방법 논문

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

DOI:

10.3791/58034

⸱

2018년 8월 16일

 ,  , 
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery, Houston Methodist Research Institute

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서 결합 해리 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 뉴런에 대 한 재현 방법에 설명 하 고 이다 3D에 범위 cocultures, 무료 부동 조건, 그리고 이후 이러한 분야를 유지 하 immunoanalysis와 multielectrode 배열 녹음 분야의 측정 시 냅 스 회로 활동.

초록

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시 냅 스 회로 기능에 기여 하는 다양 한 세포 유형 및 신호에 대 한 우리의 이해에 방 벽은 인간의 뇌 연구 관련 모델의 부족 이다. 이 문제를 해결 하려면 한 신흥 기술을 3 차원 (3D) 신경 세포 배양, 'organoids' 또는 'spheroids', extracellular 접착 분자를 포함 하 여 세포 상호 작용의 장기 보존에 대 한 나의 사용 이다. 그러나, 이러한 문화 시스템은 시간 소모 하 고 체계적으로 생성 된. 여기, 우리 신속 하 고 지속적으로 신경의 3D cocultures을 생산 하는 방법에 자세히 설명 하 고 인간 만능에서 이다 줄기 세포. 첫째, 미리 차별화 이다 신경 창시자는 해리와 계산. 다음으로, 셀 영역을 형성 결합 되어 요리로 키 니 아 제 억제제와 재현 크기의 구체를 생산 하는 특정 비율에. 몇 주 후 문화의 부동 구체로, cocultures ('소행성') 마지막으로 immunostaining에 대 한 구분 또는 시 냅 스 밀도 강도 측정 하는 multielectrode 배열에 따라 도금. 일반적으로,이 프로토콜 표시 성숙한 세포 유형 제한 표식, 기능 시 냅 스를 형성 하 고는 자발적 시 냅 스 네트워크 버스트 활동 전시 3D 신경 분야를 얻을 것입니다 예상 된다. 함께,이 시스템 단층 문화에 비해 더 적합 한 모델에서 약물 검사와 질병의 메커니즘에 대 한 조사를 허용 합니다.

서론

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이다는 구조 지원 이상 기능적인 책임의 다양 한 중앙 신경 시스템 (CNS) 내에서 매우 풍부한 glial 세포 유형입니다. 수용 성 synaptogenic 요인의 세포 외 기질 (ECM) 분 비를 통해 이다 설립 및 개발1동안 성숙한 시 냅 스의 클러스터링에 도움이. 그들은 또한 건강과 extracellular 신호2,3,,45, 시 냅 스의가 소성 유지에 중요 한 역할을 하 고 항상성의 장기 안정성을 세포 외 칼륨과 조미료, 뿐만 아니라 에너지 기질과 ATP6,,78의 분 비를 조절 하 여 환경. 마지막으로, 그들은9, extrasynaptic 전류 영향을 미치는 의해 neurotransmission에 기여할 수 있는 고 수 직접 다른 세포 유형 myelination10홍보 등을 통해 활동 영향. 중요 한 것은, 비정상적인 또는 이다의 부전 이어질 수 많은 neurodevelopmental 증후군 성인 neuropathology, 이므로 개선에 대 한 순서로 함께 설계 된 신경망에서 뉴런 이다를 포함 하는 명백한 필요가 내 생 두뇌 환경 모델입니다. 이다의 필수적인 특성 신경 시 냅 스1,,1112양식 동적 상호 작용을 그들의 능력입니다. 명과의 부재에서 신경 시 냅 스, 일반적으로 또한 기능 성숙13부족의 제한 된 수를 형성 한다.

인간의 이다 표시, transcriptional, 형태학 및 기능적 특성-분기, 뿐만 아니라 종의 유전자의 증가 크기와 복잡성 등-는 설치류12,14에 지 하지는 15. 그 결과, 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC)를 활용 하 여 연구-파생된 신경 세포 소설 치료, 부상, 모델과 문화 패러다임16 개발 하는 동안 생체 외에서 CNS 관련 질병 검사의 수단으로 널리 수용 되는 ,17. 또한, hPSCs 인간 시 냅 스 형성 및 기본 조직18,19에 대 한 필요 없이 기능 연구를 허용합니다.

