음 추가 Mg2 +, 수정된 실제 솔루션 perfuse 뇌 조각에. 인간의 조직에 대 한 0 Mg2 + 인간의 실제 (표 5) 100 µ M 4-ap 통신의 결합을 사용 하 여 최적의 결과 달성 하기 위해. 나타나는 ictal 이벤트에 대 한 평균 시간은 15 분; 그러나, 그것은 일부 뇌 조각에 대 한 최대 40 분까지 걸릴 수 있습니다.
  8. 주문형 발작 세대: optogenetic 마우스에 대 한 optogenetic 전략
    1. 파란색의 개요 (30 ms) 펄스를 적용 (470 nm) 빛 (최소 1 mW/m m2 출력 강도) ictal 이벤트 시작. 수동 조작 기를 사용 하 여 녹화 영역 바로 위에 1000 µ m 코어 직경 광섬유 (0.39 없음) 위치.
      참고: 설정 ictal 이벤트 발생의 원하는 속도 맞게 사진 자극의 속도 (즉, 1 펄스 마다 50 s). 그러나, 속도 ictal 이벤트 발생 기본 속도에서 지나치게 과장 될 수 없다.
  9. 주문형 발작 세대: 인간의 조직에 대 한 비 optogenetic 전략
    1. 되도록 표면 레이어는 업스트림, 그리고 깊은 층 녹음 챔버를 통해 perfusate의 흐름에 다운스트림 두뇌 슬라이스를 놓습니다.
    2. 작은 개통을 만들려고 섬세 한 작업와이 퍼와 함께 끝을 부드럽게 터치를 유리 전극 LFP 녹음에 대 한 사용 (같은 종류)를 당기고. 백필 100mm GABA (물에 녹아 있는)의 25 µ L와 전극에는 picospritzer. 또는, 백필 200 µ M 조미료 (물에 녹는)와 전극.
      참고: picospritzer (~ 50 µ L)에서 부풀어 되 고 볼륨을 추정, 테스트 퍼프 플라스틱 플레이트 (선호 gridded)에 적용 됩니다. 다음, 테스트 퍼프와 비교에 대 한 피 펫으로 알려진된 볼륨 (즉, 10 µ L, 20 µ L, 50 µ L, 또는 100 µ L)의 방울을 적용 합니다.
    3. Ictal 이벤트를 시작 하는 picospritzer (30-100 ms에 대 한 10-20 psi)와 인간의 조직에 신경 전달 물질 (GABA 또는 글루타민 산 염)의 퍼프를 적용. 표면 층에 ictal 이벤트를 생성 하는 뇌 조직의 깊은 레이어에 (5) 100 mM GABA의 단일 퍼프를 적용 (2/3). 또는 이벤트를 생성 하 ictal 표면 층에서 표면 층에 직접 200 µ M 조미료의 단일 퍼프를 적용 됩니다.
      참고: ictal 이벤트 발생의 원하는 속도 맞게 퍼프는 picospritzer의 속도 설정 (즉, 1 펄스 마다 50 s). 그러나, 속도 ictal 이벤트 발생 기본 속도에서 지나치게 과장 될 수 없다.

