높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 C. 선 충 Pathosystem

Summary

여기 우리는 적응, 전체 호스트, 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하 고 신약 사용을 활용할 수 있는 도구를 높은 콘텐츠 심사 하는 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

식별 하는 새로운 약물의 수에 의해 전통, 생체 외에서 스크린 쇠퇴 하고있다, 여러 약물 저항에 대처 하기 위해 새로운 무기에 대 한 검색에이 접근의 성공을 감소. 이 연구원은 새로운 약물을 찾는 데만 필요 하지 않습니다 하지만 또한 그들을 찾는 새로운 방법을 개발 해야 결론을 주도하 고 있다. 가장 유망한 후보자 사이 메서드는 전체 유기 체, vivo에서 분석 실험을 사용 하 여 높은 처리량, phenotypic 판독 Danio rerio 꼬마 선 충 에서 그 범위를 호스팅합니다. 이러한 호스트는 호스트 또는 biounavailable 독성 화합물을 일반적으로 비용이 많이 드는 따라 하기 전에 초기 화면에서 삭제 됩니다 거짓 긍정적인 안타에서 극적인 절감 등 여러 가지 강력한 이점이 있다.

여기에 우리가 어떻게 우리의 분석 결과 문서화 C. 선 충에서 호스트 변화를 심문 하는 데 사용 되었습니다 표시-녹 농 균 죽이 액체 pathosystem. 우리는 또한 잘 밖으로 일이 기술의 몇 가지 확장을 보여 줍니다. 예, 우리이 호스트 병원 체 상호 작용에서 쿼리 호스트 요인 플레이트 형식 높은 처리량 유전 스크린 24 또는 96 잘 RNAi를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 불과 몇 개월만에, 극적으로 힘 드는 생물 정화 방법에 대 한 필요 없이 잠재적으로 약물 표적을 식별 하는 작업을 단순화 수 있는 전체 게놈 스크린을 완료할 수 있습니다.

우리 또한 그람 양성 박테리아 Enterococcus faecalis 그람 음성 병원 체 피 녹 농 균에 대 한 대체 하는 우리의 방법의 변형 여기 보고 합니다. 많은 경우 처럼 피 녹 농 균에 대 한, E. faecalis 에 의해 죽이 시간 종속적입니다. 이전 선 충 C.달리-E. faecalis 분석 실험, 우리의 분석 결과 E. faecalis 팬 들은 preinfection의 정보 필요로 하지 않습니다, 그것의 안전 단면도 개선 및 액체 처리 장비를 오염 하는의 가능성을 감소. 분석 결과 매우 강력 하 고, ~ 95% 사망률 96 h 포스트 감염을 보여주는.

Introduction

식별 및 효과적인, 넓 스펙트럼 항생제의 개발 지금 거의 한 세기 전, 공중 보건에 분수령에 지도 되었다 대폭적인 신념 그 전염 성 질병 과거의 채찍 질 될 것 이라고. 짧은 몇 십년 내이 낙관론 병원 체 병원 체 개발이 한번 기적 치료 제한 저항 메커니즘 후로 지 러 지기 시작 했다. 몇 시간 동안, 약 발견 노력와 병원 체 사이 군비 경쟁 균형 잡힌 듯. 그러나, 항균의 오용은 최근 불러 팬-약물 내성 변종의 Klebsiella 균, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescens및 피 농 균^{1의 출현 2,,34}.

