전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출

요약

여기, 우리는 바이러스 비활성화 전체 혈액에서 급속 한 바이러스 핵 산 추출에 대 한 프로토콜을 제시. 추출 혈액 컬렉션 튜브에 직접 수행 되 고 필요 없는 장비 또는 전기. 방법과 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 수 있습니다 어디서 나 (예를 들어, 필드 병원에서) 사용.

초록

감염의 급속 한 진단 발발 관리, 위험 봉쇄, 그리고 환자 치료를 위해 필수적 이다. 우리 이전 진공 혈액 컬렉션 튜브에 직접 상업 세포/바인딩 버퍼를 추가 하 여 안전한 핵 산 (나) 테스트를 위한 혈액 샘플링 동안 에볼라 바이러스의 급속 한 머리 맡 비활성화 하는 방법을 나타났습니다. 이 침대 비활성화 접근을 사용 하 여, 신속, 안전 하 고 단순화 된 머리 맡 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 후속 검색에 대 한 개발 했습니다. 나 추출 혈액 컬렉션 튜브에서 직접 수행 하 고 아무 장비 또는 전기를 요구 한다.

혈액 세포/바인딩 버퍼에 수집 후 내용을 손으로 튜브를 틀 지 하 여 혼합 하 고 혼합물은 실 온에서 20 분 동안 알을 품을. 자석 유리 입자 (MGPs) 튜브에 추가 되 고 내용을 손으로 컬렉션 튜브를 틀 지 하 여 혼합 됩니다. MGPs는 다음 자석 홀더 또는 자석 및 고무 밴드를 사용 하 여 혈액 컬렉션 튜브 측에 수집 됩니다. MGPs는 세 번 씻어 그리고 컬렉션 튜브에 직접 차입 버퍼의 추가, NAs 나 테스트, 정량 등의 반응에서 MGPs 제거 없이 등온선 루프 증폭 (램프)에 대 한 준비가. 나 추출 메서드는 모든 실험실 시설에 의존 하지 않으며 쉽게 될 수 있다 (예를 들어, 필드 병원 및 병원 격리 병 동에서) 어디서 나 사용할. 이 나 추출 방법은 램프 및 휴대용 악기와 결합 하면 진단 혈액 컬렉션의 40 분 이내 얻어질 수 있다.

서론

바이러스 발생 상황에서 환자 병원 격리 병 동 또는 때 빠른 진단이 필요 하 고에 수감 되는 때, 간단 하 고, 안전 하 고 정확한 포인트의 케어 분자 진단 환자 관리 및 위험 포함에 대 한 필수적입니다. 에볼라 바이러스 (EBOV) 서 부 아프리카 (2013) 및 남미 (2015), Zika 바이러스의 2 개의 최근 바이러스 발생, 향상 된 관리 포인트 분자 진단 테스트, 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 등에 대 한 관심 증가 증폭 (RT-램프)^1,2 , recombinase 중 합 효소 증폭 (RPA)^3,4. RT-램프와 RPA는 단순화 된 샘플 준비에 수행할 수 있는 빠른, 민감한, 그리고 특정 분자 테스트. Zika 바이러스에 대 한 실시간 램프는 측면 흐름 분석 결과 (LFA), 30 분¹; 내 정화 비 전체 혈액 샘플에서 Zika 바이러스를 검출할 수 있는 결합 되었습니다. 그러나, 위험 그룹 4 병원 체로 분류 되는 매우 전염성이 EBOV 샘플 biosafety 아래 처리 될 필요 레벨 4 (BSL-4) 조건 및 안전 진단 절차를 수행할 수 있습니다 전에 비활성화.

단순화 된 비활성화 방법 EBOV, 샘플^2,3,,45에 세포의 용 해 버퍼의 추가 같은 발발; 하는 동안 사용 되었다 그러나, 이러한 방법을 BSL-3 biosafety 캐비닛, 원심 분리기, 난방 블록 및 펫, 최소한 같은 실험실 장비와 BSL-4 조건 하에서 처리를 해야합니다. 이 장비는 격리 병 동에 또는 필드 병원에 일반적으로 존재. 이 문제를 해결 하려면 시도에 가방³, 진단 수행 되었습니다 되며 여러 휴대용 장치 및 기계 개발 [예를 들어, (나) 핵 산 추출에 대 한 휴대용 장치]⁶. 그러나, EBOV 긍정적인 샘플 여전히이 장치를 사용할 수 있습니다 비활성화 될 필요 합니다.