2. 프로토콜 II: 급성 vivo에서 발작 모델

  1. 수술 준비와 수술
    1. 어느 섹스 성인 마우스를 (p35-p60)를 가져옵니다.
    2. 깊이 anesthetize 마우스 마 취 제 (95 mg/kg)와 Xylazine (5 mg/kg). 마우스 진정 되도록 발가락 핀치 반사 테스트를 수행 합니다. 또는, isoflurane 유도, 수술에 대 한 1.5-2% (4%)을 사용 하 여 마우스를 anesthetize.
      참고: 마 취약의 선택 발작 활동30,31영향을 줄 수 있습니다.
    3. 귀 바의 머리를 보호 stereotaxic 프레임에 마우스를 탑재 합니다. 수술 하는 동안 마우스 아래 온수 패드를 놓습니다.
    4. 두 피를 폭로 하는 설치류 트리머를 사용 하 여 마우스의 머리의 면도. 과도 한 출혈이 나 통증을 피하기 위해과에 lidocaine의 0.3 mL와 25 G 5/8 바늘에서을 삽입할. 실험 기간 동안 밖으로 건조에서 그들을 방지 하기 위해 마우스의 눈에 눈 연 고를 적용 합니다.
    5. 꼬 집 고 들어 서 마우스의 두 피에는 반사는 사라 졌 어 요 경우 평가의 중심. 그 후, 두개골의 람다 지역 bregma 노출 잘라 가로 수행 합니다. 부드럽게 건조 표면을 만들 면봉으로 두개골의 전체 노출된 영역을 긁어.
    6. Somatosensory 피 폭로 좌표 2.0 m m-2.0 m m와 lateromedial rostrocaudal에서 직경에서 4mm의 craniotomy를 수행 합니다. 영구 마커를 사용 하 여 원형 (4 mm에 직경)를 가진 위치를 표시 합니다. 와 함께 공 압 치과 craniotomy 뼈의 나머지 계층까지 주위 드릴에는 쉽게 다운할 때 방법을 제공 합니다. 뼈의 레이어에 염 가시 집게와는 craniotomy를 제거 하기 전에 적용 됩니다. 그 후, 노출 된 지역에 따뜻한 식 염 수 솔루션 적용.
  2. 녹음 방법 및 발작의 화학 유도
    1. 당겨 유리 전극 (1.5 m m의 외부 직경)와 붕 규 산 유리 배관에서 1-3 m ω의 임피던스를 끌어당기는 사람을 사용 하 여. 백필 실제 또는 식 염 수 사용 하는 해밀턴의 ~ 10 µ L와 유리 전극 주사기. 팁 손상 되 면 전극을 즉시 삭제 합니다.
      참고: Bleach 실버 와이어 (5 분) 그리고 녹음 시 잡음과 드리프트를 최소화 하기 위해 실제 다시 채워진 유리 전극에 빠져들 수 실버 와이어의 최소한의 부분 (즉, 팁) 허용. 해밀턴 주사기 필요한 경우 유리 전극에서 어떤 과잉 실제를 제거 합니다.
    2. 수동 조작 기를 사용 하 여 유리 전극은 표면에 대뇌 피 질의 안내 somatosensory 모터 지역에 레이어 (2/3). 기록/보기 뇌 조각의 전기 활동 표준 소프트웨어와 컴퓨터에.
      참고: 레이어 2/3는 약 0.3 m m32의 표면 깊은 곳에서.
    3. 몸에 붙이기도 적용 ~0.5 mL 1.5 m m 4 AP는 마우스의 노출된 피에 염 분 주사기까지 완전히에서 craniotomy를 다루고. 4-1.5 m m 4 AP 염 분의 재고 솔루션 isotonic 식 염 수 100 mL에 AP의 14 mg을 디졸브.
      참고: 실험 시작 하기 전에 4 AP 염 분을 준비 합니다. 평균, ictal 이벤트 국 소 응용 프로그램 후 15-30 분 나타납니다.
  3. Optogenetic 마우스에 발작의 온-디맨드 세대
    1. 파란색의 개요 (30 ms) 펄스를 적용 (470 nm) 빛 (최소 10 mW/m m2 출력 강도) ictal 이벤트 시작. 수동 조작 기를 사용 하 여 녹화 영역 바로 위에 1000 µ m 코어 직경 광섬유 (0.39 없음) 위치.
      참고: 설정 ictal 이벤트 발생의 원하는 속도 맞게 사진 자극의 속도 (즉, 1 펄스 마다 300 s). 그러나, 속도 ictal 이벤트 발생 기본 속도에서 지나치게 과장 될 수 없다.

