톨루이 블루 주변 신경 형태학의 평가 대 한 수 지에 포함 된 섹션의 얼룩

요약

여기에 우리가 현재 고 1-2 µ m 섹션 톨루이 블루 얼룩으로 주변 신경의 미세 구조를 시각화 하는 프로토콜

초록

주변 신경와 모터 또는 감각 축 삭 대상 조직 innervating 몸 전체 확장. 때문에 광범위 한 분포, 주변 신경은 자주 외상 또는 질병으로 인해 손상 됩니다. 방법 및 전략 주변 신경 손상 동물 모델, 기능 및 재생, 평가 하기 위해 개발 된 주변 신경의 morphometry 분석 되고있다 필수적인 터미널 결과 측정. 톨루이 블루 얼룩 신경의 크로스 섹션 포함 수 지 신경 섹션에서 얻은 주변 신경, 시각화 형태학 축 삭의 수와의 사용의 질적 및 양적 평가 대 한 재현 방법 myelination입니다. 이 기술은 다른 많은 조직학 방법, 것과 같이 어려울 수 있습니다 학습과 표준 작성 된 프로토콜을 사용 하 여 마스터. 이 간행물의 의도 톨루이 블루 videography 메서드를 사용 하 여 쥐에서 수확 하는 좌 골 신경의와 주변 신경의 얼룩에 대 한 서 면된 프로토콜을 강조 하 그러므로 이다. 이 프로토콜에서 우리 주변 신경 기정 vivo에서 그리고의 조직, 그리고 2% 오스뮴 tetroxide와 후 고정 컬렉션 설명 에폭시 수 지, 그리고 ultramicrotome 신경 1-2 μ m 두께 단면에서 신경의 포함. 신경 섹션 다음 유리 슬라이드에 전송 하 고 후 그들은 양적 및 질적 평가 톨루이 파란색으로 물. 예는 가장 일반적인 문제는 이러한 문제를 완화 하기 위해 단계 뿐만 아니라 표시 됩니다.

서론

주변 신경 모터 또는 감각 축 삭¹대상 조직 innervating 몸 전체 확장. 의료 장애로 인 한 말 초 신경 결함 외상 중요 한 공중 위생 관심사를 대표 하 고 큰 경제적 파급 효과^2,3. 주변 신경 상해의 결과 평가 하 고 신경 재생을 이해에 있는 전진에도 불구 하 고 전통적인 방법 신경 조직학 등 기법을 얼룩이 지는 질적 및 양적 평가 신경 건강에 필수적인 도구 으로 동물 모델 또는 삭제 인간의 조직에 터미널 결과 측정. 이것은 종종 morphometry 기능 신경 재생 않았거나 발생 하지 않은 이유를 밝힐 수 있다 주변 신경 기능의 electrophysiological 측정와 결합 됩니다.

톨루이 블루 이미징 myelinated 신경 섬유, 높은 품질을 제공 하는 전문적인 방법 포함 수 지 주변 신경 반 얇은 섹션의 얼룩이 지 고 신경 구조^{4,5,6의 상세한 이미지를 지우기} . 톨루이 블루 acidophilic metachromatic 얼룩, 1856⁷, 윌리엄 헨리 Perkin에 의해 발견 이며 여러 의료 응용 프로그램⁸에서 사용 되었습니다. 톨루이 블루 스테인드 주변 신경 섹션 수 지 포함 신경 세그먼트에서 얻은 신경 구조의 명확한 시각화 수 있습니다. Myelin 칼 집 구조 시각화 오스뮴 tetroxide 후 고정^4,9를 사용 하 여 향상 될 수 있습니다. 오스뮴 tetroxide은 독성 산화 제와 지질 통 에이전트 지질에 이중 결합 상호 작용 starkly 정의 된 지질이 풍부한 myelin 칼 집¹⁰인. 그러나, 오스뮴 tetroxide 독성, 비싼, 더 이상 외피 신경 세그먼트의 필요 이며 항상 사용 되지 않습니다.

주변 신경 형태학;의 시각화에 대 한 처리 및 얼룩의 대체 방법은 개발 되었다 파라핀, 극저온 단면, 에폭시 수 지에 포함 된 신경 단면 다음 톨루이 파랑 얼룩 또는 phenylenediamine 솔루션 주변 신경 재생 ^{11,12의 형태학 적 변화를 측정 하는 데 사용 되었습니다.} . 이러한 각 메서드는 그들의 이점 및 수율 필수 데이터 축 삭, 수 초 두께, 축 삭 직경 및 myelinated 섬유 직경 (g 비율) ^{11,,1314,15 축 삭 직경의 수에} .