시 냅 스 회로 기능에 기여 하는 다양 한 세포 유형 및 신호에 대 한 우리의 이해에 방 벽은 인간 두뇌의 관련 모델의 부족 이다. 높은 정확도와 재현성의 시 냅 스 네트워크를 정리 하는 적절 한 플랫폼에 대 한 필요가 있다. 최근, 관심 3D 문화 시스템의 생산에서 나왔다 ('organoids,'로 널리 알려진 'spheroids,' 또는 '미니 두뇌') 휴대 및 매크로 수준에서 구조 하는 복잡 한 3 차원 (3D)를20 . 3D 문화 시스템은 일반적으로 결 석 하 또는 제한 된 일반적인 2D coculture 패러다임21,22동안 ECM 및 셀 상호 작용을 유지 합니다. 기술의 풍부한 3D 신경 spheroids23,,2425; 경작에 대 한 존재 그러나, 많은 긴 문화 기간 필요 (년 개월) 자연 개발 및 레이어 보존, 사용자 아주 작은 제어할 출력 전시.

여기, 우리가 설명 하는 체계적인 방법을 빠르게 하 고 지속적으로 여러 세포 유형 (사전 차별화 된 뉴런을 이다) 간의 bioengineer 신경 상호 작용 영역 cocultures ('소행성')26으로 셀을 조립 하 여 hPSCs에서 파생 된 는 정리 차원에서 인간의 특정 형태학 복잡. 이 고밀도 신경 시스템 균등 하 게 분산 된 신경 하위 시간이 지남에 성숙한 속성에 걸릴 하 고 상영 하거나 높은 처리량 방식에서 분석을 생성 합니다. 처음으로 인간의 이다 이러한 3D cocultures에서 시 냅 스 네트워크 버스트 활동 유도 대 한 설명 합니다. 또한,이 프로토콜은 다른 크기, CNS의 다른 지역 id에 지정 된 셀을 사용 하 고 여러 다른 종류의 세포로 원하는 상호 작용을 공부 하는 분야를 생성에 쉽게 적응.

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프로토콜

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1. 세포 문화 및 시 약 준비

참고:이 섹션에서는 프로토콜은 분화 프로토콜 (제 2)에 표시 되는 순서에 따라 작성 됩니다. 재료와 카탈로그 번호에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.

  1. 세포 배양에 대 한 코팅된 접시를 준비 합니다.
    1. 세포 외 기질 (ECM) 코팅 솔루션 DMEM/F12 미디어 준비 1 mg/mL 재고 솔루션을 희석. Aliquot 희석된 ECM 솔루션 3 mL의 30 원뿔 관으로 재고 및 즉시-20 ° C에 저장 작업 솔루션에 대 한 80 µ g/mL의 농도 대 한 36 ml 전체 볼륨을 데리고 미리 냉장된 DMEM/F12 미디어의 33 mL에 ECM 주식의 3 mL을 resuspend.
    2. ECM 작업 솔루션 6-잘 셀 문화 판의 잘 당 1 mL 코트. 우물의 표면 완전히 포함 되도록 잘 당는 추가로 1 mL DMEM/F12 (필요한 경우) 추가 합니다. 코팅된 6 잘 세포 배양 배지를 사용 하기 전에 적어도 1 시간 동안 실내 온도에 앉아 수 있습니다.
      참고: 코팅된 접시 수 있습니다 또는 저장 됩니다 인큐베이터에 4 ° C에서 최대 2 주 동안.
  2. 미디어 공식, 성장 요인, 그리고 작은 분자를 준비 합니다.
    1. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC) 중간27의 500 mL를 준비 하려면 20 배와 제조 업체의 지침에 따라 500 x 보충을 추가 합니다.
    2. 신경 매체 (NM)의 500 mL를 준비 하려면 이전 상세한282 mg/mL의 최종 농도, 1 x 항생제/antimycotic 솔루션, 1 x B27 보충 또는 L-글루타민 보충과 DMEM/F12의 500 mL 병 1 x N2 보충의 헤 파 린을 추가 합니다.
    3. 10 m m를 준비 하기 (1, 000 x) 솔루션으로 키 니 아 제 억제 물 Y27632 (Y)의 재고, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 3 mL에 분말의 10 mg을 추가. 필터 소독, 약 수, 고-20 ° c.에 저장 미디어에 10 µ M 작업 농도에 사용 합니다.
    4. 준비는 20 m m (10, 000 x) 재고 SB431542의 솔루션, 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 1.3 mL에 분말의 10 mg을 추가. 준비 2 m m (1, 000 x) DMH1의 솔루션을 재고, DMSO의 13.1 mL에 분말의 10 mg을 추가. 필터-20 ° c.에 각 솔루션을 저장 하 고 소독, 약 수, 2 µ M 작업 농도에서 각각를 사용 하 여 미디어 (NM + SB431542 + DMH1).
      참고:이 프로토콜 권장 두 SB431542의 2 µ M 작업 농도 및 DMH1에 따라 우리의 관찰과 다른 사람들 로부터 보고서29 이 농도 효과적으로 hPSCs에서 신경 유도 촉진 한다는. 높은 농도 보고30도 있다. 또한, 대안 미디어, 그것은 또한 표시 되었습니다 작은 분자는 높은 신경 변환31에 대 한 필요 하지 않습니다. 따라서, 작업 농도 대체 셀 문화 환경에 따라 달라 집니다 그리고 최적 농도 개별 연구자에 의해 시험 되어야 한다.
    5. 개별 100 µ g/mL를 준비 (10, 000 x) 표 피 성장 인자 (EGF) 섬유 아 세포 성장 인자-2 (FGF2)의 재고 솔루션 추가 PBS + 0.1 %BSA 10 mL에 각각의 1 밀리 그램. Aliquot EGF와 FGF2 50 µ L aliquots에 솔루션을 재고-80 ° c.에 저장 10 ng/mL 작업 농도에서 각각을 사용 하 여 미디어; 예를 들어, 추가 5 µ L EGF와 5 µ L FGF2 NM (NM + EGF + FGF2) 50 mL를.
    6. Doxycycline 염 (Dox)의 재고 솔루션을 준비, 먼저 파우더 100 mg/mL를 DMSO에 녹을-20 ° c.에 저장 추가 2 mg/mL를 만들기 위해 그것을 희석 (1, 000 x) PBS에-20 ° c.에서 저장소 솔루션을 재고 미디어; 2 µ g/mL 작업 농도에서 사용 예를 들어, 추가 50 µ L Dox NM (NM + Dox) 50 mL를.
      참고:는 다시 녹고 후 솔루션을 고정 하지 마십시오.

