여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
포유류 피 질 흥분 성의 억제 신경, 각각 특정 electrophysiological 및 생 화 확 적인 속성, 시 냅 스 연결의 많은 종류의 구성 그리고 vivo에서 기능, 하지만 그들의 기본 기능과 해 부 조직 세포에서 네트워크 규모를 제대로 이해 하 고 있습니다. 여기 우리는 대뇌 피 질의 세포 조직의 조사에 대 한 두뇌의 큰 영역에 걸쳐 붙일 표시 된 신경 세포의 3 차원 영상에 대 한 메서드를 설명합니다. 특정 유형의 신경 형광 퇴행 성 신경 추적기의 주입 또는 유전자 변형 쥐에 형광 단백질의 식에 의해 표시 됩니다. 블록 뇌 샘플, 예, 반구, 고정 후 준비, 청소 방법, 조직으로 투명 하 게 만들 있으며 형광 immunolabeling는 특정 종류의 세포를 받게. 큰 지역 대형 작업 거리 목표 및 자동화 한 단계 또는 두 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 검색 합니다. 이 메서드는 마우스 피 질에는 셀 형식 관련 microcolumn 기능 모듈의 주기적인 조직을 해결할 수 있습니다. 절차는 다른 복잡 한 조직과 다양 한 뇌 영역에 3 차원 세포 구조의 연구에 대 한 유용할 수 있습니다.
서론
포유류 피 질 세포 유형, 각각 특정 유전자 표현 패턴, electrophysiological 및 생 화 확 적인 속성, 시 냅 스 연결의 많은 수의 구성 및 기능을 vivo에서 1,2 3,,45,,67. 이러한 세포 유형 반복 구조로 구성 됩니다 여부 되었습니다 분명. 시각적인 방향 열과 somatosensory 배럴을 포함 하 여 대뇌 피 질의 열 구조, 반복 하지만 그들의 세포 조직 남아 불분명8,9. 이들은 특정 대뇌 피 질의 영역에 존재 하 고 뇌 전체 시스템을 않습니다.
Neocortical 계층 5, 뉴런의 대다수는 4 개의 주요 유형으로 분류 됩니다. 주요 유형의 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 흥분 성....
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프로토콜
모든 실험 절차 RIKEN와 코 동물 실험 위원회 RIKEN 유전자 재조합 실험 안전 위원회에 의해 승인 되었고 RIKEN 뇌 과학의 동물 시설 기관 지침에 따라 수행 연구소입니다.
1입니다. 이미징 챔버의 준비
-
영상 실19
- 실리콘 고무 시트를 사용 하 여 다양 한 두께의 약 5 m m와 바닥 플레이트의 두께 챔버를 준비 합니다. 또한, 접시와 유리 하단 (그림 1A) 없이 준비 합니다.
-
스페이서를 슬라이스
- 스페이서 두께 0.5 m m (그림 1C)의 실리콘 고무 시트를 사용 하 여 샘플을 준비 합니다.
2. 추적 프로그램 삽입
참고: 폰 (2.1) 또는 우량한 colliculus (2.2)에 주사를 합니다. 우량한 colliculus에 주입 하는 동안 시각 및 모터 지역 등 다양 한 뇌 영역에 폰 레이블 하위....
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결과
우리 /Ai9 유전자 변형 마우스 Tlx3-cre에 tdTomato의 식으로 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런을 표시 하 고 하위 대뇌 프로젝션 뉴런은 폰으로 역행 추적 프로그램 CTB488를 주입 하 여 시각. 두뇌의 왼쪽된 반구 SeeDB 메서드를 복종 되었다 및 물 침수 긴 작동 거리 목표를 갖춘 2 광자 현미경을 사용 하 여 스캔 (25 X, N.A. 1.1 작동 거리 2 m m)와 전동된 스테이지. 401 이미지의 스택 (512 x 512 픽셀; 픽셀 크기 = 0.99 µ m) z-단계 = 2.8 µ m 각 30 검색 위치에서 얻은. 두 종류의 세포 세포 시체 뇌 영역 (그림 6), 그리고 정기 microcolumns (그림 7A)를 보여 광학 섹션의 넓은 범위에 보였다. 또한, Crym egfp 마우스 (C57B.......
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토론
우리는 마우스 neocortical 레이어 5에에서 주요 세포 유형의 셀 형식 관련 조직의 대규모 3 차원 이미지를 얻기 위해 절차를 제시. 기존의 조각 얼룩에 비해, 메서드는 결정 하는 피 질의 3 차원 조직에 더 유용 합니다. 메서드를 사용 하는 더 넓은에서 이미지 수집 그리고 깊은 두뇌 지구 2 광자 현미경 전형적인 vivo에서 또는 전통적인 confocal 현미경 검사 법에 비해, 따라서 neocortical 휴대의 포괄적인 분석을 허용할 수 있다 조직입니다.