P. 녹 농 균 은 편의적, 그램 네거티브, 멀티 호스트 병원 체 사람 immunocompromised, 또는 낭 성 섬유 증가지고 심한 화상 환자에 게 심각한 위협입니다. 그것은 또한 점점 더 심한 병원내 감염, 특히 항균 성 저항의 지속적인 인수 때문에 원인이 되는 대리인으로 식별 됩니다. 이 위협을 해결 하기 위해 시작, 우리는 문서화 C. 선 충-P. 녹 농 균 감염 시스템⁵를 사용 했습니다. 연구소는 호스트⁶죽 일 하는 병원 체의 기능을 제한 하는 새로운 화합물을 식별 하는 액체-기반, 높은 처리량, 높은 콘텐츠 심사 플랫폼을 개발 하는 것이 시스템을 활용 했다. 글에,이 화합물 제⁷ 과 독성 억제제⁸을 포함 하 여 적어도 3 개의 일반적인 범주에 속하는 것 같다. C. 선 충 에서 다른 높은 콘텐츠 약물 발견 분석 진 균 tuberculosum, 클 라 미디 아 속 trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, 황색 포도상구균, 칸디 다 albicans, 보고 되었습니다 및 Enterococcus faecalis, 다른 사람의 사이에서^{9,10,11,12,13,14,,1516}. 분석 실험의이 유형은 몇 가지 잘 인식된 장점이, 호스트와 병원 체, 화학 스크린과 넘어 안타를 식별 하는 기능에 비해 생체 이용률의 증가 가능성에 독성이 있을 수 있습니다 거짓 긍정적인 조회 수 제한 등 단순히 안티-virulents, 면역 물질로 분자, 또는 그렇지 않으면 전 찬성 호스트 병원 체 상호 작용의 균형을 기울일 화합물 등 미생물 성장을 제한. 또한,이 화면에서 발견 된 화합물은 종종 포유류 호스트에 효과적입니다.

그것은 적어도 두 개의 다른 분석 실험^17,18 액체에서 C. 선 충 에서 높은 처리량 화면 수행 수 있습니다 지적 가치가 있다. 그러나,이 분석 실험은 원형 장 식민지 분석 결과, 액체에서 느린-살인로 알려진 있도록 수정 처리량을 증가 하 고 더 쉽게 상영 하는 화합물을 수 있도록. 주의 특성화는 결정적으로 세균 독성의 기계 장치는 이러한 분석 및 우리의 액체 기반의 화면⁷사이 설명 했다. 이후 두 가지 유형의 독성 포유류 시스템에서 관찰 된다, 그것은 어떤 독성 결정은 분석 결과 선택 이전 실험의 관심사에 대 한 가장 관련성이 높은 고려 하는 것이 중요.

여기 우리가 액체 기반으로 최적화 된 버전을 보여 농 균 선 충-P. C. 분석 결과. 우리는 또한 그람 양성 세균성 병원 체에 맞게 우리의 액체 기반의 분석 방법의 적응을 보고 Enterococcus faecalis. P. 녹 농 균, 같은 E. faecalis 점점 항균 성 저항 경로¹의 성장 군비와 심각한 병원내 위협으로 식별 됩니다. E. faecalis 의 높은 처리량 검열에 대 한 이전 방법¹⁴존재, preinfection는 절차 복잡 하 고 COPAS FlowSort 같은 장비를 오염 하는 가능성을 증가 병원 체와 함께 필요 합니다. 우리의 프로토콜 안전 프로필 개선 사전 감염에 대 한 필요가 없다. 마지막으로, 우리는 이러한 분석 중 결합 될 수 있다 먹이의 설립에 있는 역할을 할 호스트 요소에 대 한 검색 사용자 수 있도록 RNAi 또는 감염에 저항 하는 수단을 보고 합니다.

Protocol

주의: 피 녹 농 균 과 E. faecalis 는 Biosafety 수준 2 병원 체, 그리고 우연한 감염을 방지 하 고 표면 오염 최소화 하기 위해 적절 한 안전 조치는가지고 야 한다. 모든 미디어 자료와 병원 균에 접촉 해야 합니다 수 소독 및/또는 삭제. 추가 지침 CDC 간행물 Biosafety Microbiological 및 생물 의학 실험실 (BMBL), 5 판에서에서 사용할 수 있습니다.

