톨루이 블루 주변 신경 형태학의 평가 대 한 수 지에 포함 된 섹션의 얼룩

요약

여기에 우리가 현재 고 1-2 µ m 섹션 톨루이 블루 얼룩으로 주변 신경의 미세 구조를 시각화 하는 프로토콜

초록

주변 신경와 모터 또는 감각 축 삭 대상 조직 innervating 몸 전체 확장. 때문에 광범위 한 분포, 주변 신경은 자주 외상 또는 질병으로 인해 손상 됩니다. 방법 및 전략 주변 신경 손상 동물 모델, 기능 및 재생, 평가 하기 위해 개발 된 주변 신경의 morphometry 분석 되고있다 필수적인 터미널 결과 측정. 톨루이 블루 얼룩 신경의 크로스 섹션 포함 수 지 신경 섹션에서 얻은 주변 신경, 시각화 형태학 축 삭의 수와의 사용의 질적 및 양적 평가 대 한 재현 방법 myelination입니다. 이 기술은 다른 많은 조직학 방법, 것과 같이 어려울 수 있습니다 학습과 표준 작성 된 프로토콜을 사용 하 여 마스터. 이 간행물의 의도 톨루이 블루 videography 메서드를 사용 하 여 쥐에서 수확 하는 좌 골 신경의와 주변 신경의 얼룩에 대 한 서 면된 프로토콜을 강조 하 그러므로 이다. 이 프로토콜에서 우리 주변 신경 기정 vivo에서 그리고의 조직, 그리고 2% 오스뮴 tetroxide와 후 고정 컬렉션 설명 에폭시 수 지, 그리고 ultramicrotome 신경 1-2 μ m 두께 단면에서 신경의 포함. 신경 섹션 다음 유리 슬라이드에 전송 하 고 후 그들은 양적 및 질적 평가 톨루이 파란색으로 물. 예는 가장 일반적인 문제는 이러한 문제를 완화 하기 위해 단계 뿐만 아니라 표시 됩니다.

서론

주변 신경 모터 또는 감각 축 삭¹대상 조직 innervating 몸 전체 확장. 의료 장애로 인 한 말 초 신경 결함 외상 중요 한 공중 위생 관심사를 대표 하 고 큰 경제적 파급 효과^2,3. 주변 신경 상해의 결과 평가 하 고 신경 재생을 이해에 있는 전진에도 불구 하 고 전통적인 방법 신경 조직학 등 기법을 얼룩이 지는 질적 및 양적 평가 신경 건강에 필수적인 도구 으로 동물 모델 또는 삭제 인간의 조직에 터미널 결과 측정. 이것은 종종 morphometry 기능 신경 재생 않았거나 발생 하지 않은 이유를 밝힐 수 있다 주변 신경 기능의 electrophysiological 측정와 결합 됩니다.

톨루이 블루 이미징 myelinated 신경 섬유, 높은 품질을 제공 하는 전문적인 방법 포함 수 지 주변 신경 반 얇은 섹션의 얼룩이 지 고 신경 구조^{4,5,6의 상세한 이미지를 지우기} . 톨루이 블루 acidophilic metac....

프로토콜

성인 Sprague Dawley 쥐가이 프로젝트에 사용 된 및 모든 절차 와이오밍 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 했다.

1. 수술 및 생체 내 신경 고정

참고: 모든 자료와 장비가이 프로토콜에 대 한 공급 업체 정보 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.

참고: vivo에서 신경 고정 조직을 보존 하 고 죽음의 시간과 신경의 컬렉션 간에 발생할 수 있는 구조적 성능 저하를 줄일 데 사용 됩니다. 조직의 고정 vivo에서 종종이 전조의 관류는 조직학, 신경 조직의 준비에 대 한 표준 연습 이다. 배치 하 고 원래의 장소에 고정을 위한 허용 주변 신경의 크기. 우리가 수집 및 조직 저하의 가능성으로 인해 안락사 후 조직의 정착을 권장 하지 않습니다.

