핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브

Summary

이 프로토콜에서 우리가 직접 살아있는 세포에서 핵을 제어 힘을 적용 하는 micropipette 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 생활, 부착 세포에서 핵 기계적 특성의 심문 수 있습니다.

Abstract

핵의 기계적 속성 응답 세포에서 생성 된 기계적인 힘을 결정 합니다. 핵 분자로 골격과 연속 이므로 메서드 부착 세포의 기계적 동작을 필요 합니다. 여기, 우리가 살아있는 부착 세포에서 핵에 직접 힘을 적용 하는 도구로 직접 힘 프로브 (DFP) 토론. 우리는 흡입과 핵 표면에 좁은 micropipette를 연결합니다. micropipette는 변형 하 여 번역 핵 핵 거리 변환 됩니다. 복원 힘은 흡입 힘, 핵 분리 되 고 탄력적 이완. 흡입 압력을 정확 하 게 알려져 있다, 때문에 핵 표면에 강제로 알려져 있다. 이 메서드는 나노 스케일 세력 변형 및 부착 세포에서 핵을 번역 하기에 충분 되며 저항 세력에 핵을 사용할 수 있는 cytoskeletal 요소를 식별 밝혔다. DFP는 살아있는 세포에서 핵 기계적 속성의 구성 요소 세포질과 핵의 기여를 해 부를 사용할 수 있습니다.

Introduction

암과 같은 병 리 핵 모양 및 구조^1,2, 일반적으로 동반 된다 핵^3,4의 '연'을 변경 포함 됩니다. 기계적 변형에 저항을 핵은 고립 된 핵⁵에 힘을 적용 하 여 일반적으로 특징 되었습니다.

셀에 핵 분자로 링커의 Nucleoskeleton와 골격 (링컨) 복잡 한^6,7,,89골격에 연결 됩니다. 그 결과, 골격과, 세포 층 유착, 세포 외 매트릭스를 통해 핵 기계적으로 통합 되었습니다. 기계적으로 부착 세포 안에 핵을 프로 빙이 기계적 통합에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 살아있는 세포에서 핵을 조작 하는 메서드는 micropipette 포부^10,11및 원자 힘 현미경 검사 법^12,,1314있습니다. 우리는 최근 생활 부착 셀¹⁵에 핵에 직접 기계적인 힘을 적용 하는 직접 힘 프로브 (DFP)를 설명 합니다.

여기, 우리가 일반적으로 알려진된, 나노 기계적 힘을 부착 셀에서 핵 직접 적용할 현미경 시설에서 사용할 수 있는 microinjection 시스템을 사용 하기 위한 절차를 설명 합니다. Femtotip (0.5 µ m 직경 micropipette 팁) 탑재 하 고 튜브에 의해 microinjection 시스템에 연결 된. 때까지 핵 표면에 인접 한 문화 접시의 표면에 상대적으로 45 ° 각도로 위치 팁은 낮 췄 다. 튜브 분리 그리고 핵 표면에 부정적인 흡입 압력을 만들고 물개 micropipette 팁 핵 표면에 대 한 분위기에 열입니다. Micropipette 팁의 번역을 통해 핵 변형 이며 결국 (적용 되는 힘의 크기), 따라는 micropipette에서 분리. 이 분리는 micropipette에 의해 적용 되는 흡입 힘 동등 하 게 복원 (저항) 세력, 핵 및 셀에 의해 발휘 될 때 발생 합니다. 핵의 변위를 측정 하 여 분석을 수행할 수 있습니다 길이 변형 (공식 1), 또는 지역 스트레인 (그림 1A).

Protocol

1. 영상에 대 한 셀을 준비합니다.

참고: 직접 힘 프로브 (DFP) 모든 부착 셀 형식에 사용할 수 있습니다. 여기, NIH 3T3 마우스 fibroblasts 모델 셀 라인으로이 프로토콜에 대 한 사용 됩니다.

1. 문화 NIH 3T3 fibroblast 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 1%와 10% 기증자 소 혈 청 보충 페니실린-스 35 m m 유리 하단에 원하는 confluency까지 요리. 37 ° C, 5% CO₂세포를 유지 합니다.
   1. NIH 3T3 세포 이미징 뿌리기 전에 모든 35 mm 유리 하단 요리 fibronectin (또는 유사한 ECM 단백질), 5 µ g/mL와 코트를 해야 합니다.
      참고: 셀 해야 합니다 수 완전히 확산 및 실험에 대 한 접시에 부착. DFP 메서드가 작동 하려면 confluency 측면에서 제약 되지 않습니다.
2. 실험 직전 셀 완전 한 성장 매체를 가진 단일 세척 뒤 PBS로 두번 세척.
3. 유리 하단 접시에 완전 한 성장 매체의 3 mL를 추가 합니다.