1. 준비 및 피 녹 농 균 의 유지 보수

1. 파운드 (Lysogeny 국물) 한 천 배지 위에 냉동된 재고에서 행진 P. 녹 농 균 37 ℃에서 16 ~ 24 h를 품 어
   참고: BSL-2 생물 안전 캐비닛 무 균을 보장 하기 위해 내부 P. 농 균 실험을 수행 합니다. 병원 성 감염 또는 오염 가능성을 최소화 하기 위해 적절 한 안전 조치를 사용 합니다.
2. 4 ° c.에이 접시를 전송 이 접시 4 ° C에서 유지 고 1 주일 문화를 예방 하는 데 사용 될 수 있습니다. 1 주일 후 오염을 제거 하 고 접시를 버리고 새로운 파운드 조 흔 격판덮개를 만들.
   참고: 피 녹 농 균 독성 장기간된 보관 후 감소합니다.
3. 분석 결과 접시를 설정 하기 전에 2 일 1.1에서 만든 접시에서 피 녹 농 균 에의 한 식민지와 살 균 파운드 국물의 3-5 mL 접종. 12 ~ 16 h 37 ° C에서 품 어.
   참고: 16 h 이상 품 어 하지 마십시오. 풍부한 액체 문화에서 P. 농 균 PA14 lyse 하기 시작 합니다.
4. 천천히 죽 일 미디어와 함께 살 균 10 cm 접시를 준비 (3 세대 NaCl, 3.5 g 펩, 1mm CaCl₂, 1 mM MgSO₄, 인산 염 버퍼의 25 mL (리터 당 금액: 132 mL K₂HPO₄ (1 M)의 고 KH₂포₄ (1 M)의 868 mL)와 18 g 천/L).
   참고: 미리 접시를 준비 합니다. 그들은 최대 3 주까지 4 ° c.에 밀폐 용기에 저장할 수 있습니다.
5. 각 10 cm 느린 죽 플레이트 (SK 판) P. 녹 농 균 의 신선한 하룻밤 파운드 문화에서 350 μ와 씨앗 살 균 세균 분산기를 사용 하 여 미디어의 표면에 걸쳐 균일 하 게 박테리아를 확산 하 고 BSL-2 생물 안전 캐비닛에 건조를 허용 합니다.
6. 24 h에 대 한 37 ° C에서 접시를 품 어.

2입니다. RNAi 박테리아의 준비

1. 밖으로 행진 또는 냉동된 재고에서 적절 한 항생제 (100 µ g/mL에서 carbenicillin) 및 Ahringer와 비 달 라이브러리 15 µ g/mL에서 항생물질을 포함 하는 파운드 한 접시에 RNAi를 포함 하는 박테리아의 핀 전송 원하는 변종.
   참고: nonpathogenic 박테리아를 작업할 때 사용 하거나 BSL-2 A / B 생물 안전 캐비닛 또는 BSL-1 층 류 후드 문화의 무 균을 보장 하 고 라이브러리의 교차 오염의 가능성을 최소화 하기 위해.
2. 37 ° c.에 24 h에 대 한 번호판을 품 어
3. 2 주 동안 4 ° C에서 접시를 저장.
   1. 2 주 후 번호판을 삭제 하 고 갓 만든 번호판 교체.