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결과

100 µ M 4-AP의 좋은-품질 (손상된) 450 µ m 크기의 대뇌 피 질의 뇌 조각 하는 청소년 VGAT ChR2 안정적으로 유도 된 마우스 재발 ictal 이벤트에서 (> 5 s) 15 분 (1Ai 그림) 내에서 응용 프로그램. 100 µ M 4-AP의 가난한 품질의 조각에 응용 프로그램 이벤트를 파열 또는 활동 (그림 1Aii) 급상승 귀착되는. 평균, 각 해 부 쥐의 뇌에서 조각의 40%는 성공적으로 ictal 이벤트 생성. 또한, 해 부 쥐의 83% (25/30) ictal 이벤트를 성공적으로 생성 된 하나 이상의 뇌 조각 귀착되는. 자연 발생으로 뇌 조각 ictal 이벤트 안정적으로 형태 (그림 1Aiii 및 1Aiv)에 동일 ictal 이벤트 트리거 뇌 조각에...

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토론

뇌 조각 proconvulsant 약물 또는 신경 네트워크의 흥분 성 증가 ictal 이벤트 (electrographic 발작 같은 이벤트)의 강 수를 홍보 하는 변경 된 실제 perfusate와 함께 처리 됩니다. 마우스 모터 somatosensory 영역의 기본 코로나 조각 있어야 대상 피 질, 지역 2 (CG), 그러나 retrosplenial 지역 (RS); 하지 이 해 부 마커 ictal 이벤트 유도 적합은 코로나 조각의 범위를 식별할. 두 개의 반구는 거의 동일 (비슷한 실험 단위)로 마우스 조직에 대 한 선택적 수정 뇌 조각의 두 반구 일치 쌍 실험 디자인, 반으로 잘라입니다. Ictal 이벤트는 신경 네트워크 현상 때문에 준비할 때 ictal 이벤트를 생성 하는 뇌 조각, 그것 신경 네트워크 및 그것의 시 냅 스 연결의 무결성을 유지 하는 것이 필수적입니다. 조각 품질에 대 한 중요 한 프로토콜의 1 단계에서 3 포인트는 1) 조각화 절차, 2) 외피, 및 3) 산소. 첫째, 조각화 절차는 속도 기술 사이의 균형을...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 캐나다 연구소의 건강 연구 (피터 L. Carlen을 하도록 A. Valiante 119603 청소), 온타리오 뇌 연구소 (하 하도록 A. Valiante), 및 Mightex 학생 연구 그랜트 (마이클 장)에 의해 지원 되었다. 우리는 리암 긴 비디오 원고 촬영에 그의 원조에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리는 컴파일 수치와 테이블이이 원고에 있는 그들의 원조에 대 한 파리 Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran, 및 Shadini Dematagoda를 인정 하 고 싶습니다. 그림 1A, 3A, 4A, 6A 는 장 외 에서 출판 된 데이터에서 만든 모든 원래의 수치 16.

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재료

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펜토바르비탈나트륨 N/A해당 없음 토론토 웨스턴 병원 공급업체를 통해 구매
1mm 주사기해당없음 해당 없음UT Med Store를 통해 구매
25G 5/8" 멸균 바늘해당 없음 해당 없음UT Med Store를 통해 구매
단일면 면도날(2x)해당 없음해당 없음UT Med Store
를 통해 구매인스턴트 접착제해당해당 사항 없음UT Med Store를 통해 구매
렌즈 용지해당 없음해당 사항 없음UT Med Store를 통해 구매
유리 페트리 접시 (2x)해당 없음해당 없음UT Med Store를 통해 구매
파편 집게 (2x)해당 없음해당 없음UT Med Store를 통해 구매
PVC 핸들 마이크로 주걱해당 없음없음UT Med를 통해 구매 Store
끝이 평평한 마이크로 스푼N/A없음UT Med Store를 통해 구매
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