2. 현미경 및 이미지 수집

참고:는 거꾸로 형광 현미경 (또는 동등한) micromanipulator 쪽 팔의 제조 업체의 권장 사항에 따라 설치 된와 함께. 현미경은 37 ° C에서 온도 CO₂ 수준 5%에서 유지 하기 위해 환경 챔버를도 복 한다. Micromanipulator 및 현미경에 부착 된 microinjector는 또한 필요 합니다. 기름 침수 40 x 1.3 / NA 또는 60 x 1.49 / NA (또는 해당 목표)는 실험에 대 한 것이 좋습니다. 현미경 진동 절연 테이블에 거치 되어야 한다.

그림 1 . 핵 변형 및 현미경 초점
A. 최대 핵 변형 그리고 핵 변형의 휴식. 최대 핵 변형 계산 하기 전에 핵 모양의 뒤 가장자리 했다 처음 변형된 핵의 번역에 대 한 해결을 동시에. Micropipette 팁 초연의 순간에 핵의 모양 당기는 전에 초기 핵 모양에 중첩 되었다. 두 셰이프 사이의 지역 차이 Δ로 측정 되었다₁. 최대 핵 변형 ΔA₁ 원래 핵 영역으로 나눈 값으로 정의 되었다. 마찬가지로, 두 번째 매개 변수, ΔA₂, 원래 핵 모양에 micropipette 분리 후 최종 상태 핵 모양 오버레이하여 정의할 수 있습니다. 2. 초점 평면 A에 셀 이동한 다음 micropipette 팁을 찾을 수 평면 B까지 초점 비행기. 이미징, 동안는 micropipette 오른쪽 (주황색 화살표의 방향)으로 번역 되었다. 이 그림은 Neelam 외에서 수정 되었습니다. ¹⁵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

1. 제조 업체의 프로토콜 당 microinjector를 켭니다.
2. 침수 기름 스포이드를 사용 하 여 대물 렌즈 위에 침수 기름 한 방울을 적용 합니다.
3. 접시 홀더에 접시를 단단히 클램프 하 고 무대에 접시 홀더를 로드 합니다.
   참고: 셀 실험 동안 37 ° C, 5% CO₂ 에서 유지 되어야 합니다.
4. 초점 (비행기, 그림 1B)에 셀을가지고 목표의 높이 조정 합니다.
5. 관심의 셀 데 현미경 단계를 이동 합니다.
6. 최상위 순위에 피펫으로 홀더 이동 micromanipulator에 조이스틱을 회전 합니다. 0.5 µ m 직경 팁 micropipette 피펫으로 보유자에 로드 합니다.
   1. micropipette에 세포 접착을 방지 하려면 미리 실 온에서 0.3 mg/mL 1 시간을 위한 PLL-g-말뚝 솔루션으로 micropipette 팁 취급. 모든 흡입 압력 없이 핵을 micropipette 감동 하 고 다음 핵에서 micropipette 번역 여 접착 테스트 합니다. 접착의 부재는 핵 변형 및 번역의 완전 한 부족에서 분별 수 있습니다.
      참고: 패키지 여 제조 제안을 따르십시오.
7. 미세 제어를 조정 하 여 비행기 A와 비행기 B 셀의 맨 위에 객관적인 초점 비행기를 올립니다 (그림 1B단계 2.4 참조).
8. 거친 제어는 micromanipulator를 설정 합니다. 천천히 micropipette의 실루엣에 대 한 보고는 micropipette 초점으로 완전히 때까지 비행기 B 아래로 micropipette 가져.
9. 일단 micropipette 팁 초점에, 세밀 하 게 제어 하는 micromanipulator를 설정 합니다.
10. 목표 셀 (비행기 A, 그림 1B)의 적도 면에 낮은 및 15 µ m 비행기 A 위의 (그림 1B, 파선된 micropipette) micropipette.
11. 원하는 압력; microinjector에 보상 압력 (P_c)를 설정 안정 압력에 대 한 몇 초 동안 기다립니다.
    참고: 최적의 압력 세트 포인트 셀 종류와 실험의 특정 목표에 따라 달라 집니다. 대부분의 경우, 300 hPa 좋은 출발점이 있을 것 이다.
12. micropipette micromanipulator 패널에 클린 설정을 사용 하 고 기포 micropipette 팁에서 나타날 ㄴ 다는 것을 확인 하 여 막힌 되지 확인 하십시오.
13. 팁을 팁 핵 표면에 닿아 가볍게 때까지 micropipette을 서서히 낮추어 셀에 넣습니다.
    참고:는 micropipette, 낮추는 때 micropipette 팁의 실루엣 될 것 이다 분명 그것은 초점으로 온다. 전에 micropipette 건드리면 핵, 객관적인 초점을 핵 (동일한 x y 좌표, 더 높은 z-비행기)와 micropipette 끝. 다시 핵 (비행기, 그림 1B)의 적도 면에 초점을 반환 및 점차 micropipette 팁.
14. 되므로 대기 micropipette 튜브의 끝을 열어 microinjection 시스템에서 압력 공급 튜브를 분리 하 여 micropipette 팁과 핵 막 인감을 만듭니다. 이 단계는 부정적인 압력 P_c 와 같은 핵 표면에 만듭니다.
15. 현미경 이미지 컬렉션 소프트웨어와 함께 이미지를 취득 합니다. Avi-인수 (비디오) 또는 nd-수집 (이미지) 이미지 컬렉션 소프트웨어에서를 설정 합니다.
    참고: 어떤 이미징 소프트웨어를 인수, 실시간 비디오 이미징 또는 짧은 시간 간격으로 시간 경과 이미지 인수를 설정 합니다.
16. 해당 형광 이미징 채널을 토글 (즉, GFP, RFP, 등)와 이미징 시작.
17. (오른쪽, 그림 1B)에 셀의 본문에서 micropipette 팁 번역 핵은 micropipette에서 분리 될 때까지.
    참고: (오른쪽에 있는 보기의 필드에) 긍정적인 x 방향에 따라 팁을 당겨. 풀링 레이트 프로그램을 컴퓨터에 의해 제어 또는 조이스틱을 수동으로 이동할 수 있습니다. 우리 밀 지 사이 어떤 상관 관계를 발견 하지 않은 속도 핵 변형¹⁵ 를 주로 탄성 응답을 제안.