1. 2-3 %isoflurane 유도 챔버에 그것을 배치 하 여 전신 마 취에 대 한 쥐를 준비 다음 마 취 쥐 해 부 매트 위에 발생 하기 쉬운 위치에 놓고 isoflurane 마 취 코 콘을 통해의 1-2%에서 유지 합니다. 마 취의 적절 한 깊이 보장 하기 위해, 뒷 발에 페달 철수에 대 한 ....

결과

수 지 포함 섹션 톨루이와 파란 얼룩이 허용 정확한 조직학 데이터 quantifications 주변 신경. 절차의 개요는 (그림 2)에 표시 됩니다. 좌 골 신경 섹션 수 지 매체에 포함 된 하 고 최적의 해상도 (그림 3) 톨루이 블루 분명 보여준 이미지와 스테인드. 신경 손상이 발생할 수 있습니다 많은 변화 신경에 형태학 상 구조, 예를 들어 신경 섬유, 축 삭 직경에 myelin 칼 집 두께 변화. 이 방법은 총 섬유 직경 (g 비율; 축 삭 직경의 비율 등 여러 매개 변수 측정을 용이 하 게 그것의 자연적인 형태로 신경 구조를 유지할 수 있습니다. 그림 4)입니다. 다양 한 요인 때문에 신경의 부적절 한 처리 섹션에서 균열 (그림 5A)의 존재를 포함 한 최적의 주변 신경 섹.......

토론

주변 신경 손상 및 재생의 형태학 적 구조 시험 연구¹³의 빈번한 주제는. 이 프로토콜에서 우리 조직학 데이터 quantifications 쥐 좌 골 신경 조직 수 지 블록에 포함 된 및 톨루이 파랑 스테인드를 사용 하 여에 대 한 높은 품질의 이미지를 얻을 수 있는 단계를 설명 합니다. 이 기술은 신경 형태학 축 삭의 수, myelination, infiltrative 거리 조직의 존재와 건강 신경의 정도 측정 하 여 신경 재생 수 정량의 이미지를 제공 합니다. 이미지 표시 단면 손상 되지 않은 신경의 처리와 샘플, 동일한 단계 및 재료 부상된 신경에 적용 되는 신경 도관 또는 조직 이식, 재생성 제공 조직의 그 고정은 적절 한^{20, 21}_.

프로토콜의 모든 단계는 필수, 하는 동안 이러한 단계 중 일부를 가난한.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco의 인산염 완충액 식염수	Gibco	14200-075
글루타르알데히드 용액	시그마-알드리치	G6257
파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6148
인산나트륨 일염기성 일수화물	시그마-알드리치	S9638
톨루이딘 블루 O	시그마-알드리치	T3260
나트륨 테트라 보레이트 데카 하이드레이트	Acros 유기물	205950010
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-013-25
에폭시 임베딩 미디엄 키트	Sigma-Aldrich	45359
수산화 나트륨 용액	Sigma-Aldrich	72068	트럼프의 고정액
pH 조정하기 위해 아세톤	피셔 화학 170942
오스뮴 테트록사이드 용액	Sigma-Aldrich	75632
VWR 마이크로 슬라이드, Superfrost Plus	VWR	48311-703
현미경 커버 유리	Fisher Scientific	12545102
Pelco 임베딩 캐스트	Fisher Scientific	NC9671811
유리 나이프 메이커	RMC 제품	GKM-2
초박 절간	RMC Products,	MT-XL
15 mL 원뿔형 튜브	, Falcon	ISO 9001
Eppendorf 1.5 mL 미세 원심분리기 튜브	, Sigma-Aldrich	T9661
4 mL 유리 바이알	, Sigma-Aldrich	854190
면도날	VWR	55411-050	수지 블록 트리밍용
Perfect Loop	전자 현미경 과학	70944	얇은 수지 부분을 집는 데 사용됩니다
트라 글라스 나이프 스트립 6.4 mm x 25 mm x 400 mm	전자 현미경 과학	71012
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Whatman 여과지	Sigma-Aldrich	WHA10010155
3 mL 플라스틱 피펫	Sigma-Aldrich	Z331740
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