수 지 포함이 프로토콜의 기본 구분은 그것 신경의 조직학 품질을 유지 하면서 1-2 μ m 두께 횡단면 때문에 수 지의 경도 얻기 용이 합니다. 이러한 얇은 섹션 포함, 파라핀에서 얻은 4-5 μ m 두께 섹션 반대로 주변 신경 축 삭 myelination, g-비율, 수 없는 등의 보다 정확한 정량화에 대 한 높은 해상도 섹션 제공 두꺼운 섹션¹⁶에서 얻은. 극저온 단면 1-2 µ m 섹션을 얻기 위해 사용할 수 있는, 그것은 우리의 경험 그것은 수많은 큰 균열 없이 섹션을 얻기 위해 더 어려운 되었습니다. 같은 금이 섹션 축 삭의 수 및 myelination의 측면의 부정확 한 계산을 발생할 수 있습니다.

톨루이 블루¹⁷얼룩, 뿐만 아니라 방법¹⁸ 과 Masson의 trichrome 얼룩⁴ 얼룩은 또한 신경 축 삭 표시를 사용할 수 있습니다. 그러나 반면 톨루이 블루 얼룩 지우기 myelin 칼 집 이미지 그리고 쉽게 중 되며 오신 또는 Masson의 trichrome 보였다 희미 한 myelin 칼 집 및 인식할 수 없는 구조, 스테인드 수 지 쥐 중간 신경 섹션의 포함을 사용 하 여 정량된⁴수 있습니다. 몇 가지 한계에도 불구 하 고 톨루이 블루 얼룩 포함 된 수 지의 주변 신경 신경 형태학의 고해상도 이미지는 필요한 경우 사용할 수 있는 유용한 기술입니다.

수 지를 포함에 대 한 주요 단점은 그것은 시간이 많이 걸리는 이며 파라핀 및 냉동된 임베디드 섹션 기술에 비해 항 원 복구의 어려움으로 인해 같은 조직의 immunostaining에 대 한 허용 하지 않습니다. 따라서, 일반적으로 수 지-톨루이 블루 얼룩에 대 한 포함을 통해 처리 되는 immunostaining에 대 한 동일한 조직 활용 수 아니다. 비록 하지 immunohistochemistry 바란다면 여기, 사용 수 지에 포함 된 섹션, 글리콜 메타 크 릴 산 수 지를 포함의 사용 허용 immunohistochemistry 조직 섹션에서 수행할 수 있지만 그것은 상대적으로 비싼¹⁹. 이 고정 후 직접 별도 세그먼트, 수 지를 포함에 대 한 일부 및 immunostaining에 대 한 다른 사람으로 말 초 신경 절단 하 여 다소 완화 될 수 있습니다.

톨루이 블루 수 지 얼룩이 지기의 과정으로 가장 histopathological 분석, 나눌 수 있습니다 5 단계, 고정, 탈수를 포함 하 여, 포함, 단면, 그리고²⁰얼룩으로 주변 신경, 임베디드. 우리 하고자 여기 톨루이 얻으려고 블루 높은 품질의 이미지와 함께 포함 된 쥐 좌 골 신경 섹션 스테인드 수 지를 사용 하기 위한 프로토콜 및 실용적인 지침을 제공 합니다.

프로토콜

성인 Sprague Dawley 쥐가이 프로젝트에 사용 된 및 모든 절차 와이오밍 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 했다.

1. 수술 및 생체 내 신경 고정

참고: 모든 자료와 장비가이 프로토콜에 대 한 공급 업체 정보 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.

참고: vivo에서 신경 고정 조직을 보존 하 고 죽음의 시간과 신경의 컬렉션 간에 발생할 수 있는 구조적 성능 저하를 줄일 데 사용 됩니다. 조직의 고정 vivo에서 종종이 전조의 관류는 조직학, 신경 조직의 준비에 대 한 표준 연습 이다. 배치 하 고 원래의 장소에 고정을 위한 허용 주변 신경의 크기. 우리가 수집 및 조직 저하의 가능성으로 인해 안락사 후 조직의 정착을 권장 하지 않습니다.