2. 인간 유도 만능 세포 (hPSCs)에서 신경의 생성

참고: 모든 셀 문화는 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 유지 되어야 한다 저수준 활용 될 수 있습니다 있지만 이러한 문화 방 산소 수준에서 유지 됩니다.

  1. 생성 하 고 hPSCs에서 사이토 창시자 (hAstros)를 유지 합니다.
    참고:이 섹션에서는 간단한 및 단순화 된 분화 프로토콜. (Embryoid 몸 형성, 장미 선택과 지역 모방 단계) 자세한 내용은 앞에서 설명한 프로토콜28 (그림 1A, 곳곳에 녹색 상자)을 참조 하십시오.
    1. 씨 잘 당 hPSC 매체 + Y 2 mL와 ECM 코팅 6 잘 플레이트 (단계 1.1 참조)에 (그림 1B) hPSCs의 클러스터. 줄기 세포를 약 50 %confluent 하 고 필요에 따라 분할 될 때까지 매일 피드.
      1. HPSCs 분할, 웰 스에 뿌리고 약 1 mL을 추가 하 고 5 분 동안 실내 온도에 1 분 품 셀 hPSC 매체의 1 mL에 추가 하 고 집계 1:10 잘 당 hPSC 매체 + Y 2 mL에 새로운 ECM 코팅 우물에 분할 발음.
    2. 때까지 그들은 약 50% 합칠 다음 변경 미디어 NM + SB431542 + DMH1 신경 차별화 (0 일)를 유도 하는 줄기 세포를 유지 합니다. 세포의 약 95%는 때 합칠, 동일한 매체의 새로운 ECM 코팅 웰 스 1:6 분할.
    3. 14 일에 초연 솔루션 및 집계의 형성을 촉진 하는 y-코팅 플라스 크에 세포 분열.
      참고: Y의 추가 하지만 세포 생존 및 구체 형성 촉진을 활용 모든 피드 동안 포함 되지 않습니다.
    4. 아래 설명 된 대로 신경 창시자와 뉴런 (hNeurons)의 생성에 대 한이 하루 14 셀을 사용 합니다. 또는 신경 성숙 발생 또는 gliogenesis 개시 전에 단층 또는 구체 문화에서 나중 시간 지점에서 이러한 셀을 사용 합니다.
      참고: 기본적으로이 프로토콜 등 대뇌 피 질의 이다 생산. 그러나, 사이토 하위 지역 morphogens28,,3233바란다면 패턴의 추가 의해 지정할 수 있습니다. Retinoic 산 (RA) 척수로 셀 caudalize 하 고기, 소닉 더 헤지호그 (SHH), 동안 흐려져 주 작동 근 (SAG), 또는 purmorphamine 복 부 고기를 생산할 예정 이다 추가할 수 있습니다.
    5. 사이토 창시자 이다 자발적으로 형성 된 3 차원 집계 (hAstrospheres)의 생성에 대 한 NM + EGF + FGF2 전환 하 고 이전 상세한34로 매주 (또는 pH를 안정 되도록 필요한)를 공급 합니다.
      1. 때 어두운 센터 표시 되 고 자연스럽 게 연결 하는 분야를 제거 부드럽게 분리 솔루션 hAstro 집계 해리. 휴식 영역 부드럽게 일주일에 한 번 구 건강을 유지 하 고 괴 사 성 코어를 피하기 위해.
        참고: 분리 솔루션 치료의 5 분을 초과 하지 마십시오.
      2. 확장의 4-6 개월을 확인 한 후 셀 정체성을 동결 (제조 업체의 지침)에 따라 cryopreservation 매체 또는 대체 스토리지 장기 보존을 위한 조건 액체 질소, 또는 즉시 사용 실험입니다.
    6. HAstrospheres의 냉동된 주식, 해 동 신속 하 게 전송 콘텐츠는 빈 15 mL 원뿔 튜브, 그리고 1 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기를 신중 하 게 상쾌한 발음, DMEM/F12로 씻어 두 세척의 총에 대 한 반복, 실내 온도에 유리병을 녹여 단계입니다. T25 플라스 크의 NM + EGF + FGF2 Y의 6 mL 전체 볼륨을 추가 (하거나 필요에 따라 최대 규모).
  2. 생성 하 고 hPSCs에서 유도할 수 있는 신경 (iNeurons)를 유지 합니다.
    1. 씨 잘 (위에서 설명한 비 유전자 변형 라인에 대 한) 당 hPSC 매체 + Y 2 mL 6-잘 접시 ECM 코팅에 (와 함께 안정적인 doxycycline 유도할 수 있는 neurogenin 2 transgene35) 유전자 변형 hPSCs 그들은 70 %confluency 리프트 준비가 될 때까지 잘 당 매일 미디어의 2 개 mL를 피드. 2.1.2 단계에서 설명한 대로 셀을 분할 합니다.
    2. 때 세포는 약 35%, confluent NM + Dox iNeurons로 분화를 유도 하는 것을 추가. 3.2 단계로 진행 하기 전에 2 일 NM + Dox 단층 문화 유지.
      참고: 셀 것 이다 신경 창시자로 전환 하지만 하지 않습니다 아직 확장 neurites (그림 1C).