우리가 이전에 보고 된 EBOV⁷, Vaccinia 바이러스 및 Cowpox 바이러스⁸ 에 대 한 신속한 머리 맡 바이러스 비활성화 방법 상업 세포/바인딩 버퍼의 추가 의해 일반 진공 혈액 컬렉션 튜브를 직접 허용 양도 혈액 환자에서 비활성화 버퍼⁷에. 어떤 엄격한 봉쇄, BSL-4 조건⁷, 등을 사용 하 여 샘플 처리에 대 한 필요성을 제거 하는 닫힌된 시스템에서이 직접적이 고 즉각적인 비활성화 하 고 샘플 정상적인 BSL-2 조건 하에서 처리 될 수 있습니다. 이 비활성화 방법은 여러 나 추출 시스템, 로봇 등 손 정화 키트⁷;와 호환 그러나, 이러한 방법은 항상 병원 격리 병 동 내부 또는 필드 설정에 존재 하지 않는 로봇, 원심 분리기, 전기, 등 실험실 장비가 필요 합니다.

이 보고서에서 우리는, 신속, 안전 하 고 단순화 된 수동 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 후속 분자 검출에 대 한 설명합니다. 나 추출 방법에는 어떤 장비의 자석/자석 홀더 필요 하지 않습니다. 아니 원심 분리기, 블록, 또는 전기 난방 나 추출 필요 합니다. 따라서,이 방법은 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 하 고 쉽게 될 수 있다 (예를 들어, 필드 병원, 병원 격리 병 동, 또는 낮은 리소스 설정을) 어디서 나 사용할. 나 추출 방법 신속 하 고 간단 하 고 모든 다운스트림 나 테스트, 정량, 실시간 정량, 램프, 또는 RT 램프 등에서 직접 사용할 수 있습니다. 이 나 추출 방법은 램프와 휴대용 배터리 구동 등온선 악기와 결합 하면 머리 맡 진단 혈액 컬렉션의 40 분 이내 얻어질 수 있다.

프로토콜

생명 의학 연구 윤리 위원회, 수도권은 동의 그리고 여기에 설명 된 모든 방법을 분석 결과 개발 프로젝트에 덴마크 법률에 따라 윤리 위원회 시스템에 의해 검토에서 제외 된.

1. 바이러스 비활성화 및 빠른 나 추출을 위한 혈액 컬렉션 진공관의 준비

주의:이 프로토콜에 사용 되는 버퍼 guanidinium 안산 (GITC)과 비 이온 계면 활성 제, irritants을 포함 되어 있습니다. 적절 한 실험실 안전 조치, 흐름 후드를 사용 하 고 그것을 취급할 때 장갑을 착용. 어떤 피부와 눈 접촉을 피하십시오. 버퍼를 유출 하는 경우 오염 된 표면 해야 합니다 절대 소독 되어야 chloramine 또는 염소 ("표 백제"의 활성 성분)와 직접이 혼합물 독성 시안 화물의 형성으로 이어질 수 있기 때문에. 첫째, 흡수 성 조직으로 유출된 버퍼를 닦아냅니다. 다음, 물, 그리고 70% 에탄올으로 표면 청소 하 고 마지막으로, chloramine 또는 염소를 사용 합니다.

1. 준비 하려면 혈액 컬렉션 진공관, 25 G x 1 바늘과 3 mL 주사기를 사용 하 여 튜브의 뚜껑을 puncturing 의해 특정 상업 세포의 용 해 버퍼의 1.6 mL 4 mL EDTA 진공 튜브로 주사.
   참고: 진공 튜브의 뚜껑을 제거 하지 마십시오. 진공 유지 되어야 합니다.
2. 실 온에서 버퍼 사용까지 포함 된 진공 튜브를 저장 합니다.
   참고: 튜브는 적어도 1 년의 준비 후 안정.

2입니다. 나 추출에 대 한 버퍼의 준비

1. 나 추출에 대 한 버퍼를 준비 하려면 랙에서 두 1.8 mL, 두 4.5 mL, 그리고 한 3.6 mL 튜브를 배치 합니다.
2. Pipetting, 960 µ L 자석 유리 입자 (MGPs) 깨끗 한 1.8 mL 튜브와 라벨이 MGPs. 그것은 그것을 pipetting 전에 완전히 MGP 정지를 Resuspend 하 여 추가 합니다.
   참고:는 MGPs는 튜브의 하단에 신속 하 게 수집 하는 경향이 있다.
3. Pipetting, 워시 버퍼의 4 mL 나 깨끗 한 4.5 mL 튜브에 의해, 추가 하 고 WB-1로 그것을 분류.
   주의: 워시 버퍼 나 자극성은 guanidinium 염화를 포함 합니다. 적절 한 실험실 안전 조치, 흐름 후드를 사용 하 고 그것을 취급할 때 장갑을 착용. 어떤 피부와 눈 접촉을 피하십시오.
4. 워시 버퍼 II 깨끗 한 3.6 mL 튜브 1.5 mL를 pipetting에 의해 추가 하 고 WB 2로 그것을 분류.
5. Pipetting, 여 깨끗 한 4.5 mL 튜브에 워시 버퍼 III의 3 mL를 추가 하 고 레이블을 WB-3로.
6. 깨끗 한 1.8 mL 튜브에 차입 버퍼의 100 µ L pipetting으로 추가 하 고 레이블을 EB로.
7. 사용 될 때까지 실 온에서 aliquoted 버퍼를 저장 합니다.
   참고: 튜브는 그들의 준비 후 적어도 1 달 동안 안정.