4. 24 잘 깊은 잘 격판덮개의 단일에서 파운드 carbenicillin 보충의 4 mL 또는 멸 균 시험관에 각 복제에서 단일 식민지를 개별적으로 접종 하 여 동시에 여러 RNAi 긴장을 테스트 합니다.
   참고: 항생물질은 RNAi의 효율성을 감소 시키기 위하여 알려졌다. 이 미디어에 그것을 사용 하지 마십시오.
5. 24 잘 깊은 잘 격판덮개 multiwell 격판덮개를 위한 최적화 된 떨고 인큐베이터에 배치 하 고 950 rpm에서 떨고 있는 동안 16 h 37 ° C에서 품 어.
   참고: 그것은 기존의 떨고 인큐베이터를 사용 하 여 multiwell 격판덮개에 균일 한 박테리아의 성장을 얻기 어렵다입니다. 떨고 인큐베이터에서 제대로 성장 하는 문화에 대 한 순서로 750 rpm의 최소 흔들 수 있이 필요가 있다. 특수 셰이 커의 부재에서 개별 튜브에서 각 문화를 성장 가능 하다. 원하는 경우 문화 그 후, 원심 분리에 대 한 24-잘 접시로 옮겨질 수 있다.
6. 2000 x g에서 5 분간 centrifuging 여 박테리아를 수집 합니다.
7. 접시를 반전 하 고 적극적으로 흔들어 하 여 상쾌한을 가만히 따르다. RNAi 박테리아의 S 기저 (5.85 g NaCl, 1 g K₂HPO₄, 6 g KH₂포₄ 초순 물 1 L에 녹이 고 압력솥에 의해 소독) 100 µ L resuspend
8. NGM multiwell 격판덮개의 우물의 적절 한 수로 resuspended 박테리아를 플라스틱 (선 충 류 성장 매체, 3 세대 NaCl, 2.5 g 펩, 1mm CaCl₂, 1 mM MgSO₄, 인산 염 버퍼의 25 mL (리터 당 금액: 132 mL K₂HPO₄ (1 M) 그리고 KH₂포₄ (1 M)의 868 mL), 및 물의 리터 당 18 g 천) IPTG (1mm 최종 농도)와 carbenicillin (100 μ g/mL 최종 농도) 보충.
   1. 6 잘 플레이트, 24-잘 접시의 우물 당 1 mL 또는 96 잘 접시의 당 150 µ L의 당 NGM 미디어의 3.5 mL를 사용 합니다.
   2. 6 잘 플레이트;에 대 한 박테리아의 100 μ/잘 사용 50 μ/잘 24-잘; 또는 96 잘 접시 20 μ/잘. 건조를 허용 합니다.
      참고: 건조 신속, 균일 한 건조를 촉진 하는 살 균 흐름 후드에서 정상적으로 수행 됩니다. 균일 건조 하는 것은 매우 중요 하다입니다. 벌레의 소리를 내는 agar에 균열 촉진으로 지나치게 건조 하지 마십시오. 웜 및 액체 처리 시스템의 잠재적인 막힘을이 끈다.
9. 준비 된 접시를 사용 하 여 즉시 또는 나중에 사용에 대 한 최대 2 주 동안 그들을 4 ° C에서 저장.
   참고: 접시 밖으로 건조 하지 않도록, 그들은 수 수 파라핀 플라스틱 필름으로 밀봉 또는 젖은 종이 타월로 단단히-밀폐 된 용기에 배치.

