초파리 애벌레의 열 환경 설정을 결정 하는 온도 분석 결과

요약

여기, 우리는 연속 열 그라디언트를 사용 하 여 초파리 애벌레의 기본 환경 온도 결정 하는 프로토콜 제시.

초록

많은 동물, 과일 파리, 초파리 melanogaster를 포함 하 여 차별 분 차이 환경 온도를 선호 그들의 열 조를 찾아 그들을 가능 하 게 할 수 있다. 애벌레의 온도 환경 정의 된 선형 범위를 정의 하려면 우리는 온도 기울기를 사용 하 여 분석 결과 개발 했다. 단일 지향성 그라디언트를 설정 하려면 두 개의 알루미늄 블록 독립 물 탕, 각각의 개별 블록의 온도 제어에 연결 됩니다. 해당 하위 및 상위 제한을 설정 하는 두 개의 블록. 온도 기울기는 접시에 걸쳐 그들 사이의 거리는 두 물 제어 블록 위에 agarose 코팅 알루미늄 플레이트를 삽입 하 여 설정 됩니다. 끝 물 블록 위에 설정 된 알루미늄 플레이트의 최소 및 최대 온도 정의 하 고 지역 사이 선형 온도 기울기를 형성 하는 두 개의 블록. 그라데이션 분석 결과 다른 연령대의 애벌레에 적용할 수 있는 고 고기, 인코딩 TRP 채널 및 opsins, 온도 차별에 필요한 유전자에 영향을 미치는 돌연변이 등을 전시 하는 돌연변이 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다.

서론

Thermotaxis는 모바일 동물 선택 가장 유리한 조건^1,2,3환경 하에 고용 됩니다. 지나치게 뜨겁거나 차가운 기후 인 경우이 문제는 생존을 위해 생명 이다. 또한, 많은 동물 편안한 범위에서 온도에 아주 작은 차이에 민감한 고 이상적인 온도 환경. 이 같은 환경과 그들의 체온을 equilibrate 과일 파리 poikilothermic 유기 체에 대 한 특정 중요성 이다. 애벌레 thermotaxis 모니터링 분석 수단이 식별, Drosophila 일시적인 수용 체 잠재력 (TRP) 채널^4,,56, 같은 분자 센서의 역할을 명확히 rhodopsins^7,8와 ionotropic 수용 체 수용 체 (국세청)⁹, 다른 온도 범위와 온도 감도이 동물을 부여.

양방향 선택 테스트 애벌레^6,7열 기본을 공부 하는 한 가지 방법은 제공 합니다. 분석 결과 수반 두 가지 온도 영역을 설정 하 고 다른 한쪽을 선택 하는 동물을 수 있습니다. 양방향 선택 테스트에서 결과 강력 하 고, 두 가지 옵션 사이의 온도 차이가 큰 경우 특히 수 있습니다. 또한, 각 분석 결과 두 그룹을 tabulating 포함, 데이터는 간단한 기본 색인으로 표현할 수 있습니다. 편리 하 고 양방향 선택 분석 실험의 단순 유전 스크린 의무가 있습니다. 그러나, 주요 한계는 많은 실험은 야생-타입 또는 돌연변이 동물의 원하는 온도 설정 하는 데 필요한입니다.

그라데이션 분석 결과 단일 분석 결과⁸원하는 온도 설정할 기회를 제공 합니다. 연속 범위의 온도 직면할 때 또한, 양방향 선택 테스트와는 달리 그것은 동물의 그룹의 분포의 평가 허용. 한 그라데이션 분석 결과 페 트리 접시를 사용 하 여 단일 동물 이며 개별 동물¹⁰의 상세한 동작을 특성화 하는 데 적합 합니다. 그러나, 접시 라운드 이기 때문에, 온도 영역의 크기 변화 하 고 중심 으로부터 거리에 따라 점차적으로 작은. 따라서,이 설정 온도 선택의 동물의 인구를 모니터링에 이상적입니다.