3. 바이러스 감염의 징후와 증상을 가진 환자에서 혈

주의: 환자에서 전체 혈액을 수집 하는 때 적절 한 실험실 안전 조치를 취할. 장갑과 안경 착용. 환자 격리에서는, biosafety 수준 4 절차를 따르시기 바랍니다.

1. 환자에서 정 맥 전 혈을 수집 작은-내경 확장 튜브와 나비 바늘과 혈액 컬렉션 진공관 포함 하는 세포/바인딩 버퍼를 사용 합니다. 하향 위치에 환자의 팔을 휴식 하 고 컬렉션 튜브 나비 바늘 보다 낮은 위치. 환자의 정 맥에 나비 바늘을 삽입 하 고 작은-내경 확장 혈액 컬렉션 진공관을 연결할.
   참고: 이것은 역류를 방지 합니다.
2. 혈액 수집 후 5-10 시간 튜브를 틀 지 하 여 튜브의 내용을 혼합.
   참고: 포함 하는 세포/바인딩 버퍼의 1.6 mL 혈액 컬렉션 튜브에 남아 있는 진공으로 인해 수집 된 샘플의 볼륨 자동으로 됩니다 1.6 mL.
3. 70% 에탄올을 사용 하 여 튜브의 외부를 소독.
4. 실 온에서 20 분 동안 튜브를 품 어.
   참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 및 전체 혈액 컬렉션 튜브-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C 또는 적어도 1 달⁷에 대 한 37 ° C에 저장 될 수 있다.
5. 단순화 된 나 추출 방법에 직접 계속.

4. 간단 하 게 전체 혈액의 나 추출

1. 세포/바인딩 버퍼 비활성화 수집 된 혈액, 믹스에서에서 나를 정화 진공을 틀 지 하 여 튜브의 내용을 손으로 5-10 x 튜브.
2. 신중 하 게 튜브의 뚜껑을 제거 하 고 뚜껑을 방전.
3. 혈액 컬렉션 튜브에 직접 MGPs (1 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.
4. 샘플 포함 된 튜브에는 사용 하지 않는 혈액 컬렉션 튜브에서 새로운 뚜껑을 장소.
5. 튜브 긴밀 하 게 폐쇄 확인 혈액 컬렉션 튜브가 손으로 5-10 시간 틀 지 하 여 튜브의 내용을 혼합을 뚜껑에 손가락을 놓습니다.
6. 자석 홀더에 튜브를 놓고 튜브 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 유지 합니다.
7. 모든 MGPs는 자석으로 튜브의 측면에서 수집 되도록 손으로 튜브와 함께 자석 홀더는 몇 번을 플립.
   참고: 자석 홀더는 길쭉한 자석 및 고무 밴드를 교체할 수 있습니다.
8. 튜브의 뚜껑을 제거 하 고 일회용 피 펫을 사용 하 여 또는 단순히 50 mL 수집 튜브에 내용을 붓는 하 여 튜브의 내용을 삭제 합니다.
   참고: 튜브 뚜껑을 닫아서 50 mL 수집 튜브에서에 어로 졸을 피하십시오.
9. 혈액 컬렉션 튜브에 직접 WB-1 (4 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.
10. 관에 뚜껑을 배치 하 고 튜브 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 놓습니다.
11. 자석 홀더, 뚜껑을 손가락으로 안전 하 게 강화 유지에서 튜브를 제거 합니다.
    참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서.
12. 혈액 컬렉션 튜브를 내리고 손으로 5-10 시간 여를 MGPs resuspend.
13. 4.6 4.8 단계를 반복 합니다.
14. 혈액 컬렉션 튜브에 직접 WB-2 (1.5 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.
15. 관에 뚜껑을 놓고 자석 홀더에서 튜브를 제거 합니다.
    참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서.
16. 튜브는 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 놓습니다.
17. MGPs는 손으로 몇 초 동안 혈액 컬렉션 튜브를 내리고 여 resuspend.
18. 4.6 4.8 단계를 반복 합니다.
19. 혈액 컬렉션 튜브에 직접 WB-3 (3 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.
20. 관에 뚜껑을 놓고 자석 홀더에서 튜브를 제거 합니다.
    참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서.
21. 튜브는 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 놓습니다.
22. 혈액 컬렉션 튜브를 내리고 손으로 5-10 시간 여를 MGPs resuspend.
23. 4.6 4.8 단계를 반복 합니다.
24. EB의 준비 된 약 수를 부 어 (100 µ L) 혈액 컬렉션 튜브에 직접.
25. 관에 뚜껑을 놓고 자석 홀더에서 튜브를 제거 합니다.
    참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서.
26. 혈액 컬렉션 튜브 5-10 배는 손가락으로 두 드려서는 MGPs는 EB에 resuspend.
    참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다, 그리고 튜브-20 ° c.에 저장 될 수 있다
27. Resuspended MGPs의 1.5 mL 일회용 피 펫 (모든 다운스트림 진단 나 증폭 시험 램프/RT-램프 또는 정량/RT-정량 분석을 사용할 수 있습니다와 같은)를 사용 하 여 다운스트림 나 증폭 반응 혼합 한 방울 (5-8 µ L)를 전송.
    참고: NAs는 MGPs에 충실, 다운스트림 나 증폭 반응에는 MGPs를 사용 해야 됩니다. 혼합 사용 하기 전에 MGP 정지. 혼합 후, MGPs는 튜브의 아래쪽에 수집 합니다.