3. 준비 및 3D 구체 Cocultures의 유지 보수

  1. HAstros (에서 설명한 대로 단계 2.1.5.1)에 3D 집계에서 해리
  2. HNeurons 또는 iNeurons 2D 단층에서 해리.
    1. 6 잘 플레이트에서 미디어를 제거 하 고 각 잘 단층 문화를 분리 솔루션의 500 µ L를 추가 합니다. 5 분 부드럽게 2-3 mL DMEM/F12 연결 된 셀을 제거 하려면 추가 37 ° C에서 품 어.
    2. 셀과 1 분 Aspirate는 상쾌한에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기에 15 mL 원뿔 튜브 미디어 수집 신선한 미디어의 1 mL을 추가 하 고 단일 세포 현 탁 액을 달성 하기 위해 1000 µ L micropipette와 부드럽게 위아래로 플라스틱.
  3. 양식 3D 분야 microwell 배양 배지를 사용 하 여입니다.
    1. Microwell 플레이트의 각 음을 방지 준수 헹 구는 해결책의 0.5 mL를 추가 하 여 접시를 준비 합니다. 2000 x g 5 분 Aspirate rinsing 솔루션에서 격판덮개 원심, 각 잘 세척 하 여 다시 발음을 DMEM/F12의 1 mL를 추가 합니다.
      참고: 항상는 원심 분리기는 사용 하는 동안 균형을 확인 합니다.
    2. 각 셀 형식을 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 계산 합니다. NM + Y (Dox iNeurons 활용 하는 경우를 포함)의 2 개 mL의 총 볼륨의 각 음에 해리 hAstros, hNeurons 또는 iNeurons의 원하는 비율을 추가 합니다. 플레이트 3 분 100 x g 에서 원심 고 인큐베이터에 반환 합니다.
      참고: 24 잘 microwell 접시 ( 테이블의 자료를 참조)에 잘 당 300 microwells 포함 되어 있습니다. 잘 당 미디어의 2 ml에서 (2 x 103 세포는 각각의 분야)에 대 한 6 x 105 셀의 최소 및 최대 (2 x 104 의 세포 각각의 분야)에 대 한 6 x 106 셀을 추가 합니다. 이 범위 내의 특정 밀도의 가능한 분야에 대 한 셀 정의 된 수량을 사용 하 고 300 구 당 셀의 수를 계산 하 여 분할. 원하는 경우 대체 영역 형성 방법 및 도구 또한 이용 될 수 있습니다. 셀 밀도의 허용 범위에 대 한 제조업체의 지침을 따릅니다.
    3. (그림 2A) 다음 2 일 동안 microwell 접시에서 밀도가 포장된 분야에 자체 조립 셀 수 있습니다. 문화 yellowing 경우 50% 미디어를 교체 합니다.
      참고: 절반 밖에 미디어를 교환 하 고 플라스틱 부드럽게 제거 하 고 미디어 분야를 방해 하기 위하여 추가 하는 경우. 분야는 microwells에서 들어올려 고 높은 힘 함께 융합할 수 있습니다.
    4. 2 일 후, 부드럽게 1000 µ L micropipette (그림 1D)와 microwells에서 분야를 제거 합니다. 가볍게 어떤 추가 준수 분야를 제거 하려면 미디어와 microwells의 바닥에 힘을 적용 합니다. 분야 15 mL 원뿔 튜브에 정착, 올드 미디어, 발음 및 신선한 미디어를 추가 하자.