애벌레의 그룹의 온도 선호를 평가 하기 위해 적합 한 연속 열 그라데이션 기구 직사각형 경기장을 고용 하 고 여기 설명. 기구는 생성 하 고 조립 하기 쉽습니다. 또한, 그라데이션, 선형 이며 유연 하 고, 42 ° c에 10 ° C에서 큰 온도 범위 동안 thermotaxis를 평가 하는 데 사용할 수 있습니다. 분석 결과 신속 하 고 간단 하 게 수행 하 고 재현 가능한 데이터를 생성 합니다. 애벌레의 선호 온도 보고, 뿐만 아니라 그것은 하나의 실험에서 전체 선형 범위 동물의 인구의 환경 설정을 보여준다. 이러한 장점으로 인해 thermotaxis에 필요한 유전자를 식별 하는 데 탁월한 선택 이다.

프로토콜

1. 장비 제조 및 조립 장치 그라데이션 분석 실험

1. 단일 방향 그라데이션 분석 결과 대 한 알루미늄 분석 결과 번호판 조작.
   1. 트림 및 밴드 톱을 사용 하 여 알루미늄의 한 조각에서 각 알루미늄 분석 결과 플레이트 (그림 1A)를 갈기 고 다음 크기와 수직 밀 날카로운: 외부 크기 140 x 100 x 9 mm 이며 내부 크기는 130 x 90 x 8 mm (그림 1B). 애벌레를 시각화 하 고 녹 방지를 쉽게 검은 페인트와 각 분석 결과 판의 내부 anodize
      참고: 단일 방향 그라데이션에 대 한 알루미늄 분석 결과 접시의 제조 기계 공장에 의해 이루어집니다. 양극 상업적인 공급 업체에 의해 수행 됩니다.
   2. 13 경계 설정, 10 mm 영구 마커를 사용 하 여 구분 된 각 분석 결과 접시의 위쪽과 아래쪽 테두리를 표시 합니다. 첫 번째 및 마지막 경계 설정 내부 가장자리에서 5mm 분석 결과 플레이트 (그림 1A, B)의 장소.
2. 판금이 위를 사용 하 여 다음 치수와 알루미늄 플레이트 잘라 알루미늄 분석 결과 플레이트 양방향 그라데이션에 대 한 조작, 하: 250 x 220 x 2 mm. Anodize 검은 페인트와 분석 결과 접시.
   참고: 양방향 그라디언트에 대 한 알루미늄 분석 결과 접시의 제조 기계 공장에 의해 수행 됩니다. 양극 상업적인 공급 업체에 의해 이루어집니다.
3. 알루미늄 블록을 조작.
   참고: 두 개의 블록은 단일 방향 그라데이션에 대 한 고 3 블록 양방향 그라데이션에 필요한.
   1. 알루미늄 블록 (그림 1C) 밴드 톱 (50 x 255 x 14mm의 크기)를 사용 하 여 알루미늄의 한 조각 잘라 (그림 1 c, D).
   2. 드릴 한쪽 (그림 1D)에 열린 끝에 수직 밀 및 스레드 홈을 사용 하 여 블록 (7 mm에 직경) 내부 물 채널. 볼트와 U 자 모양 물 채널 (그림 1 c, D)를 실 물개 테이프와 홈된 구멍을 닫습니다.
      참고: 알루미늄 분석 결과 블록의 제조 기계 공장에 의해 수행 됩니다.
   3. 스크류 스레드 알루미늄 블록 (그림 1D)에 커넥터를 해결 하 고 실 물개 테이프 한쪽 끝에. 실리콘 튜브 (1/4"ID 벽 1/16" x 3/8"OD x)에 여러 가시와 다른 쪽 끝을 맞습니다.
4. 2 개의 냉장/온수 순환 목욕을 가져옵니다.
5. 그라데이션 분석 결과 시스템에 대 한 온도 제어 블록을 조립.
   1. 단일 방향 그라데이션에 대 한 연결 두 알루미늄 블록의 각 별도 물 욕조에는 각 블록의 온도 독립적인 물 순환 시스템 (그림 2A)에 의해 제어 됩니다. 실리콘 튜브 (ID 1/4"x 3/8" x 벽 1/16"OD)를 사용 하 여 커넥터 알루미늄 블록 (그림 2A)의 안쪽에 물 목욕의 콘센트를 연결 하. 또한, 물 목욕의 입구를 알루미늄 블록에 외부 커넥터 연결 튜브를 사용 합니다.
   2. 양방향 그라데이션에 대 한 왼쪽 아래 세 블록의 2 개 및 오른쪽 접시의 놓고 튜브 (그림 2B)와 같은 물 목욕에 그들을 연결 합니다. 3 알루미늄 블록을 두 번째 물 목욕 플레이트 (그림 2B)의 중앙 아래에 연결 합니다.
      참고:이 장치 및 분석 결과 애벌레 한 가장자리 또는 단일 방향 그라데이션의 다른 영역에서 축적 하는 경우만 필요 됩니다. 그렇다면, 그것은 가장자리 효과 여부를 평가 하는 것이 중요입니다. 이 가능성을 테스트 하기 위해 양방향 그라데이션이 있는 단일 지향성 그라데이션 (예: 18 ° C)를 사용 하 여 애벌레 선호 가장자리 영역 온도 양방향 그라데이션 (그림 3E 접시 중간 온도 설정 , F).