3. 유지 보수 및 C. 선 충 의 준비

참고: 실험을 시작 하기 전에 생성 벗, 성인 자웅 동체 벌레의 동기화 된 인구 다음과 같습니다.

1. 세척 벗 성인 (즉, 여러 개의 배아 생식 내 표시와 함께) 4-6-10cm NGM 번호판 플레이트, 부드럽게, 소용돌이 그리고 다음 15 mL 원뿔 튜브에 붓는 S 기저의 4 mL를 추가 하 여 15 mL 원뿔 튜브로에서.
2. 30 초 동안 1000 x g에서 원심 분리를 통해 웜 작은
3. Aspirate 상쾌한, 웜 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용
4. 웜 표 백제 솔루션의 3.5 mL을 추가 (최종 농도 0.5 M NaOH, 살 균 물에 1% 염소) 웜 펠 릿을 1 분에 대 한 반전에 의해 혼합.
5. 짧게 소용돌이 고 30 초 동안 1000 x g에서 원심 분리기.
6. 발음 또는 웜 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용 상쾌한 가만히 따르다.
7. 웜 펠 릿에 신선한 웜 표 백제 솔루션의 3.5 mL를 추가 합니다.
8. 적극적으로 혼합 표 백제 솔루션에서 벌레. 주기적으로 (약 매 10 초) 육안으로 직접 검사 해 현미경 벌레. 계란을 풀어 휴식, 웜 손톱에 대 한 감시. 성인 벌레의 대부분 해산된 (~ 95%) 되어, 일단 S 기저 막을 소화와 15 mL에 표 백제를 희석.
   참고: 달걀 껍질은 성인 조직 보다 표 백제에 저항 하지만 그들은 장기간된 노출 시 녹을 수 있다. 계란 해체를 방지 하려면 표 백제 솔루션 7 분 이상 벌레 계란을 노출 하지 마십시오. 달걀 껍질은 과도 하 게 손상 된 경우, 태아 죽을 것 이다.
9. 30 초 동안 1000 x g에서 배아를 작은 발음 또는 배아의 펠 릿을 제거 하지 않고는 상쾌한 가만히 따르다.
10. 나머지 표 백제 솔루션을 희석을 S 15 mL의 최종 볼륨을 기저에 벌레를 resuspend.
11. 4 연속 세척의 총에 대 한 세척 단계 (3.9-3.10) 3 번 이상 반복 합니다.
12. 4 세척 후 상쾌한 발음 하 고 15 mL 원뿔 튜브로 살 균 S 기저의 5 또는 6 mL 추가 합니다. 목표는 배아 µ L 당 50 ~ 벌레의 농도를 resuspend 것입니다.
    참고: S 기저의 금액; 계란 펠 릿의 크기에 따라 달라 집니다. 큰 펠 릿 더 S 기저는 필요 합니다.
13. 하룻밤 실 온에서 테이블 탑 회전 또는 15 ° c.에서 48 h에 원뿔 튜브를 품 어 애벌레는 부 화 하지만 애벌레 개발 L1 단계 (L1 diapause) 영양소 부족 때문에 체포 됩니다.
14. 그들의 대부분 부 화 하 고 개발의 L1 단계에서 체포는 확인 해 현미경 배아를 검사 합니다.
15. 웜 준비의 20 µ L S 기저의 80 µ L와 희석 함으로써 웜 수를 결정 합니다. 빈 NGM 접시에 직접 희석된 웜 솔루션의 10 µ L 플라스틱 2 번 더 반복 합니다.
    1. 각 자리에 애벌레를 계산 하 고 평균 수를 결정 합니다. 이 평균 웜 준비 µ L 당 벌레의 대략적인 개수를 2로 나눕니다. 웜 preps 전파 격판덮개 또는 실험에 대 한 사용할 수 있습니다.
       참고: 4-5 일 후 굶 어 애벌레 시작 됩니다 죽을; 이 시점에서 준비를 삭제 합니다.
16. 변형 전파, L1 웜 (5000-6000) 3-4 10-cm NGM 접시에 적절 한 수와 함께 발견 하는 피 펫 OP50 대장균- "superfood" 집중 (대장균 OP50 25 X 농도에서 발견 (즉, 1 L 1 박 OP50의 LB에서 성장 하는 문화 수익률 25 X OP50 superfood의 40 mL); 이 집중된 세균 현 탁 액 2 mL 각 10 cm NGM 접시에 발견).
17. 실험에 대 한 접시를 준비 하려면 ("기본 프로토콜" 사용 3.17.1 설치, "RNAi 스크린 설정" 사용 단계 3.17.2-적절 한 3.17.4에 대 한)에 대 한 다음 중 하나를 수행 합니다.
    1. 피 펫 ~ 5000 웜/10 c m 플레이트 RNAi 또는 OP50 superfood로 시드.
    2. 피 펫 ~ 500 웜/잘 6 잘 플레이트 RNAi와 시드.
    3. 피 펫 ~ 300 웜/잘 24-잘 접시에에서 RNAi와 시드.
    4. 피 펫 ~ 100 웜/잘 96 잘 접시에에서 RNAi와 시드.
       참고: RNAi는 시드 방법에 대 한 지침을 참조 하십시오 단계 2.7-2.9 RNAi 박테리아의 준비에서.
18. 벌레의 비옥한 변형 사용 되 고, 품 어 벌레 ~ 44-48 h. 사용에 대 한 25 ° C에서이 벌레 가능한 한 빨리 후 인구는 적절 한 나이 도달 했습니다. 이 분석 결과 중 벌레 내에서 부 화 계란의 영향을 최소화 합니다.
19. 변형 사용 하는 경우는 살 균 온도 (예: fer-15(b26); fem-1(hc17) 또는 glp-4(bn2)), 벌레 ~ 16 h 15 ° C에서 품 어와 다음 44 h 개발을 완료 하 고 embryogenesis를 방지를 위한 25 ° C에 전송.

4. 액체 분석 결과 설치 (기본 프로토콜)을 죽이

참고: 이것은 하나의 박테리아 스트레인과 벌레의 한 소스에 대 한 프로토콜입니다.

1. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 SK 접시에서 피 녹 농 균 을 제거 하 고에 resuspend ~ S 기저의 5 mL. 필요한 경우 규모. (OD₆₀₀) 분 광 광도 계를 사용 하 여 세균 현 탁 액의 광학 밀도 측정
2. S 기저 OD₆₀₀ ≈ 0.09에 (3 배 최종 농도)에 피 녹 농 균 의 희석된 증권의 24 mL를 준비 합니다. 잘, 당 최종 콘텐츠 4.6.2 참조 하 고 따라 세균 희석의 볼륨을 확장할.
3. 액체 느린 죽 미디어 (3 g의 NaCl, 펩/L CaCl₂ 와 1 m m의 최종 농도에 MgSO₄ 보완의 3.5 g) 21 mL를 추가 합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 박테리아와 미디어의 45 µ L 384-잘 접시의 각 잘 전송.
4. 50 mL 원뿔 관으로 (즉, 단계 3.17.1) 그들의 소스에서 벌레를 세척 하 고 벌레를 중력 아래 정착을 허용. 5 mL에 상쾌한 발음 Resuspend 50 mL S의 총 기초
5. 4.4 단계를 두 번 반복 합니다.
6. 웜 정렬을 사용 하 여, 약 22 웜 384-잘 접시의 각 음에 정렬 합니다.
   참고: 설치 ~1.1 µ L의 액체에서 각 벌레를 삭제합니다. 22 벌레 25 µ L, 총 분석 결과 볼륨 70 µ L/잘 데리고 도달할 것 이다.
   1. 각 잘의 최종 구성 구성 70 µ L. 45이이 볼륨의 µ L 세균성 매체로 추가 (24 µ L S 기초, 및 21 µ L SK에서에서 0.03 OD₆₀₀ 박테리아 CaCl₂ 와 MgSO₄보충). 다른 25 µ L 22 벌레와 함께 추가 됩니다.
   2. 정렬 사용 하는 경우 여기 ( 재료의 표참조)는 사용할 수 없습니다, 웜 웜 1 µ S 기저 에/L pipetted 25 µ L/잘 사용 하 여 멀티 채널 피 펫의 최종 농도에 희석 수 있습니다. 그러나, 결과 증가 다양성을 전시할 지도 모른다. 또는, 양조위와 동료¹⁹에 설명 된 대로 연동 액체 디스펜서를 사용 하 여 가능 하다.
7. 벌레 384-잘 접시에 정렬 되었습니다, 후 가스 투과성 필름으로 접시를 봉인 하 고 24-48 h 25 ° C에서 번호판을 품 어.
8. 원하는 시간에 사용 하 여 microplate 세탁기 S 기저와 384-잘 접시 세척 5 회 총.
   1. 두 번째 세척 후 발음 미디어의 대부분, 격판덮개 우물의 아래에서 어떤 파편 든 지를 풀고 30 초 이상 microplate vortexer를 사용 하 여 흔들 ~ 20 µ L. 적극적으로 떠나).
9. 최종 세척, 20 µ L. 추가 50 µ L 0.98 µ M 핵 산의 아래 aspirate 상쾌한 얼룩 ( 재료의 표참조) 후 / 384-잘 접시 0.7 µ M의 최종 농도 대 한의.
10. 12-16 h에 대 한 실 온에서 품 어. 이 염료는 죽은 벌레를 얼룩만 것 이다. 원하는 잠복기, 후 microplate 세탁기를 사용 하 여 어떤 과잉을 제거 하는 세척 접시 (최소 3 세척) 얼룩.
11. 데이터 수집을 위한 이미지 전송된 빛과 형광 (531 nm 여기 및 593 방출) 하는 분 광 광도 계 또는 자동화 된 현미경을 사용 합니다.
    1. 낮은 배율 목표를 사용 하 여 이미지 캡처 전체 잘 수 있도록.
    2. 또는, 흐름 vermimetry를 사용 합니다. 이 기술은 크기와 강하게 cytometry 비슷한 패션에 (즉, C. 선 충) 모든 생물의 형광 측정 웜 fluorimeter 대형 개체 흐름 cytometer를 사용 합니다.
12. 자동된 이미지 분석 소프트웨어 (예: CellProfiler, MatLab http://cellprofiler.org/에 따라 무료 이미지 분석 스튜디오)을 사용 하 여 형광 및 총 웜 지역 편견된 패션에 잘 당 계산 하.
    참고:이 숫자의 지 수 각 잘 분수 죽음을 나타냅니다. 하나 잘 했다면 7 스테인드 20 개 벌레 총, 0.35 또는 35%를 구성 하는 분수 죽음 다음.
    1. 처음 사용 전에 수동 채 점 하 여 자동된 이미지 처리 파이프라인의 유효성을 검사 해야 합니다. 이것은 자동화 된 파이프라인에서 점수 시각 이미지를 검사 하 고 그들 각각의 죽은 벌레의 분수를 기록 하 여 얻은 결과 비교 하 여 이루어집니다. 유효성 검사 프로세스 보장 자동된 이미징 처리에 대 한 매개 변수가 정확 하 고 올바르게 데이터를 표현 합니다.

