방법 논문

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

DOI:

10.3791/58024

⸱

2018년 6월 29일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Department of Biology, University of Ottawa

이 논문에서

요약

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Zebrafish는 유전자 편집 기술의 출현으로 특히 생물 의학 연구에서 안정적인 유전자 모델 생물으로 사용 되었습니다. 애벌레 고기 예상 되는, DNA 추출 및 유전자 식별 전하실 수 있습니다. 여기, 꼬리 자르기, 빠르면 72 h 후 수정 하 여, zebrafish 애벌레에 대 한 효율적인 유전형 절차를 설명 합니다.

초록

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Zebrafish (Danio rerio) orthologues를 인간의 질병과 관련 된 것으로 알려진 유전자의 84%를 소유한 다. 또한, 이러한 동물 짧은 생성 시간, 쉽게 처리, 저렴 한 비용, 높은 생식 속도 표시 하는 있고 쉽게 배아에서 DNA의 microinjection에 의해 유전자 조작 의무가 있습니다. 최근 발전 도구를 편집 하는 유전자 돌연변이 제 브라에서 transgenes의 정확한 소개를 활성화는 합니다. 종종 zebrafish에 모델링 질병 해석 genotypes 알려지지 않은 경우에 도전적 일 수 있다 이른 죽음과 애벌레 고기 이끌어 낸다. 이 초기 신분의 genotypes 샘플 풀링 요구 하는 실험에 필요한, 진 식 또는 질량 분석 연구 등 이기도 합니다. 그러나, 광범위 한 genotypic 심사 사후 애벌레 또는 성인 zebrafish에만 수행 됩니다 대부분의 실험실에는 전통적인 방법에 의해 제한 됩니다. 우리는 72 h 후 수정 (hpf)로 빨리 달성 될 수 있는 라이브 zebrafish 애벌레에서 PCR 준비 genomic DNA의 분리 하는 방법에 적응 하 여이 문제를 해결. 이 시간 및 비용 효율적인 기술, 이전 게시 된 유전형 프로토콜에서 향상 된 미세한 핀 biopsies에서 genotypes 식별 수 있습니다. 지 느 러 미는 애벌레 개발에 신속 하 게 다시 생성 합니다. 연구원은 선택 하 고이 높은 처리량 PCR 기반 유전형 절차를 이용 하 여 성인 기에 원하는 genotypes을 올릴 수 있습니다.

서론

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제 브라 (Danio rerio) 척추 생물 치료 가설1,2,3의 전 임상 시험에 관해서는 뿐만 아니라 질병 조사에 대 한 모델으로 널리 이용 되는. 이 동물 짧은 생성 시간, 쉽게 처리, 저렴 한 비용, 높은 생식 속도 표시 하는 있고 쉽게 배아4DNA의 microinjection에 의해 유전자 조작 의무가 있습니다. 소설 유전자 변형, 유전자 기술 등 아연 손가락 nucleases (ZFN)5, 탈 같은 이펙터 Nucleases (TALENs)6,7는 클러스터 정기적으로 Interspaced 짧은 편집의 증가 개발을 통해 (CRISPR)을 반복 하는 구조/CRISPR 관련 9 (Cas9) 시스템8, zebrafish는 실질적으로 여러 pathologic 조건의 이해를 향상 시킬 태세 이다. 이러한 기술을 모두 체세포 타겟된 녹아웃을 만드는 데는 그리고 zebrafish, 효율적으로 사악한 유전자에 생식 세포 동물8수정. 최근 문학에서 등이 간 질 및 대사 질환의 유전자 모델의 성공적인 개발 zebrafish3,,910,11,12 .