2. 애벌레 동기화

1. 파리를 달걀 누워 하는 데 사용할 키 우다.
   1. 혼합 효 모 립 고 붙여 누 룩을 만들기 위해 유 봉과 증류수. 철저 하 게 갈기 고 붙여넣기의 일관성은 땅콩 버터를 유사한 때까지 저 어. 지나치게 건조 한 풀을, 신선한 튜브에 파리를 전송할 때 떠나 또는 젖은 파리 트랩 수 붙여넣기 하지 마십시오.
   2. 사용 하는 유 봉, 음식의 표면 바로 위에 표준 초파리 튜브의 내부 벽에 가까운 누 룩 붙여넣기를 추가 합니다.
   3. 수 12-35 여성 및 CO₂ 패드 (하지만 더 이상 10) 절반 만큼 남성에 게 고 각 효 모 포함 하는 붙여넣기 유리병에 암컷과 수 컷을 추가.
   4. 비행을 유지 효 모-붙여 촉촉한, 음식 파리 피드 동안 결합이 튜브 100 튜브 포함 20 오픈 튜브와 증류수만 보유 하 고 있는 트레이. 투명 한 플라스틱 가방에 트레이 놓고 밀봉 합니다.
   5. 있도록 암컷 적절 하 게, 많은 계란을 낳 기 위해 그들을 함으로써 영양은 48 h에 대 한 25 ° C 배양 기에서 트레이 품 어.
2. 달걀 누워에 대 한 튜브를 설정 합니다.
   1. 이상 그들을 활용 하 여 달걀을 수집에 대 한 새로운 음식 튜브로 영양된 파리를 전송. CO_2, 다음 짧은 시간 창에 적은 계란을 낳 기 위해 파리를 발생할 수 있습니다를 사용 하지 마십시오.
      참고: 표준 초파리 음식 튜브 계란 컬렉션에 대 한 효 모 반죽 없이 사용 됩니다.
   2. 파리 모든 계란은 상대적으로 좁은 시간 창을 동안 수집 되도록 25 ℃에서 3 h에 대 한 알 수 있습니다.
      참고:이 애벌레 같은 발달 단계에서 동기화 할 수 있게 된다.
   3. 물 튜브를 포함 하는 쟁반에서 계란을 포함 하는 튜브를 배치 하 고 가방을 조입니다. 12 h 빛: 12에서 25 ° C에서 품 어 h 어두운 주기.
   4. 지정된 된 수 시간 후 원하는 계란 애벌레 단계에 따라서 (AEL) 누워의 애벌레를 나이.
      주: 표 1 은 AEL 시간과 비행 재고에 따라 달라 집니다, 애벌레 단계 사이 관계의 추정 식품, 사용 온도 등 AEL과 발달 단계 사이 정확한 관계 해야 양육 실제 기준 입 후크 및 spiracles¹¹의 형태를 사용 하 여 각 조사에 의해 확인.