1. 2-3 %isoflurane 유도 챔버에 그것을 배치 하 여 전신 마 취에 대 한 쥐를 준비 다음 마 취 쥐 해 부 매트 위에 발생 하기 쉬운 위치에 놓고 isoflurane 마 취 코 콘을 통해의 1-2%에서 유지 합니다. 마 취의 적절 한 깊이 보장 하기 위해, 뒷 발에 페달 철수에 대 한 동물을 테스트 하 고는 법 눈으로 눈에서 종을 반사의 부재에 대 한 확인 합니다.
   참고: 마 취 제의 복 주입 흡입된 isoflurane에 일반적으로 사용 되 대안 이다.
2. 좌 골 신경, 노출 하는 hind limb(s)의 머리를 면도 하 고 70% 에탄올과 면도 영역을 청소. 메스와가 위, 큰 trochanter까지 무릎에서 뒷 다리 따라 피부에 2-3cm 절 개를 하 게 어디 절 개의 적절 한 위치를 보장 하기 위해 살 균 메스를 사용 하 여 대 퇴 골의 촉진. 대 퇴 골은 그냥 근 좌 골 신경의 가장 접근 가능한 세그먼트에 위치 합니다. 비록이 아닌 생존 수술, 무 균 기법을 유지 합니다.
3. 피부 절 개 후, 팔 뚝 femoris 근육과 대 둔 근 근육 사이 비행기 찾아서 서가 위를 사용 하 여 기본 근 막 분리 및 밑줄 좌 골 신경의 2-3 cm를 노출 합니다. 좌 골 신경의 명확한 섹션 노출, 두 근육 (그림 1A) 사이의 격차를 확대 하는 견인을 사용 합니다. 좋은 집게와 아이리스가 위, 결합 조직, 압축 또는 신경을 잘라 큰 돌 주변에서 신경 분리 신중 하 게.
4. 충분 한 트럼프의 정착 액 (4% 포름알데히드, NaH2PO4·의 1.16 g 1 x PBS (인산 염 버퍼 식 염 수)에서 1%도 추가 100 mL 당 H2O) 포함 하는 신경을 커버 하 고 10 분 동안 앉게 하 노출된 신경 구멍으로. 더 많은 정착 액 캐비티에 추가할 수 있도록 각도 개선 하기 위해 필요한 장소 거 즈는 뒷 다리 아래 다리 경우. 10 분 후에 정착 액을 제거 하 고 두 번 이상이 단계를 반복.
5. 해 현미경을 사용 하 여 정밀한 해 부가 위, 스트레칭 또는 좌 골 신경 핀치를 하지를 사용 하 여 양쪽에서 신경 자르고 즉시 신경 섹션 변경 1 주일에 4 ° C에서 트럼프의 정착 제를 포함 하는 15 mL 튜브에 넣고는 정착 액 모든 48 h입니다.
6. 두지 마십시오 동물 무인 수술의 일부. 신경의 제거 후, 마 취하에 자 궁 경부 전위에 의해 동물을 안락사.

2. 오스뮴 Tetroxide 치료 및 수 지 포함

1. 고정 게시, 신중 하 게 모든 나머지 지방과 결합 조직 신경에서 제거 하 고 날카로운 메스를 사용 하 여 세그먼트 길이 (신경 세그먼트 구분 될 수 있으며 다른 튜브에 표시)에 약 5 mm 신경을 잘라. 신선한 2% 오스뮴 tetroxide 트럼프의 통 솔루션에 희석을 준비 하 고 유리 튜브에 계속. 시간이 짧은 기간에 대 한 플라스틱 튜브에 있을 수 있는 2 시간에 대 한 2% 오스뮴 tetroxide 신경 세그먼트를 담가.
   참고: 일부 플라스틱 튜브 오스뮴 tetroxide 플라스틱 튜브에의 장기간된 보관 권장 하지 않습니다 그래서 솔루션, 어둡게 일으키는 오스뮴 tetroxide와 반응.
2. 매체 키트를 포함 하는 에폭시를 사용 하 여 최종 포함 수식을 준비:
   1. DDSA 솔루션 (dodecenylsuccinic 무수 물, 혼합물 A) 매체를 포함 하는 에폭시를 혼합 하 고 혼합 NMA 솔루션 (methylnadic 무수 물, 혼합물 B) 매체를 포함 하는 에폭시. A와 B는 자력으로 교 반에 의해 적어도 20 분을 섞어 두 혼합물을 하자.
   2. 사용 직전 혼합 A와 B를 혼합 하 고 추가 가속기 DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) 혼합물의 총 볼륨의 1.5 ~ 2.0%의 비율에. Note DPM 30 솔루션 어두운 색상 및 취 성 되는 블록을 방지 하기 위해 정확 하 게 측정 되어야 한다. 모든 수 지 화학 물질이 독성; 피부 접촉 또는 흡입을 방지 하기 위해 여분의 주의 분리 했습니다.
3. 1.5 mL 튜브를 사용 하 여 PBS 가진 신경 세그먼트를 세척 하 고 다른 아세톤/증 류 물 구절에 신경 세그먼트를 배치 하 여 탈수 과정을 시작: 30%, 60%, 90%, 10 분 각, 다음 3 시간 10 분 대 한 100% 아세톤에 농도.  Note는 에탄올 아세톤 대신 사용 될 수 있다.
4. 수 지 침투에 대 한 배치 최종 포함 혼합물의 1 개 부품의 혼합물에서 신경 세그먼트 및 최종 포함 혼합물의 2 개 부품의 혼합물 및 30 분 1 부분 100% 아세톤에서 30 분, 1 부분 100% 아세톤 및 장소 신경 세그먼트는 마지막에 30 분을 위한 혼합물을 포함 하는 마지막으로.
5. 실리콘 고무 금형 포함으로 신경 세그먼트를 넣어 (우리 x 7 mm 깊이 x 71 mm 폭 106 m m 길이 사용 하는, 크기 11 m m 길이 6 m m 폭 3 mm 깊이 x x 차단). 부드럽게 전체 신경 세그먼트를 커버 하 고 기포를 만들기 방지 하는 신경 위에 수 지를 추가 합니다. 60 ° C에서 하룻밤 유해를 수 지로 신경 세그먼트를 포함 하는 금형을 둡니다.