진전 zebrafish 게놈 편집, 신속 하 고 신뢰할 수 있는 유전형 명백한 속도-제한 단계 되고있다. 특정 DNA 변이 예측된 게놈 편집 대상 사이트에 인접 한의 식별 프로토콜의 필수 단계입니다. 전통적으로, 지 느 러 미 클리핑에 의해 유전형 기법만 수행된에 청소년 이나 성인 zebrafish는 일반적으로. 그러나, 성인 기에 올리는 zebrafish 보낸 시간 (> 2 개월) 상당히 지연 연구에 있는 전진. 대부분의 경우, 성인 필수 유전자 (예를 들어, 질병 모델링에서) 또는 해로운 phenotypic 효과로 이어지는 이득의 기능 돌연변이의 녹아웃으로 얻을 수 없다. 또한, 여러 분석 실험 등 RNA 또는 대사 산물 추출, 애벌레의 풀링 요구 하 고 따라서 유일한 특별 게시물 유전형 기술을 사용할 수 있는 경우에 도전적 일 수 있다 genotypes의 사전 식별을 포함. 상기 예제 애벌레 유전형 기법을 정확 하 게 동시에 하 고 전체 복구 및 애벌레의 정상적인 발전의 중요성을 강조 표시 합니다. 초기 단계 zebrafish 유전형 표시 되지 않으면 현재 널리 이용 될; 이 애벌레 genotypes 유전형 실험12,,1314의 실행 전에 보다는 사후 유전형을 통해 식별 되는 질병 모델의 최근 간행물에 의해 반영 됩니다. 이 논문에서는, 애벌레 핀 클립 전략 이전 설립된 유전형 절차를 향상을 목표로 제공 됩니다.

과거에는, K 성분을 소화 유전자 형을 채용 하는 전략 라이브 zebrafish 애벌레 변수 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 효율15이어졌다. 더 최근 미세한 꼬리 생 검 기술은 더 유망한 결과16제공 게시, 비록 우리와 다른 그룹 하지 못했습니다 고효율와 저자에 의해 보고 된 DNA 복구를 재현. 윌 킨 슨 외 에 의해 설명 하는 프로토콜의 주요 좌절 16 PCR 튜브에 꼬리 조직의 전송 될 수 있습니다. 미세한 크기로 인해 fin 수집 및 pipetting으로 적절 하 게 제대로 되었음을 보장 하기 어렵다. 이 배리어를 해결 하기 위해 우리는 유전형 거의 1009라이브 zebrafish 애벌레의 큰 숫자에 대 한 향상 된 프로토콜을 개발 했습니다. microscalpel을 사용 하 여, 지 느 러 미 꼬리의 끝은 제거 하 고 필터 종이 조각에 배치. 조직을 포함 하는 필터 종이 쉽게 시각화 하 고 올바르게 PCR 튜브에 배치 수 있습니다. 게놈 DNA 추출 다음 다음 유전자 형 표본에 관심 영역의 PCR 증폭, 수행 됩니다. 이 방법의 장점은 높은 PCR 효율, 낮은 거짓 긍정적인 평가 낮은 사망률을 포함합니다. 또한, 많은 수의 배아의 유전형이이 프로토콜을 사용 하 여 가능 하다. 여기에 설명 된 프로토콜 지 느 러 미-클리핑 수백이 접근 및 genotyped 물고기와 2 일 이내 꼬리 재생의 정확한 식별을 사용 하 여 2-3 h 이내 애벌레의 수 있습니다.

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프로토콜

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절차와 관련 된 동물 주제 승인 되며 동물 보호 지침에 따라 제공 캐나다 위원회에 의해 동물 관리 및 오타와의 대학에 동물 보호 위원회.

1입니다. 준비

  1. 그것의 내부 표면에 걸쳐 9 cm 배양 접시 뚜껑 압력솥 테이프로 녹화 하 여 해 부 표면 준비. 스테레오 현미경 위치.
  2. 3-5 일 후 수정 (dpf)를 배치 zebrafish 애벌레는 페 트리에서 접시와 ˜1.5 m m Tricaine 1 x E3 배아 미디어 (5 m m NaCl, 0.17 m m KCl, 0.33 m m CaCl2, 0.33 m m MgSO4, pH 7.2)에서 anesthetize.
  3. 최소한의 스트레스와 3 dpf 애벌레에 맞게 2 mm의 직경에 한 쌍의가 위 또는 면도날과 P1000 피 펫 팁의 끝을 잘라.