  4. 3D 분야를 형성을 위한 회전자 플라스 크 생물 시스템을 설정 합니다.
    1. 70% 에탄올과 자기 저 판의 표면을 청소, 셀 문화 인큐베이터에 배치. 오토 클레이 브 소독 개별 스피너 플라스 크입니다.
    2. 각 회전자 플라스 크를 최소 50-60 mL 미디어 분야 추가 (그림 1D, 삽입). 60 rpm 설정 마그네틱 저 어 접시에 플라스 크를 놓습니다. 그들은 데이터 컬렉션에 대 한 준비가 될 때까지 회전자 플라스 크에 분야를 문화.
      참고: 최소 3 주 문화에서 시 냅 스 형성 필요 합니다. 스피너 플라스 크 생물 시스템 적절 하지 분야 세포 배양 플라스 크 또는 접시에 고정 조건에서 배양 수 있습니다. 분야 또한 ECM 또는 히드로 포함 될 수 있습니다.

4. Multielectrode 배열 (MEAs)와 라이브 시 냅 스 생리학의 측정

  1. MEAs 세포 배양에 대 한 준비.
    1. 1 헤 살 균 이온 (DI) 물, 린스에 대 한 세제의 1 mL와 함께 각 MEA의 깨끗 한 표면 소독, 70% 에탄올으로 씻어 고 biosafety 캐비닛 UV 빛의 밑에 건조 한 공기.
      참고: MEAs 저장할 수 있습니다 메 마른 조건 하에서 4 ° C에서 디 물에 사용까지.
    2. 붕 소의 산 성 버퍼의 100 mL으로 PLO의 50 밀리 그램을 용 해 하 여 폴 리-ornithine (PLO)의 0.5 mg/mL 해결책을 준비 합니다. 코트 표면 친수성 렌더링 및 4 h. 제거 PLO의 최소 37 ° C에서 품 어, 디 물 표면 세척, ECM의 1 mL을 추가 하는 PLO의 1 mL와 함께 각 MEA의 표면 (단계 1.1.1 참조), 그리고 4 h의 최소 37 ° C에서 품 어.
    3. ECM을 제거 하 고 1.5 ml MEA 표면에, 분야는 전극 배열 위에 위치를 보장 미디어의 분야를 배치 (그림 3A, 3A'). 2 일에 대 한 준수를 허용 합니다. 미디어 2-3 일 마다 (또는 더 자주 필요한 경우), 영역을 방해 하지는 보장의 절반을 변경 합니다.
      참고: 문화 생존과 성숙 성장 요인의 추가 향상 시킬 수 있습니다.
  2. 신경 분야의 전기 활동을 측정 합니다.
    1. 온도 제어 headstage와 multielectrode 배열 (MEA) 시스템을 설정 합니다. 5 Hz 하이-패스 필터 및 200 Hz 저역 통과 필터와 스파이크 임계값 5 x 표준 편차 (SD)의 소프트웨어 프로그램을 만듭니다.
    2. Headstage 및 기록 자발적인 전기 활동 (그림 3BB')에 MEA를 놓습니다. 스파이크 주파수와 진폭 통계 분석을 포함 하 여 원시 데이터를 저장 합니다.
      참고: 관류 시스템 MEA 약리 에이전트를 추가 하거나 장기 기록에 대 한 신선한 미디어의 흐름을 증가 함께 활용 될 수 있습니다. 원하는36,37로 스파이크의 추가 후 처리를 수행할 수 있습니다.