5. 여러 심사 C. 선 충 종자 또는 Knockdowns (RNAi 스크린 설치)에 대 한 적응

참고: 이것은 24-잘 접시 설치에 대 한 설명 하는 RNAi 스크린입니다.

1. 24-잘 접시의 당 S 기저의 1 mL를 추가 (하십시오 단계 3.17.3 참조). 부드럽게 접시를 떨고 하 여 벌레를 선동 한 다음 웜 빈, 살 균 24 깊은 잘 격판덮개 전송. 웜 (~ 5 분)가 정착을 허용 합니다.
2. 약 1 mL을 떠나 상쾌한 발음 각 우물에 S 기초의 7 mL를 추가 합니다.
3. 5.1-5.2 최소 2 번의 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후 상쾌한 약 400 µ L를 떠나 발음.
4. 웜 분류 리샘플러 함수를 사용 하 여, 384-잘 접시 (384-잘 접시의 24-잘 접시 수익률 8-12 우물의 각 잘)의 각 음에 24-잘 플레이트 웜 정지에서 22 웜 정렬.
   1. 정렬 전에 기아, 384-잘 접시 (OP50, 같은 음식, 전적으로 긴장 또는 병원 성 긴장)으로 피 펫 박테리아 방지를 위해.
      참고: 병원 균은 2.3-2.5 또는 6.4 6.5 다음 단계 및 음식 소스 박테리아 그리고 희석 수 피 녹 농 균에 대해서 동일한 체계에 따라 추가 추가할 수 있습니다.
5. 후 웜 384-잘 접시에 정렬 되었습니다, 작은 분자 또는 다른 실험 관련 자료를 추가 합니다.

6입니다. E. faecalis 에 대 한 적응

참고: 피 녹 농 균 분석 결과에서 차이만 설명 합니다.

1. BHI (두뇌 심 혼 주입) 한 천 배지 위에 냉동된 재고에서 박테리아를 질주 하 고 37 ° c.에 16 ~ 24 시간 배양 하 여 E. faecalis 의 신선한 소스 준비
   참고: BSL-2 생물 안전 캐비닛 무 균을 보장 하기 위해 내부 E. faecalis 실험을 수행 합니다. 병원 성 감염 또는 오염 가능성을 최소화 하기 위해 적절 한 안전 조치를 사용 합니다.
2. 플레이트 4 ° C에서 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다. 이 기간 후 신선한 접시를 바꿉니다.
3. 웜, 정렬 하기 전에 밤 접종 3-5 mL의 단일 식민지와 살 균 BHI E. faecalis. 동요와 함께 37 ° C에서 12-16 h를 품 어.
4. P. 녹 농 균 (3 x 박테리아에 S 기초, OD₆₀₀≈0.09)에 관해서는 우물에 박테리아를 추가 합니다.
   참고: E. faecalis, 최종 잘 구성입니다: E. faecalis (OD₆₀₀≈0.03), BHI = 10 %v / v, 나머지 볼륨 S 기저의 구성. 기억 25 µ L S 기저의 벌레와 함께 전달 될 것 이다.
   참고: E. faecalis 흐린된 이미지를 일으키는 형광 얼룩을 흡수 하는 두꺼운 biofilms를 생성 합니다. 광범위 한 세척이이 biofilm를 제거 하는 데 충분 하지 수 있습니다. 이 경우 웜 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 빈 접시를 전송할 수 있습니다. 촉진 하기 위해 전송, 트윈 20 0.1% (v/v) 트윈 20 S 기저에 최종 농도에 S 기저에 추가할 수 있습니다. 이 biofilm에서 벌레를 제거에 원조.