3. Ultramicrotome에 의해 단면

1. 유리 칼은 유리 칼 메이커 (그림 1B)를 사용 하 여 준비 하 고 보트 (그림 1C), 증 류 된 물에 떠 있는 신경 섹션을 수집 하는 데 사용 되는 유리 칼.
2. 포함 된 수 지 신경 블록을 사다리꼴 면이 위로 향하도록 ultramicrotome 홀더에 넣으십시오. 주변 신경 조직을 어떤 과잉 수 지 트림 ultramicrotome 범위를 사용 하 고 블록 사다리꼴 모양 얼굴 그리고 면도날 같은 단일 깨끗 블레이드를 사용 하 여 가능한 신경의 경도 표면에 가까이. 오스뮴 tetroxide에 의해 그것의 어두운 얼룩에 의해 인식할 수 있는 신경 세그먼트의 경도 표면을 침투 하지 않습니다.
   참고: 과잉 수 지의 조정 구분 될 블레이드 성능 및 후속 단계에 절단을 개선 하는 수 지의 영역을 줄이는 것입니다.
3. ultramicrotome를 사용 하 여 여러 횡단면 일반 유리 칼을 사용 하 여 신경 직물의 일정 한 횡단면 표면 노출 하기에 충분 한 확인 합니다. 이 완료 되 면, 그의 보트는 상 온에서 증류수 가득 유리 칼으로 전환 하 고 얇은 섹션을 1-2 μ m ultramicrotome 조정 합니다.
4. 금속 루프 (그림 1D)를 사용 하 여 유리 슬라이드에 유리 칼 보트에서 이온된 물 한 방울 떠 있는 얇은 섹션을 전송. 섹션을 과열 하지 않도록 하는 몇 초 동안 화 염에 여러 번 전달 하 여 섹션을 포함 하는 슬라이드를 건조. 톨루이와 즉시 건조 섹션 블루 얼룩 또는 얼룩 전에 몇 일 동안 실내 온도에 저장.
   참고: 섹션 수 있습니다 또한 건조 15 분 동안 60 ° C에서 따뜻한 접시를 사용 하 여. 느린 건조 과정 섹션 부드러운 게.

4. 톨루이 블루 얼룩

1. 2g의 나트륨 붕 산 염 이온을 제거 된 물 100 mL에 용 해 하 여 톨루이 블루의 1% 솔루션 준비 다음 톨루이 블루의 1 g을 추가 하 고 해산 때까지 휘저어. 필터 종이 사용 하 여 솔루션을 필터링 (기 공 크기: 11 µ m) 최대 2 주 동안 실내 온도에 불투명 한 병에 솔루션을 계속 하 고.
2. 플라스틱 피 펫 또는 마이크로 pipettor 사용 하, 신경 섹션 상단 톨루이 블루 솔루션의 한 방울을 추가 하 고 20-30 s에 대 한 둡니다.
3. 부드럽게 찍기 이온된 물 항아리에 슬라이드에 의해 초과 모든 톨루이 블루 솔루션에서 헹 구 고 섹션 분명 때까지 3-4 회 반복. 슬라이드에 15 분 또는 60 ° C에서 하룻밤 실 온에서 건조 하 고 섹션 coverslip 일반 설치 매체를 사용 하 여 커버. 탑재 된 슬라이드를 즉시 검사 하거나 상 온에서 저장 합니다.
4. 가벼운 현미경 검사. 100 X 기름 침수 렌즈 g-비율을 계산 하는 데 사용 하는 자세한 이미지에 대 한 것이 좋습니다.