5입니다. Immunocytochemistry와 시 냅 스 밀도의 측정

  1. 시 약을 준비 합니다.
    1. 4 %paraformaldehyde (PFA)의 500 mL 재고 솔루션으로 만들기 위해 유리 비 커 또는 통풍된 후드에 저 어 플레이트 1 x PBS의 400 mL를 추가 합니다. 저 어 바 및 열 교; 동안 60 ° C를 추가 끓여 야 하지 않습니다. 열띤 PBS 솔루션 PFA 가루 20 g을 추가 하 고 천천히 dropwise 1 N NaOH를 추가 하 여 pH 6.9 인상.
      참고: 4 %PFA 솔루션 수 aliquoted 4 ° C에서 저장까지 한 달 동안.
    2. 20 g 또는 자당의 30 g 각각 20%와 30%의 자당, 솔루션을 만들기 위해 PBS의 100 mL를 추가 합니다.
    3. 10% 재고 솔루션을 준비 하는 PBS의 10 mL를 세제의 1 mL를 추가 합니다. 균질을 여러 번 반전.
    4. 10 mL PBS 기본 차단 버퍼를 준비 하 게 250 µ L 10% 세제 재고 솔루션 (0.25%의 최종 농도)의 500 µ L 각의 염소와 당나귀 세럼 (최종 농도 5%)를 추가 합니다.
    5. 10 mL PBS 보조 블로킹 버퍼를 준비를 100 µ L 각의 염소와 당나귀 세럼 (최종 농도 1%)를 추가 합니다.
  2. 샘플을 준비 합니다.
    1. 15 mL 원뿔 튜브에 영역을 전송 하 고, 튜브의 하단에 정착 하도록 허용 오래 된 미디어를 발음. 린스 500 µ L의 PBS, 정착, 그리고 PBS를 발음 하 게 된 분야. 500 µ L 4의 추가 %PFA (또는 분야를 커버 하는 이젠 그만) 및 30 분 동안 4 ° C에서 품 어.
    2. PFA 발음 하 고 부드럽게 PBS와 두 번 씻어. 20% 자당 해결책을 추가 하 고 몇 시간 동안 4 ° C에서 품 어 나 밤새. 신중 하 게 발음, 30% 자당 해결책을 추가 하 고 몇 시간 동안 4 ° C에서 품 어 나 밤새.
      참고: 샘플 저장 됩니다 PBS 또는 자당에서 4 ° C에서 최대 1 주일 다음 단계로 진행 하기 전에. 그렇지 않으면, 1.5 mL 튜브에 3D 분야 (그림 4A-C)로 유지 자국과 5.3 단계로 진행.
    3. 구체를 자르는 경우 드라이 아이스 위에 포함 저온 금형 분야 전송 신중 하 게. 30% 자당 해결책을 발음 하 고 천천히 부 어 완전히 피하 공기 방울 샘플을 커버 때까지 금형에 솔루션을 포함 하는 조직. 솔루션 동결 cryostat 칼 자국까지-80 ° C에서 저장 될 때까지 기다립니다.
    4. -20 ° C, 30 µ m 섹션으로 (또는 원하는) 임베디드 블록 조각과 유리 슬라이드에 한 cryostat 사용 하. 얼룩 준비까지-80 ° C에 저장 합니다.
  3. Immunostain 구체.
    1. 액체 흘림을 방지 하기 위해 소수 PAP 펜으로 슬라이드의 가장자리를 설명 합니다. 항 체 ( 테이블의 자료참조)와 함께 기본 및 보조 차단 솔루션을 준비 합니다. 각 슬라이드 또는 튜브 기본 차단 버퍼의 500 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 실 온에서 품 어.
    2. 액체를 제거, 각 슬라이드 또는 튜브, 희석된 주 항 체와 신선한 기본 차단 버퍼의 500 µ L을 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어 1 차적인 항 체 솔루션을 제거 하 고 씻어 10 분에 대 한 PBS 가진 3 배.
    3. 각 슬라이드 또는 튜브를 희석된 2 차 항 체로 차단 보조 버퍼의 500 µ L을 추가 하 고 1 h. 이차 항 체 솔루션을 제거 하 고 10 분에 대 한 PBS 가진 3 배 세척 4 ° C에서 품 어.
      참고: 권장된 항 체 목록 자료의 테이블에에서 제공 됩니다. 다른 항 체 또는 염료를 사용할 수 있습니다으로 원하는. 형광 샘플 (5.3.3 단계 이후) 빛에 노출 하지 마십시오.
    4. Dropwise 표면 신중 하 게 배치 하는 coverslip 거품을 피하고, 슬라이드를 통해 솔루션을 장착의 50 µ L를 추가 합니다. 슬라이드를 24 시간 실 온에서 건조 하 고 4 ° c.에 저장 허용
  4. 슬라이드 이미지.
    1. X 기름 침수 목표 이미지 사전 및 포스트 시 냅 스 단백질 풍부와 영역 조각 (그림 4D) 내의 colocalization 63와 또는 2 광자 공초점 형광 현미경을 사용 합니다. X 20 또는 40 X 목적에 사용 하 여 시각화 형태학 상 특징은 hAstros의.
    2. ImageJ 소프트웨어와 오픈 형광 이미지 파일입니다. 사전 및 사후 시 냅 스 puncta 이전 상세한38또는 다른 방법으로는 편견된 계산 방법을 사용 하 여 플러그인, 셀 카운터를 사용 하 여 수동으로 계산 합니다.