3. 온도 기울기 설정

1. 단일 방향 그라데이션 준비
   1. 분석 실험 동안 습 한 주위 환경을 만들려면, 젖은 종이 타 올, 10 cm (그림 2A)으로 구분 된 2 개의 물 목욕에 연결 된 두 개의 알루미늄 블록을 배치 합니다.
   2. 2 개의 물 목욕 equilibrate 알루미늄 블록의 온도 대 한 충분 한 시간을 허용 하도록 시험 시작 전에 ~ 2 h를 켭니다.
      참고: 원하는 선형 온도 기울기를 달성 하는 데 필요한 각 물 목욕의 온도 결정 하는 모의 실험을 수행 하기 위해 추천 된다. 물 목욕을 설정 하려면 몇 가지 일반적인 온도 쌍 표 2에 나열 됩니다. 그러나, 표면 온도 주위 온도 의해 영향을 받는 note. 또한 영향을 튜브의 길이 만큼 온도 튜브에 냉각 하 고. 우리의 설치에서 튜브의 길이 1.5 m입니다.
   3. 전자 렌지 100 mL 500 mL 넓은 입 병 라운드에서 고 출력 설정 1 %agarose 25 mL를 붓고/레벨 벤치탑에 접시를 시험. (그림 2A) 동시에 알루미늄 블록에 배치할 수 있는 두 분석 결과 접시를 준비 합니다.
   4. agarose (10-20 분) 경화는, 후 부드럽게 각 agarose로 표면을 문질러 표준 부엌 스폰지 또는 약간 거친 agarose 표면 수 있도록 멜 라 민 스폰지는 agarose 젤에 물 분사 때 부드러운 얇은 물 막 생성 됩니다, 그리고 아무 물방울 형성 될 것 이다.
   5. 분석 결과 포장해 점점에서 번호판을 방지 하기 위해 수행 될 준비가 될 때까지 완전히 증류수와 컨테이너에 접시를 잠수함.
2. (옵션) 양방향 그라데이션 준비
   1. 분석 하는 동안 습 한 주위 환경을 만들려면, 젖은 종이 수건에 3 알루미늄 블록 8 cm 떨어져 (그림 2B)을 배치 합니다.
   2. 2 개의 물 목욕 equilibrate 알루미늄 블록의 온도 대 한 충분 한 시간을 허용 하도록 시험 시작 전에 ~ 2 h를 켭니다.
      참고: 양방향 그라데이션에 대 한 각 물 목욕의 온도 결정 하는 모의 실험을 수행 하기 위해 추천 된다. 물 목욕을 설정 하려면 몇 가지 일반적인 온도 쌍 표 3에 나열 됩니다. 그러나, 표면 온도 주위 온도 의해 영향을 받는 note. 또한 영향을 튜브의 길이 만큼 온도 튜브에 냉각 하 고. 우리의 설치에서 튜브의 길이 1.5 m입니다.
   3. agarose는 접시 밖으로 흘리 고 하지 않도록 하려면 라벨 테이프 10 m m 높이 벽 (그림 2B)를 형성 하는 알루미늄 플레이트의 가장자리를 래핑하십시오.
   4. 고 전력 설정, 전자 레인지 200 mL 500 mL에 1 %agarose 사용 하 여 라운드 넓은 입 병 하 고 120 mL는 시험 접시에 부 어.
   5. agarose (~ 30 분) 경화는, 후 각 agarose 표면 표준 부엌 스폰지 또는 만들 agarose 표면 약간 굵고 부드러운 얇은 물 막 만들어집니다 때 agarose 젤에 물 분사, 멜 라 민 스폰지 없고 부드럽게 문질러 물 방울 형태입니다.
   6. 분석 결과 밖으로 건조에서 그들을 방지 하기 위해 수행 될 준비가 될 때까지 완전히 분석 결과 접시 증류수와 컨테이너에 잠수함.
3. 단일 방향 그라데이션 설정
   1. 시 약 및 그라데이션 시험 장치 ( 재료의 표참조) 옆 벤치에 항목을 준비 합니다.
   2. 효율적인 온도 전송, 홍보 분석 결과 석판 및 알루미늄 블록 사이 어떤 간격 든 지 블록 및 플레이트 사이의 인터페이스에서 물을 분사 하 여 작성.
   3. 장갑을 사용 하 여, 물 컨테이너에서 분석 결과 플레이트를 제거 합니다. 물 agarose 젤과 접시 사이 침공과 표면에 범프 양식에 발생, P1000 micropipette와 물을 제거 합니다.