결과

여기에 제시 된 프로토콜 간단 하 고 효율적 이며 세포/바인딩 버퍼와 비활성화 전염 성 전체 혈액 샘플에 수행 되어야 할 모든 분자 분석 결과에 광범위 하 게 적용할 수 있습니다. 혈액 비활성화 및 나 추출에 대 한 워크플로 나온 그림 1혈액 컬렉션 진공관⁷ (그림 1A), 혈액 컬렉션⁷ (그림 1B), 나 추출 ( 준비 등 그림 1 c - 1 H), 및 다운스트림 나 분석 (그림 1I).

단순화 나 추출 프...

토론

이 보고서에서 우리는, 신속, 안전 하 고 간단한 수동 침대 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 다운스트림 분자 검출에 대 한 설명합니다. 직접 세포/바인딩 버퍼 (자료 테이블)⁷를 포함 하는 진공 혈액 컬렉션 튜브에 수집 된 전체 혈액 샘플에 수행 되어야 할 설명된 나 추출 방법 개발 되었다. 이 특정 버퍼 EBOV⁷ 생긴다 고 방법의 중요 한 구성 요소입니다. 혈액 수집 후 적어도 20 분⁷ 튜브 샘플의 완전 한 비활성화를 위해 배양 하는 것이 좋습니다. 머리 맡 EBOV 비활성화 BSL-4 조건 등 엄격한 제약 조건 하에서 어떤 EBOV 긍정적인 샘플 처리에 대 한 필요성을 제거 하 고 정상 BSL-2 조건 처리 샘플 있습니다. 그것은 다른 위험 그룹 4 개의 병원 체, 같은 Lassa 바이러스, Marburg 바이러스, 및 크림 콩고 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Vacutainer K2 EDTA 튜브 (4 mL)	Becton Dickinson	368861
Plus 혈액 수집	Becton Dickinson	362725
23G x 1 바늘	Becton Dickinson	300800
LUER LOK 주사기 (3 mL)	Becton Dickinson	309658
나비 바늘 작은 구멍 확장 튜빙	Jø rgen Kruuse A/S	121714
1% Virkon	Nomeco A/S	849265
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - 용해/결합 버퍼 - 리필	Roche Diagnostics A/S	03246752001
MagNA Pure LC 총 핵산 분리 키트	Roche Diagnostics A/S	3038505001
Nunc™ 바이오뱅킹 및 세포 배양 극저온 튜브(1,8mL)	Thermo Fisher Scientific	375418
Nunc™ 바이오뱅킹 및 세포 배양 극저온 튜브(3,6mL)	Thermo Fisher Scientific	379189
Nunc™ 바이오뱅킹 및 세포 배양 극저온 튜브(4.5mL)	Thermo Fisher Scientific	379146
DynaMag™-5 자석	Thermo Fisher Scientific	12303D
전사 피펫(3.5mL)	Sarstedt	86.1171.010
Thermo Scientific™ 삼코&트레이드; 미세 팁 전송 피펫 (1.5 mL)	Thermo Fisher Scientific	231
Thermo Scientific™ Nunc™ 50mL 원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	Thermo Fisher Scientific	339652