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결과

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제대로 수행 하는 경우이 프로토콜으로 이다28,33,34 와 뉴런35 (그림 1A-1C), hPSCs에서 생성 된 기능 cocultures의 정의 된 인구를 생산할 예정 이다 26 이전 상세 하 고 여기에 설명 된 단계 2.1-2.2. 이 단계적 절차, microwell 접시를 사용 하 여 일관성 있는 크기와 모양 (단계 3.3;의 3D 신경 분야를 얻을 것으로 예상 된다 그림 1D) 균등 하 게 분산 된 세포와 세포 죽음의 중요 한 표시 없이. 시작 셀 밀도, 세포 유형의 원하는 비율...

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토론

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이 프로토콜에서 우리는 신경 cocultures의 3D 분야의 생산을 위한 체계적인 방법을 설명합니다. 분야 이다와는 독립적으로 파생 hPSCs에서 뉴런으로 구성 됩니다. 비록 하지이 프로토콜의 초점, 이다 hPSCs28 에서 순수한 인구의 세대는 중요 한 단계 이며 사전 경험 없이 수행 하는 경우에 기술적으로 도전적 일 수 있다. 이러한 시 냅 스 칩의 세대에서이 첫 번째 단계는 세심 한 타이밍 및 세부 사항에 주의로 수행 되어야 한다. HPSC에서 파생 된 이다의 사용의 한계는 긴 차별화 과정; 그러나 미래에 대 한 동결 수 있습니다 셀의 대량 생산 사용 하 고에서 해 동 하는, 실험의 시간 (단계 2.1.5 참조) 하지 않아도 초기 hPSC 단계에서 프로세스를 시작. 두 특성 명과12,35의 존재에 의해 현저 하 게 향상 된 유전자 변형 hPSCs에서 생성 된 iNeurons ...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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우리는 박사 마이클 워드 (NIH)에 대 한 기술적인 조언 iNeuron 차별화, 그리고 사바 Barlas 예비 이미지 분석에 대 한 이러한 절차의 디자인에 지적 입력을 위한 박사 에릭 Ullian (UCSF)를 감사 하 고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
6웰 플레이트Fisher Scientific08-772-1B
15mL 원뿔형 튜브Olympus Plastics28-101
AccutaseSigmaA6964-100ML분리 솔루션
AggreWell 플레이트Stemcell Technologies34850
접착 방지 헹굼 솔루션Stemcell Technologies7010세포 방지 마이크로웰 플레이트에 대한 접착
항/항Thermofisher15240062
B27Thermofisher17504044미디어 보충제
BrainPhys 신경 매체Stemcell Technologies5790신경 생리학적 기초 매체 대안
원형 유리 커버슬립NeuvitroGG-12-oz
Cryostor CS10Stemcell Technologies793010% DMSO
DMEM/F12Thermofisher10565-042GlutaMAX 보충제
DMH-1Stemcell Technologies73634위험: 삼키면 유독함. 작업 농도 : 2 μ M
당나귀 혈청Lampire Biological Laboratories7332100작업 농도: 1차 차단 완충액에서 5%, 2차 차단 완충액에서 1%
Doxycycline Hydrochloride (Dox)SigmaD3072-1ml위험: 임산부에게 유독합니다. 작업 농도 : 2 μ g/mL
표피 성장 인자(EGF)PeprotechAF-100-15작업 농도: 10ng/mL
섬유아세포 성장 인자-2(FGF)Peprotech100-18B작업 농도: 10ng/mL
Fluoromount-G 장착 솔루션Southern Biotech0100-01
유리 슬라이드Fisherbrand22-037-246
염소 혈청Lampire Biological Laboratories7332500작업 농도 : 1 차 차단 버퍼에서 5 %, 2 차 차단 버퍼에서 1 %
헤파린AMQAX1000Life Technologies
HeparinSigmaH3149-50KU작업 농도 : 2 mg / mL
Magnetic plateDLAB8030170200
Matrigel 멤브레인 매트릭스Corning354230ECM 코팅 솔루션. 작업 농도 : 80 μ g/ml입니다. 얼음 위에서 준비하고 피펫, 튜브 및 미디어가 미리 냉각되었는지 확인하십시오.
MEA 2100 시스템다채널 시스템MEA2100
마운팅 솔루션
N2Thermofisher17502048Media Supplement
OCTTissue-Tek4583냉동 절편용 조직 임베딩 솔루션
Pap Pen(Aqua Hold)Scientific Device Laboratory9804-02
파라포름알데히드( PFA)Acros Organics169650025HAZARD: 흡입하면 독성이 있음. 작업 농도: PBS
인산염 완충 식염수(PBS)Stemcell TechnologiesCA008-300
폴리-l-오르니틴(PLO)SigmaP3655-100MG작업 농도: 0.5mg/mL
직사각형 유리 커버 슬립Fisherfinest Premium Superslip12-545-88
ReLeSRStemcell Technologies5872분리 및 패시징 시약
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)Tocris1254작업 농도: 10 uM
SB431542Stemcell Technologies72234작업 농도: 2 μ M
스피너 플라스크Fisher Scientific4500-125
자당Fisher ChemicalS5-3작업 농도 : PBS
T25 배양 플라스크Olympus Plastics25-207통풍 캡
T75 배양 플라스크Olympus Plastics25-209통풍 캡
Terg-A-zymeSigmaZ273287-1EA세제. 작업 농도: 1%
TeSR-E8 기초 배지Stemcell Technologies5940인간 만능 줄기 세포(hPSC) 배지
TeSR-E8 보충제Stemcell Technologies5940인간 만능 줄기 세포 배지
TritonX-100SigmaX100-500ML세포 투과화를 위한 세제. 작동 농도: 차단 완충액 0.25%
Trypan blueInvitrogenT10282
Antibodies
AlexaFluor 488ThermofisherA-110292차 항체
AlexaFluor 594ThermofisherA-110372차 항체
EzrinThermofisherMA5-138621차 항체; astrocytes perisynaptic
GFAPChemiconMAB3601차 항체; astrocytes