   4. 알루미늄 블록 (그림 2A, C)의 가장자리를 일치 하는 정확 하 게 2 cm 가장자리에서 경계 설정 되도록 알루미늄 블록 분석 결과 접시를 놓습니다.
   5. (Agarose 표면을 덮고 얇은 물 막이 충분 한) 격판덮개의 표면에 물을 스프레이 agarose 젤 밖으로 건조 하지 않도록. 물 막 이며 지 연속 물방울의 무료 애벌레 물방울에 갇혀 얻을 수 있기 때문에 다는 것을 확인 하십시오.
   6. 물이 증발을 줄이기 위해 골 판지 상자와 그라데이션 시스템을 커버 하 고 젤 표면의 온도 안정화 하는 데 도움이. Equilibrate 온도가 5-10 분을 기다립니다.
   7. (그림 2C) 접시에 12 포인트에서 표면 온도 확인 하십시오. 영역 내에서 변화 여부 설정에 각 영역 내에서 두 개의 측정을 가져가 라. 두 관광 명소에 온도 ± 0.2 ° C 원하는 온도 내에서 다는 것을 확인 하십시오.
      참고: 영역 내의 변화는 일반적으로 알루미늄 블록의 가장자리에 두 개의 관광 명소의 정확한 거리는 동일 하기 때문에 발생 합니다. 알루미늄 블록 가장자리에서 2cm를 정확 하 게는 경계 설정 알루미늄 블록의 가장자리를 일치 하는지 확인을 접시의 위치를 조정 합니다.
   8. 측정된 온도 기울기 원하는 그라데이션에서 일탈, 증가 또는 감소 물 목욕 온도 설정 고 물 bath(s)의 온도 stabilize(s) 후 표면 온도 다시.
   9. 골 판지 상자와 그라데이션 시스템 분석 결과 시작까지 커버.
4. (옵션) 양방향 그라데이션 설정
   1. 시 약 및 그라데이션 시험 장치 ( 재료의 표참조) 옆 벤치에 항목을 준비 합니다.
   2. 스프레이 물 표면 사이 간격을 작성 하 여 분석 결과 번호판 알루미늄 블록에서 효율적인 온도 전송 홍보 3 알루미늄 블록의 표면에.
   3. 물 컨테이너에서 신중 하 게 분석 결과 플레이트를 제거 하 고 알루미늄 블록에 놓습니다. Agarose 젤과 표면에 범프 양식에 발생할 수 있습니다, 격판덮개 사이 물 침공 P1000 micropipette와 물을 제거 합니다.
   4. 가장자리에서 첫 번째 및 마지막 영역의 중간 정확 하 게 일치 하는 두 측면 알루미늄 블록 (그림 2B, D)의 가장자리는 알루미늄 블록에 분석 결과 접시를 놓습니다.
   5. (Agarose 표면을 덮고 얇은 물 막이 충분 한) 격판덮개의 표면에 물을 스프레이 agarose 젤 밖으로 건조 하지 않도록. 물 막 이며 지 연속 물방울, 무료 애벌레 물방울에 갇혀 얻을 수 있기 때문에 다는 것을 확인 하십시오.
   6. 물이 증발을 줄이기 위해 골 판지 상자와 그라데이션 시스템을 커버 하 고 젤 표면의 온도 안정화 하는 데 도움이. Equilibrate 온도가 5-10 분을 기다립니다.
   7. 각 10 영역 (그림 2D)의 중간 선 따라 두 지점에서 표면 온도 확인 하십시오. 영역 내에서 변화 여부 설정에 각 영역 내에서 두 개의 측정을 가져가 라. 두 관광 명소에 온도 ± 0.2 ° C 원하는 온도 내에서 다는 것을 확인 하십시오.
      참고: 영역 내의 변화는 일반적으로 알루미늄 블록의 가장자리에 두 개의 관광 명소의 정확한 거리는 동일 하기 때문에 발생 합니다. 알루미늄 블록 각 가장자리에 가장 가까운 첫 번째 및 마지막 영역의 중간 두 측면 알루미늄 블록의 가장자리를 정확 하 게 일치 하는지 확인을 접시의 위치를 조정 합니다.
   8. 측정된 온도 기울기 원하는 그라데이션에서 성적이 상자, 물 목욕 온도 설정 조정 하 고 물 bath(s)의 온도 stabilize(s) 후 표면 온도 다시.
   9. 분석 결과의 시작까지 판지 상자 블록을 커버 합니다.