3. 데이터 분석

1. 사용할 수 있는 기본적인 이미지 처리 소프트웨어 이미지 분석을 수행 합니다. 길이 변형 (Ɛ) 또는 지역 스트레인 (그림 1A)에 의해 핵 변형 정도 측정할 수 수 있습니다. 길이 변형 방정식 1를 사용 하 여 계량 어디 L과 L₀ 는 각각 최대 변형 및 초기 위치에서 핵의 길이 나타냅니다.
   (식 1)

Results

그림 2A 는 NIH 3T3 마우스 구와 핵의 강제로 보여줍니다. Micropipette 팁은 오른쪽에 번역, 핵 변형 하 고 결국 micropipette 팁에서 분리. 핵의 길이 변형 흡입 힘 (그림 2B) 증가 함께 증가를 볼 수 있다. 핵 (micropipette 당기는 가장자리)의 앞쪽 가장자리 핵 돌출을 형성 하 고 후행 가장자리 그것의 원래 위치에서 난민. 돌출의 길이 후행 가장자리 변위 (그림 2C), 핵 및 주변 세포질 간의 긴밀 한 통합을 제안 보다 훨씬 큽니다. 시간의 척도 핵 앞쪽 가장자리의 짧은 휴식 (< 1 s), 그리고 핵 뒷면 가장자리 (< 2 s) (그림 2D).

Discussion

어느 고립 된 핵 (핵은 골격에서 분리)를 필요로 하기 때문에 micropipette 포부¹⁶, 등 최신 방법에 대 한 도전 이다 골격 가진 핵의 기계적 통합 측정 또는 일시 중단 된 셀 (견인 힘, 같은 세포 외 세력 있는 결 석)에 핵. 강제로 막^17,18; 세포 점착에 biaxial 긴장을 적용 하 여 핵에 적용 된 그러나,이 기술은 핵에 힘 불명 하다는 사실에 의해 제한 됩니다. 원자 힘 현미경 (AFM) 프로브; 그대로 셀에 핵을 사용 장점은 그들이 동안 핵의 기계적 성질을 공개 골격와 통합이 제공 합니다. 핵^12,,1314대상이 기존 vivo에서 기술에 추가 하려면, 우리는 그것 동안 살아있...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FluoroDish	WPI	FD35
SYTO 59	ThermoFisher Scientific	S11341
펨토팁스	Eppendorf	930000043
InjectMan NI2	Eppendorf	NA	단종, 현재 동급모델: InjectMan 4
FemtoJet	Eppendorf	NA	현재 모델 FemtoJet 4i
Plan Fluor oil immersion 40x	Nikon	NA
Apo TIRF oil immersion 60x	Nikon	NA
Donor Bovine Serum (DBS)	ThermoFisher 과학적	16030074	NIH 3T3 혈청
Dulbecco의 Eagle's (DMEM)	Mediatech cellgro	MT10013CVRF	NIH 3T3 배지
페니실린-스트렙토마이신	Mediatech		MT30004CIRF NIH 3T3 중간 보충제
이머젼 오일 타입 LDF 비형광	Nikon	77007	이머젼 오일, 오브젝티브 렌즈용