결과

수 지 포함 섹션 톨루이와 파란 얼룩이 허용 정확한 조직학 데이터 quantifications 주변 신경. 절차의 개요는 (그림 2)에 표시 됩니다. 좌 골 신경 섹션 수 지 매체에 포함 된 하 고 최적의 해상도 (그림 3) 톨루이 블루 분명 보여준 이미지와 스테인드. 신경 손상이 발생할 수 있습니다 많은 변화 신경에 형태학 상 구조, 예를 들어 신경 섬유, 축 삭 직경에 myelin 칼 집 두께 변화. 이 방법은 총 섬유 직경 (g 비율; 축 삭 직경의 비율 등 여러 매개 변수 측정을 용이 하 게 그것의 자연적인 형태로 신경 구조를 유지할 수 있습니다. 그림 4)입니다. 다양 한 요인 때문에 신경의 부적절 한 처리 섹션에서 균열 (그림 5A)의 존재를 포함 한 최적의 주변 신경 섹...

토론

주변 신경 손상 및 재생의 형태학 적 구조 시험 연구¹³의 빈번한 주제는. 이 프로토콜에서 우리 조직학 데이터 quantifications 쥐 좌 골 신경 조직 수 지 블록에 포함 된 및 톨루이 파랑 스테인드를 사용 하 여에 대 한 높은 품질의 이미지를 얻을 수 있는 단계를 설명 합니다. 이 기술은 신경 형태학 축 삭의 수, myelination, infiltrative 거리 조직의 존재와 건강 신경의 정도 측정 하 여 신경 재생 수 정량의 이미지를 제공 합니다. 이미지 표시 단면 손상 되지 않은 신경의 처리와 샘플, 동일한 단계 및 재료 부상된 신경에 적용 되는 신경 도관 또는 조직 이식, 재생성 제공 조직의 그 고정은 적절 한^{20, 21}_.

프로토콜의 모든 단계는 필수, 하는 동안 이러한 단계 중 일부를 가난한...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco의 인산염 완충액 식염수	Gibco	14200-075
글루타르알데히드 용액	시그마-알드리치	G6257
파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6148
인산나트륨 일염기성 일수화물	시그마-알드리치	S9638
톨루이딘 블루 O	시그마-알드리치	T3260
나트륨 테트라 보레이트 데카 하이드레이트	Acros 유기물	205950010
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-013-25
에폭시 임베딩 미디엄 키트	Sigma-Aldrich	45359
수산화 나트륨 용액	Sigma-Aldrich	72068	트럼프의 고정액
pH 조정하기 위해 아세톤	피셔 화학 170942
오스뮴 테트록사이드 용액	Sigma-Aldrich	75632
VWR 마이크로 슬라이드, Superfrost Plus	VWR	48311-703
현미경 커버 유리	Fisher Scientific	12545102
Pelco 임베딩 캐스트	Fisher Scientific	NC9671811
유리 나이프 메이커	RMC 제품	GKM-2
초박 절간	RMC Products,	MT-XL
15 mL 원뿔형 튜브	, Falcon	ISO 9001
Eppendorf 1.5 mL 미세 원심분리기 튜브	, Sigma-Aldrich	T9661
4 mL 유리 바이알	, Sigma-Aldrich	854190
면도날	VWR	55411-050	수지 블록 트리밍용
Perfect Loop	전자 현미경 과학	70944	얇은 수지 부분을 집는 데 사용됩니다
트라 글라스 나이프 스트립 6.4 mm x 25 mm x 400 mm	전자 현미경 과학	71012
100 와트 오븐	Millipore
Whatman 여과지	Sigma-Aldrich	WHA10010155
3 mL 플라스틱 피펫	Sigma-Aldrich	Z331740
Micro-surgical Kit	세계 정밀 기기
Olympus 형광 현미경			듀얼 CCD 컬러 및 흑백 카메라, DP80