4. 애벌레 수집 및 세척

1. 격리 깨끗 한 애벌레 (옵션 1)
   1. 50 mL 테스트 튜브에 40 mL 18% 자당 해결책을 추가 합니다. 18% 자당 해결책에 scoopula와 전송 음식 vial(s)에서 모든 애벌레 특 종.
   2. 식품에서 애벌레를 분리 하는 scoopula를 사용 하 여 부드럽게 하지만 철저 하 게 혼합. 튜브의 꼭대기 층에 애벌레 부동까지 30-60 s를 기다립니다. 또 다른 50 mL 튜브에 애벌레 (~ 10 mL)를 포함 하는 상위 계층을 부 어 하 고 신선한 18% 자당 해결책으로 튜브를 입력. 30-60 s에 대 한 때까지 기다릴 상위 계층에 애벌레 float 다시.
      참고: 큰 음식 입자 때로는 애벌레 함께 전송 및 제거 되지 않습니다 경우 애벌레 thermotaxis에 영향을 미칠 수 있습니다. 큰 음식 입자는 상위 계층에 남아 있으면 반복 단계 4.1.1-4.1.2, 또는 수동으로 scoopula를 사용 하 여 그들을 제거.
   3. 다른 두 50 mL 튜브에 애벌레 (~ 10 mL)의 상위 계층을 전송 하 고 애벌레는 신속 하 게 물에 싱크 있도록 자당 농도 줄이기 위해 증류수와 두 개의 튜브를 입력 합니다. 애벌레 맨 아래에 침 몰 될 때까지 30-60 s를 기다립니다. 애벌레가 익사 하지 않도록 가능한 한 빨리이 고 다음 단계를 수행 합니다.
   4. 부드럽게 튜브를 기울이기로 가능한 물 만큼 삭제 합니다. 나머지 물으로 애벌레를 털어 여 한 튜브에 애벌레를 결합 하 고 증류수와 튜브를 작성.
   5. 모든 애벌레 가라앉 고 부드럽게 튜브를 기울이기로 가능한 많은 물을 제거 될 때까지 30-60 s를 기다립니다. 2-4 시간을 완전히 제거 자당 모든 보이는 음식이 세척 단계를 반복 합니다.
   6. 가능한 물을 많이 삭제 하 고 decanting 여 빈 35 mm 페 트리 접시에 애벌레를 전송. 튜브 물 스프레이를 사용 하는 작은 페인트 브러시 하 게 전송 애벌레.
   7. P1000 micropipette를 사용 하 여 배양 접시에서 초과 물을 제거 합니다. 애벌레의 탈수를 방지 하기 위해 물 ~0.5 mL를 남겨 주세요.
   8. 애벌레가 탈출 하지 않도록 접시에 뚜껑을 놓습니다. 뚜껑을 거꾸로 뚜껑 접시 사이의 작은 차이 통해 탈출 하는 애벌레의 기능을 줄이기 위해 설정 합니다. 10-20 분에 대 한 복구할 수 애벌레 수 있습니다.
2. 깨끗 한 애벌레 (옵션 2) 분리
   참고: 애벌레를 청소에 대 한 대체 방법이 세척 절차 동안 애벌레를 질 식의 가능성을 줄입니다. 이 방법을 사용 하려면 위의 단계 4.1.1-4.1.2를 수행한 후 다음 단계를 진행 합니다.
   1. 셀 스 트레이너를 배치 (300 µ m, 애벌레 72 h AEL 유지 이상) 50 mL 튜브 위에.
   2. 확인 후 성인 시체 또는 자당 솔루션의 표면에 떠 있는 음식 파편, 메쉬 스크린에 모든 애벌레를 함정에 스 트레이너를 통해 애벌레를 포함 하는 상위 계층을 붓는 다. 50 mL 튜브 채워질 때까지 증류수로 깨끗이 애벌레를 씻어.
   3. 튜브에서 애벌레와 사용 물의 dispose 셀 여과기를 제거 합니다. 빈 튜브 위에 애벌레를 포함 하는 여과기를 놓고 50 mL 튜브 채워질 때까지 다시 증류수와 애벌레를 세척 합니다.
   4. 스 트 레는 빈 35 mm 페 트리 접시, 거꾸로 뒤집어 하 고 페 트리 접시에 애벌레를 전송할 셀 스 트레이너의 위에서 물 스프레이. 나머지 애벌레는 작은 페인트 브러시를 사용 하 여 전송 합니다.
   5. 5 단계로 진행 하기 전에 위의 4.1.7 단계를 계속 합니다.