GFPAvesGFP-10201차 항체; astrocytes
Glt1Jeffrey Rothstein 박사의 선물n/a1차 항체; astrocytes
HomerSynaptic Systems160 0111차 항체; 뉴런, 시냅스 이후
MAP2시냅스 시스템188 0041차 항체; 뉴런
PSD95Abcamab27231차 항체; 뉴런, 시냅스 후
S100Abcamab8681차 항체; 성상세포
Synapsin 1시냅스 시스템106 103 1차항체; 뉴런, 시냅스 이전
TuJ1/β 3-튜불린 (TUBB3)CovanceMMS-435P1차 항체; 뉴런
시그마 또는 자동 세포 계수기 중 4%

참고문헌

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  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
  4. Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
  5. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  6. Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106(2015).
  7. Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
  8. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
  9. Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474(2015).
  10. Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
  11. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  12. Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
  13. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
  14. Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain? Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
  15. Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
  16. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  17. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  18. Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
  19. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
  20. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  21. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
  22. Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neuroscience. 334, 105-118 (2016).
  23. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Developmental Biology. 420 (2), 199-209 (2016).
  24. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  25. Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
  26. Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  29. Du, Z. -W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626(2015).
  30. Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
  31. Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
  32. Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
  33. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  34. Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286(2015).
  35. Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  36. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
  37. Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
  38. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
  39. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  40. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181(2016).
  41. Bardy, C., Hurk,, et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
  42. Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
  43. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  44. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
  45. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
  46. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  47. Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
  48. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423(2015).
  49. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
  50. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  51. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).

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