방법의 중요 한 단계는 항 체 침투 이다. 항 체의 하위 집합으로 두꺼운 표본 (표 3), 불 쌍 한 침투를 보여줍니다 그리고, 따라서, AbScale 방법에 사용할 수 없습니다. 이 연구에 사용 된 항 체와 균일 한 라벨을 얻기 위해 500 µ m 조각으로 두뇌를 잘라 하는 데 필요한 했다. 작은 항 체 파편, 예를 들어, 팹 F(ab'.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리 감사 미 야와 키 아츠 시와 히로시 하 마 원고, 편집에 대 한 찰스 요코야마 AbScale 실험에 그들의 조언을 에리코 Ohshima 및 그들의 기술 지원에 대 한 미유키 Kishino. 이 작품은 과학적 연구에서 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (MEXT) 일본의 남에 대 한 남 및 연구비 RIKEN에서 연구 자금에 의해 지원 되었다 (혁신적인 지역 "생체 Neurocircuitry"; 22115004)와 S.S. (25890023)입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Crym-egfp 형질전환 마우스 | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre 형질전환 마우스 | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-td토마토 마우스 | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| 실리콘 고무 시트 | AS ONE | 6-611-01 | 0.5mm 두께 |
| 실리콘 고무 시트 | AS ONE | 6-611-02 | 1.0mm 두께 |
| 실리콘 고무 시트 | AS ONE | 6-611-05 | 3.0mm 두께 |
| 페트리 접시 | Falcon | 351008 | |
| 커버 유리 | Matsunami | C022241 | |
| 콜레라 독소 소단위 B(재조합), Alexa Fluor 488 접합체 | Invitrogen | C22841 | |
| 콜레라 독소 소단위 B(재조합), Alexa Fluor 555 접합체 | Invitrogen | C22843 | |
| 콜레라 독소 서브유닛 B(재조합), Alexa Fluor 594 접합체 | Invitrogen | C22842 | |
| 콜레라 독소 서브유닛 B(재조합), Alexa Fluor 647 접합체 | Invitrogen | C34778 | |
| 26 G Hamilton 주사기 | Hamilton | 701N | |
| 주입기 펌프 | Scientific | KDS 310 | Pons 주입 |
| 주입기 펌프 | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| 외과 실크 | Ethicon | K881H | |
| 인큐베이터 | UVP | HB-1000 하이브리드라이저 | |
| 유리 피펫 | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| 전극 풀러 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| 파라핀 액체, 가벼운 | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| 식염수 | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| 텅스텐 바늘 | Inter medical | Φ 0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL 플라스틱 튜브 | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| 이광자 현미경 | Nikon | A1RMP | |
| 침수 긴 작동 거리 대물렌즈 | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2mm | |
| 침수 긴 작동 거리 대물 | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3mm | |
| 전동 스테이지 | COMS | PT100C-50XY | |
| 필터 | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| 필터 | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| 필터 | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| 필터 | Semrock | FF01-629/56 | |
| 필터 | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL 플라스틱 튜브 | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL 플라스틱 튜브 | Eppendorf | ||
| 우레아 | Nacalai 테스크 | 35905-35 | |
| 트리톤 X-100 | Nacalai 테스크 | 35501-15 | |
| Glyserol | 시그마-알드리치 | 191612 | |
| D(-)-소르비톨 | Wako | 191-14735 | |
| 메틸-&베타;-사이클로덱스트린 | 도쿄 화학 공업 | M1356 | |
| γ- 사이클로덱스트린 | Wako | 037-10643 | |
| N-아세틸-L-하이드록시프롤린 | 스킨 에센셜 액티브 | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마-알드리치 | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| 염소 안티 마우스 IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsosbed Secondary 항체, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsobed Secondary 항체, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed secondary 항체, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| 당나귀 항토끼 IgG (H+L) 고도로 교차 흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| 컨포칼 현미경 | Olympus | FV1000 | |
| 침수 장거리 대물렌즈 | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| 안티 파브 알부민 | 시그마 | P3088 | |
| 안티 파브 알부민 | Abcam | ab11427 | |
| 안티 소마토스타틴 | 반도 연구소 | T-4103 | |
| 안티 C-Fos | CalbioChem | PC38 |
참고문헌
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat....
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재인쇄 및 허가