5. 분석 결과 및 계산

1. 골 판지 상자를 제거 하 고 접시에 애벌레를 전송 하기 전에 즉시 젤 표면 온도 확인. 골 판지 상자는 온도 평형 방해를 방지 하기 위해 시간을 최소화 합니다. 표면이 건조 한 경우에, 표면에 소량의 물 스프레이.
2. 단일 방향 그라데이션 (릴리스 영역;에 대 한 (영역 3와 4는 6 영역에서) 사이 각 격판덮개의 센터 근처 150 ± 50 애벌레를 배포 그림 2C)입니다.
   참고: 양방향 그라데이션에 대 한 배포 각 절반의 중간 영역에 따라 200-400 애벌레 (그림 2D).
3. 애벌레가 밖으로 크롤 링 하지 않도록 하려면 각 분석 결과 접시 위에 microplate 뚜껑을 놓습니다. Agarose 젤에 애벌레 선택에 영향을 줄 수 있는 가벼운 노출을 방지 하기 위해 골 판지 상자를 가진 설치를 커버.
   참고: 양방향 그라데이션에 대 한 그것은 해서는 안됩니다 접시는 더 큰, 그리고 애벌레의 기본 온도 중간 영역에 있기 때문에, 뚜껑 접시를 커버 하는 데 필요한. 따라서, 몇몇 애벌레 가장자리에 축적 하 고 밖으로 크롤 링 수 있는 기회가.
4. 10-30 분 단일 방향 그라데이션 및 (표 4) 애벌레의 나이 따라 양방향 그라데이션에 대 한 15-35 분 동안 진행 하는 분석 결과 허용 합니다.
5. 골 판지 상자와 미 판 뚜껑을 제거 합니다. 디지털 카메라를 사용 하 여 위에서 접시 사진. 조사 더 나은 콘트라스트와 밝기 분석에 대 한 하나를 선택할 수 있도록 각 분석 결과 접시의 두 사진을 가져가 라.
6. 열망 하 여 애벌레의 모든 분석 결과 접시에서와 어디 판 외부를 제거 합니다.
7. 분석 결과 판, 관, 및 증류수로 깨끗이 셀 스 트레이너를 청소. 분석 결과 접시는 agarose의 표면 손상 하지 않는 한 그 날을 준비를 다시 사용 합니다.
8. 각 영역에서 애벌레의 비율 분포를 계산 합니다.
   1. 이미지에 표시를 추가 수 있는 모든 소프트웨어를 사용 하 여 분석 결과의 사진 이미지를 엽니다. 분석 결과 영역을 모든 2 cm 시험 접시에 경계 설정에 따라 수직 라인을 그립니다.
   2. 각 영역에서 애벌레의 수를 세 고 숫자를 기록 합니다. 지역 벽에서 0.5 c m 애벌레를 포함 하지 않습니다. 젤 두꺼운 벽, 근처 이며 표면 온도 다음이 지역에 선형.
   3. 단일 방향 그라데이션에 대 한 각 영역에서 백분율 분포를 다음과 같이 계산.
      (주어진된 2 cm 영역에서 애벌레의 수) / (6 영역에서 애벌레의 총 수) x 100.
   4. 양방향 그라데이션에 대 한 각 영역에서 백분율 분포를 다음과 같이 계산.
      (주어진된 2 cm 영역에서 애벌레의 수) / (해당 각 측에 5 영역에 애벌레의 총 수) x 100.

결과

18 °-28 ° C 단일 방향 설정 그라데이션, 우리 두 물 탕의 온도를 설정 16.8 ° C와 31 ° C 우리는 agarose 젤 표면 (그림 2C, 2E)의 극단적인 끝에 모든 6 영역, 영역 사이의 테두리 라인의 상단과 하단에서 26 위치에서 온도 측정 하 여 13 지점에서 온도 얻을. 그라데이션에 따라 온도 분포는 거의 선형 (Y = 0.9672 * X + 16.19, R² = 0.9961) (그림 2E).