Results

분석 결과 성능에 대 한 중요 한 매개 변수

이 분석 결과 기본 생물학에 대 한 적절 한 이해는 문제 해결 및 분석 결과 최적화 필요 합니다. 이 위해, 우리 몇 가지 주요 논문 elucidating P. 녹 농 균의 pathogenesis의 메커니즘에 먼저 참조-죽이 액체^7,20중재. 위에서 설명 하는 단계 (분석 결과 프로토콜의 회로도 그림 1 참조) 뒤에 C. 선 충 의 시간에 따라 살해 병원 체 (그림 2A)의 존재만 관찰 됩니다. 반면, 주요 영양 보조 제 (예를 들어, 는 펩은 미...

Discussion

이 분석 결과 (또는 다른 병원 체 피 농 균 또는 E. faecalis대체 됩니다 유사한 분석 실험)는 다양 한 약물 발견을 포함 하 여 목적에 대 한 유용 합니다. 그것은 또한 독성 요인, 호스트 방어 통로의 설명을 식별 하 고 호스트 병원 체 상호 작용에 관련 된 규제 기계를 확인 하 여 근본적인 생물학 질문을 해결 하는 데 유용.

P. 농 균 액체 죽이 분석 결과 강력한, 실패의 기회를 최소화 하기 위해 주의 지불 한다 어디 몇 가지 포인트가 있다. 첫째, 앞에서 언급 했 듯이, 피 녹 농 균 예방 접종에 대 한 세균 소스 접시 박테리아 독성, 파운드에서 하룻밤 성장에도 불구 하 고 분실 하지 않도록 신선한, 유지 되어야 합니다. 둘째, 칼슘 및 마그네슘 P. 농 균 죽이 분석에 추가 다는 것을 확인 하는 키입니다. 그것 없이, 독성은 크게 손상 될 것입니다. 마지막으로, 그것은 (RNAi 기...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
COPAS FP BioSorter	Union Biometrica		대형 객체 유세포 분석기/웜 분류기
Cytation 5	BioTek
EL406 워셔 디스펜서	BioTek
Multitron Pro	Infors HT
24 Deep-Well RB Block	Thermo Fisher Scientific	CS15124
384-Well plate	Greiner Bio-One	MPG-781091
선충 성장 매체(NGM)			당 양: 한천 18g, NaCl 3g, 펩톤 2.5g, CaCl 1mL2(1M), 1mL MgSO4(1M), 25mL 인산염 완충액 및 milli-Q water
SK(Slow Killing) 플레이트			973mL리터당 양: 한천 18g, NaCl 3g, 펩톤 3.5g, CaCl 1mL2(1M), 1mL MgSO4(1M), 25mL 인산염 완충액 및 973mL의 milli-Q water
Slow Killing(SK) 매체			리터당 양:  NaCl 3g, 펩톤 3.5g, CaCl2 (1M), 1mL MgSO4(1M), 25mL 인산염 완충액 및 milli-Q 물
용원 육수(LB)	973mLUSBiological Life Sciences	L1520
Brian Heart Infusion Broth(BHI)	Research Products International Corp	50-488-526
웜 표백제 용액			100mL당 양: 5M NaOH 용액 10mL, 5% 차아염소산나트륨 용액 20mL, 멸균수 S 70mL
S 리터당 기본			양: NaCl 5.85g, KH2PO4 1g, K2HPO4 1g, 및 1리터의 milli-Q 물
한천	USBiological Life Sciences	A0930
NaCl	USBiological Life Sciences	S5000
Peptone	USBiological Life Sciences	P3300
CaCl2	USBiological Life Sciences
MgSO4	Fisher Scientific	M63-500
인산염 완충액			양: K2HPO4 132mL(1M) 및 KH2PO4(1M) 868mL
KH2PO4	Acros Organics	7778-77-0
K2HPO4	USBiological Life Sciences	P5100
5% 차아염소산나트륨 용액	BICCA	7495.5-32
NaOH 솔루션	Fisher Scientific	SS255-1
호흡이 쉬운	다양한 생명 공학	BEM-1
SYTOX 오렌지 핵산 염색	Fisher Scientific	S11368
<강한>박테리아 균주
P. 녹농균 (PA14)
< em>E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi 발현 박테리아 (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP 리포터 (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)