2. 지 느 러 미 클리핑 Zebrafish 애벌레의

  1. 수정된 P1000 micropipette를 사용 하 여 마 취 유 충을 선택 하 고 위치 고압 테이프에 zebrafish 애벌레 Petri 접시 뚜껑에 배치.
  2. 애벌레는 micropipette를 사용 하 여 주변 초과 Tricaine 솔루션을 제거 합니다. 지역으로 하 여 성공적으로 섹션은 지 느 러 미를 선택 하지만 생존을 위해 아직도 젖은 건조 해야 한다.
  3. 마이크로 메스, 섹션 윌 킨 슨 외16에 설명 된 대로 그림 1에 표시 된 대로 스테레오 현미경 아래 꼬리 지 느 러 미를 사용 하 여. 절 개를 하는 동안 사이트 내에서 안료 격차는 꼬리 지 느 러 미, 말 초 혈액 순환 (그림 1A)의 한계에의 꾸준한 하향 압력을 적용. notochord 손상 되지 않도록 부드러운 압력을 적용 합니다.
  4. 현미경 sectioned 지 느 러 미를 시각화 하 고 microscalpel 블레이드 (그림 2A)의 팁 위에 조각 위치. 필터 종이의 작은 조각의 표면에 지 느 러 미를 포함 하는 microscalpel를 놓습니다.
    참고: transected 조직에서 melanocytes의 존재로 인해이 단계 작은 블랙 스팟 (그림 2B)로 지 느 러 미의 시각화 수 있습니다.
  5. 50mm 잘 (그림 2D) 당 NaOH 솔루션의 25 μ를 포함 하는 96-잘 PCR 플레이트에 지 느 러 미를 포함 하는 필터 종이 위와 핀셋 (그림 2C), 전송 사용 하.
  6. PCR 접시의 라벨에 따라 잘 번호 플랫-아래 96 잘 접시를 준비 합니다. 신선한 1 x E3 배아 미디어의 200 µ L로 가득 수정된 P1000 피 펫을 사용 하 여, 조심 스럽게 zebrafish 애벌레 부드러운 압력을 사용 하 여 수집 합니다. 같은 PCR 플레이트 (그림 2E)으로 잘 번호 96-잘 조직 문화 접시에 있는 애벌레를 분배.
  7. 필터 종이 (그림 2F) 솔루션에 빠져들 잘는 다는 것을 확인 하십시오. Microscapel 70 %EtOH 솔루션으로 그것을 찍기 하 여 교차 오염을 방지 하기 위해 각 컷 사이 핀셋의 블레이드를 청소. 깨끗 한 종이 티슈/지우기와 블레이드를 닦아.
  8. 2.1-2.7 단계를 반복 하 여 모든 배아 잘립니다 되었습니다.
  9. genotypes 발견 되었습니다 때까지 28 ° C에 96 잘 접시에 애벌레를 저장 합니다.
    참고: 배아 미디어 프로토콜은 2 일 이내에 쉽게 완료 될 수 있다 때문에 바뀔 필요가 없습니다. 더 많은 시간이 필요한 경우 미디어 변경 것이 좋습니다.

3. 게놈 DNA 추출

  1. 96-잘 PCR 접시와 원심 분리기 1000 x g 되도록 모든 필터 종이 1 분에 샘플 NaOH 솔루션 내에서 잠긴 인감.
  2. 조직 세포에 대 한 뒤에 10 분 동안 4 ° C에 냉각 5 분 동안 95 ° C에서 thermocycler에서 샘플을 열.
  3. 500 mM Tris HCl, pH 8.0 각 샘플의 6 μ를 추가 합니다. 와 동입니다.
  4. 짧게 원심 1500 x g, 실 온에서 5 분에 접시.
  5. PCR 반응 당 DNA 상쾌한의 1.5 μ를 사용 합니다.
  6. 표 1-2와 같이 유전자를 PCR는 애벌레를 준비 합니다.
    참고:이 프로토콜은 두 응용 프로그램에 대 한 테스트 되었습니다: 다중 PCR 반응 agarose 젤9, heteroduplex 녹는 genotypes polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)17을 사용 하 여 공개 하는 분석 결과 (HMA)을 사용 하 여 유전자 형을 공개.