우리는 다양 한 연령대에서 제어 (w¹¹¹⁸) 애벌레의 온도 선호를 분석. 1^세인트 (24 ± 1.5 h AEL), 2^nd

토론

이 프로토콜의 성공을 위해 실험을 수행 하는 애벌레의 적절 한 숫자를 얻기 위해 조치를 취할 중요 하다. 전 달걀 누워 개선 하기 위해 2-3 d에 대 한 효 모 붙여넣기 포함 된 튜브에 파리를 먹이 포함 됩니다. 튜브 물 튜브를 포함 하는 쟁반에 배치 하는 식품의 수 분을 유지 하 고 촉진 효과 먹이 애벌레에 의해 정상적인 빛 어두운 주기에 노출을 허용 하는 동안 투명 한 플라스틱 가방에 포함 해야 합니다. 그러나, 누 룩 붙여 부드러운 파리 갇혀 될 수 없습니다. 유리병 당 여성의 수는 유전자 형에 따라 달라 집니다. W¹¹¹⁸, 경우 일반적으로 12 ~ 여성 및 ~ 6 남성 3 h에 대 한 알 수 있도록 충분 한입니다. 두 개의 튜브는 일반적으로 단일 지향성 분석 결과 대 한 접시에 충분 한 애벌레 (유 충 100-200)를 제공 합니다. 비행 주식 야생-타입 보다 적은 알을 낳는 또는 부 화 애벌레의 비율 감소, 추가 (30-35/유리병)까지 추가 여성 및 남성.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, 냉장/가열식 6L 순환 수조	Thomas Scientific	9106	이 모델은 단종되었습니다. 업데이트된 교체 모델에는 120V, 60Hz용 1186R00 및 1197U04 또는 240V, 50Hz용 1184L08 및 1197U04가 포함됩니다.
알루미늄 분석 플레이트(단방향 구배용)			외부 크기: 14 x 10.1 x 0.9cm, 내부 크기: 12.9 x 8.7 x 0.8cm, 검은색 아노다이징 처리.
알루미늄 플레이트(양방향 그라디언트용)			25 x 22 x 0.2cm, 검은색 아노다이징 처리.
알루미늄 블록			외부 크기: 25.5 x 5 x 1.4cm, 내부 채널의 매개변수는 그림 1D에 나와 있습니다.
알루미늄 블록 및 튜빙용 커넥터	McMaster-Carr	91355K82
Tygon 위생 실리콘 튜빙	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" 벽
Name	Company<	strong>카탈로그 번호	Comments
Items 및 분석용 시약
유봉	USA Scientific	17361	1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브용 유봉
온도계	Fluke	51II
열전대		Fluke K형
범용 마이크로플레이트 뚜껑	Corning	6980A77
35mm 접시	Corning	9380D40
라벨링 테이프 (양방향 구배용)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand 라벨링 테이프 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	1% 용액 준비
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	분석 시작 직전 18% 용액 준비
페인트 브러시	Fisher Scientific	11860
50 mL 원심분리 튜브	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500mL 원형 입이 넓은 병	Pyrex	1395-500
세포 여과기(300mm 기공)	PluriSelect	43-50300	유충 세척용 옵션 항목
판지 상자(바이알 트레이)	Genesee Scientific	FS32-124
이름	Company	카탈로그 번호	코멘트
>Drosophila 식품
증류수			22,400 mL
옥수수 가루, 노란색 (극세 메쉬, 플록) 20 kg	LabScientific Inc.	NC0535320	1,609 g
맥주 효모 100 lbs	MP Biomedicals	ICN90331280	379 g
NutriSoy® 콩가루(10kg/단위)	Genesee Scientific	62-115	221g
초파리 한천, II형(5kg)	Genesee Scientific	66-103	190g
Karo light 옥수수 시럽	Karo		1,700mL
메틸 4-하이드록시벤조에이트(200프루프 에탄올에 현탁)Sigma	Aldrich	H5501-5KG	72g/240mL
프로피온산 퓨리스. pa,>99.5%(GC)	Sigma Aldrich	81910-1 L	108 mL
인산  ACS 시약, ≥ 85 wt. H2O 시	그마 Aldrich	438081-500 mL	8.5 mL