4. 대체 게놈 추출 Chelating 수 지를 사용 하 여

  1. 96-잘 PCR 접시에 잘린된 지 느 러 미와 지를 추가 하 여 완료 단계 2.5 킬레이트 화 수 지 (스 티 렌-divinylbenzene 공중 합체 짝된 iminodiacetate 이온을 포함) 5%의 30 μ를 포함.
    참고: 수 지의이 종류 주로 조직 세포와 신속 하 고 효율적인 방식으로18에서 PCR 준비 DNA의 준비에 대 한 사용 됩니다.
  2. 단계 2.6-2.8로 표시 합니다.
  3. 96-잘 PCR 접시를 봉인 하 고 모든 필터 종이 chelating 수 지 내에서 잠긴 ㄴ 다는 것을 확인 하는 예제를 간단히 원심.
  4. 조직 세포에 대 한 뒤에 10 분 동안 4 ° C에 15 분 동안 95 ° C에서 thermocycler에서 샘플을 열.
    참고:이 단계 동안 수 있습니다 세포와 세포질 분 대를 북극 수 지 구슬의 후속 바인딩 DNA와 RNA 해결책에 남아 있다.
  5. 짧게 원심 작은 수 지 구슬 고 현 탁 액에서 DNA를 샘플.
  6. 3.5-3.6 유전형 절차를 완료 하려면 단계를 따릅니다.

5. 응용 프로그램 1: 다중 PCR Agarose 젤 분석 뒤

  1. 표 1, 다음 설정 다중 PCR 반응 homozygous 돌연변이, heterozygotes, WT 애벌레 사이 차별 활성화. 96-잘 열 cycler를 사용 하 여 표 3에 설명 된 사이클링 조건을 사용 하 여 PCR 반응을 수행.
    참고: PCR 반응 또한 어떤 다른 기존의 PCR 열 cycler에서 수행할 수 있습니다. 이 예제에서는 페 냐, 그 외 여러분 에 의해 사용 되는 PCR 전략을 설명 합니다. aldh7a1 WT 및 같은 다중 반응에서 5 bp 삽입 돌연변이 체 대립 유전자를 확인 9 .
  2. 1 물 나트륨 붕 산 염 버퍼에 1 %agarose 젤 준비 x GelRed.
    참고: 나트륨 붕 산 염 버퍼 재고 x 20이 이루어집니다 10 M NaOH, ddH2O, 1800 mL 40 mL의 pH 8.5 붕의 76 g를 조정 하 고 다음 2 L 최종 볼륨 ddH2o.를 사용 하 여 완료
  3. 1 x 나트륨 붕 산 염 버퍼 250 V에서 15 분 동안에 젤을 실행 합니다. 과정을 촉진 하기 위하여 가능 하다 면, 젤 시스템 샘플 로드 시간을 줄임으로써 더 높은 처리량 기능을 사용 하려면 멀티 채널 pipets와 호환 되는 사용 합니다.
  4. 이미지 다른 genotypes의 차별 수 있도록 자외선 (UV)에서 젤.

6. 응용 프로그램 2: Heteroduplex 분석 결과 용 해

  1. 페이지 12% 젤 1.5 m m 간격 장치 격판덮개 15-샘플 빗을 사용 하 여 준비 합니다. 12.21 mL ddH2O, 트리 스/Borate/EDTA (TBE), 30% 아크릴 아 미드 10 mL, 250 μ x 10의 2.52 mL의 10% 염화 persulfate (AP)를 사용 하 여 두 페이지 젤 준비 및 tetramethylethylenediamine (TEMED)의 20 μ. 1 x TBE 버퍼를 사용 하 여 (0.089 0.089 M 붕 산 및 0.002 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) M Tris HCl) 버퍼를 실행.
  2. 5 분 동안 94 ° C에서 PCR 제품을 열.
  3. 차가운 얼음에 또는 4 ° c.에서 10 분 동안 thermocycler 튜브
  4. PCR 견본 당 10 μ 분자량 마커의 8 μ를 로드 합니다.
  5. 150 V 1 x TBE를 사용 하 여 수직 전기 시스템 1 h 또는 분자량 표식까지 거의 도달 유리 접시의 피트 라인에서 페이지를 실행 합니다.
  6. 이미지 다른 genotypes의 차별 수 있도록 UV 빛에서 젤.

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결과

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protocoll의 효율성 유전형에 의해 입증 되었다 heterozygous 십자가의 자손 (aldh7a1+ ot100, aldh7a1+로 여기 표시) (그림 3A-C)9. Aldh7a1ot100돌연변이 체 대립 유전자에 frameshift와 손실의 기능 때문에 이른 정지 codon9zebrafish aldh7a1 유전자의 첫 번째 코딩 exon 5 기본적인 쌍 (bp) 삽입 합니다. 4 개의 뇌관 WT와 homozygous 돌연변이 (aldh7a1-/-) genotypes heterozygous (aldh7a...

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토론

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편집 도구는 정확 하 게 지난 돌연변이 제 브라에서 transgenes 소개 고용 되었다 유전자 년5,6,,78. 질병 zebrafish에 모델링을 수행할 때 초기 애벌레 또는 젊은 고기는 종종9,12,13,14을 관찰 하 게 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜 설명 3 dpf 어린 애벌레의 유전형을 수 있도록 작은 zebrafish 애벌레 꼬리 생 검에서 PCR 준비 DNA 추출을 합니다. 특히 특별 게시물 유전형 하지 않을 때 가능한

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공개 사항

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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

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저자는 드문 질병 모델과 메커니즘 (RDMM) 네트워크 (캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR) 및 게놈 캐나다에 의해 자금)을 감사 하 고 싶습니다. CK은 UROP 장학금 수상 (오타와의 대학)에 의해 지원 됩니다. DLJ는 Vanier 캐나다 대학원 장학금에 의해 지원 됩니다. IAP는 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR) 박사 후 펠로 십 수상에 의해 지원 됩니다. 저자는 유전학의 미국 협회 권한을 부여에 대 한이 프로토콜을 게시 하 고 페 냐에서 보충 그림 5의 적응을 사용 하 여 감사 외.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
페트리 접시Corning430167
MicroscalpelWorld Precision Instruments500249
StereomicroscopeNikonSMZ1500
Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonateSigma-AldrichE10521
96-well Tissue-culture plateCostar3595
96-well PCR 플레이트피셔14230232
NaOH피셔S25548A 
트리스 베이스 시그마 - 알드리치T1503
NaCl피셔BP358-10
KCl시그마 - 알드리치P3911
MgSO4시그마 - 알드리치230391
5 % Chelex 100 나트륨 형태시그마 - 알드리치C7901
GelRed 1x비오튬41003
붕산시그마 알드리치B6768
Sub-Cell Model 192 시스템Bio-Rad 
30 % 아크릴아미드/비스 용액, 37.5: 1바이오-라드 
1610158 GoTaq 그린 마스터 믹스, 2XPromegaM7123
종이 와이프 (Kimwipes® 일회용 와이퍼)Sigma-AldrichZ188956
1kb-plus 몰레실라 중량 마커 Thermo ScientificSM1343
뉴클레아제 무함유수 Sigma-AldrichW4502
Sub-Cell Model 192 시스템 (고-스루풋 아가로스 젤 시스템)Bio-Rad 
수직 젤 전기영동 시스템 Mini-PROTEAN Tetra Cell 바이오 라드 
170450817045081658004

참고문헌

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