Spectrophotometric Cyanobacterium Synechocystis 에서 Phycobiliprotein 콘텐츠 결정

요약

여기, 선물이 양적 phycobiliprotein cyanobacterium Synechocystis spectrophotometric 메서드를 사용 하 여에서 콘텐츠를 결정 하는 프로토콜. 추출 프로시저 또한 성공적으로 다른 박테리아 및 조류 긴장;에 적용 했다 그러나, 안료 흡수 스펙트럼에 있는 변이 때문 그것은 각 스트레인에 대 한 spectrophotometric 방정식을 개별적으로 테스트 하는 데 필요한입니다.

초록

이것은 모델 cyanobacterium Synechocystisphycobiliprotein 콘텐츠의 양적 결정에 대 한 간단한 프로토콜 이다. Phycobiliproteins 있습니다 phycobilisomes, 박테리아에서 주요 광 수확 안테나의 가장 중요 한 구성 요소와 여러 조류 taxa. Synechocystis 의 phycobilisomes 포함 두 phycobiliproteins: phycocyanin와 allophycocyanin. 이 프로토콜은 간단 하 고, 효율적인, phycocyanin와이 모델 cyanobacterium에서 allophycocyanin의 양적 결정에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 우리는 phycobiliprotein 추출 및 spectrophotometric 정량화의 몇 가지 메서드를 비교. 이 프로토콜에서 설명 된 대로 추출 절차는 Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., 같은 다른 박테리아 변종에도 성공적으로 적용 했다 그리고 Nostoc sp., 또한 레드 조류 Porphyridium cruentum로. 그러나, 다양 한 taxa에서 특정 phycobiliproteins의 소멸 계수 다를 수 있습니다 그리고 그것은, 따라서, 개별적으로 모든 단일 스트레인에 대 한 spectrophotometric 정량화 방법의 유효성을 검사 권장. 프로토콜은 시간이 좀 필요 하 고 그것만 표준 장비를 필요로 하기 때문에 모든 표준 생명 과학 실험실에서 수행할 수 있습니다.

서론

fPhycobiliproteins는 간결한 박테리아 (Cyanophyta)에서 광 수확 안테나와 여러 진 핵 taxa (Glaucophyta, Rhodophyta의 주요 구성 요소를 나타내는 수용 성 색소 단백질 복합물 , 및 Cryptophyta)¹. 그들은 phycobilisomes 라는 supramolecular 단지도 주로 발생 하 고 Cryptophyta, 어디는 phycobiliproteins 지역화는 제외한 stromal 측에 광합성 세포 막의 표면에 일반적으로 연결 되는 thylakoid 루멘². 네 가지 유형의 phycobiliproteins 날짜까지 확인 되었습니다: 코어 allophycocyanin 및 주변 phycocyanin, phycoerythrin, 및 phycoerythrocyanin¹. 주요 빛 수확 단지로 phycobilisomes 조류와 남조류의 대량 문화 생산성의 중요 한 요소 중 하나를 나타냅니다. 그것은 그 phycobilisomes 잘림 강한 빛³바이오 매스 축적을 향상 시킬 수 입증 되었습니다. 다른 ....

프로토콜

1. 남조류 재배

1. Synechocystis 셀 삼각 플라스 크 또는 photobioreactors^10,19 (예를 들어, 17 mM HEPES¹⁰를 사용 하 여) < 10의 pH를 유지 하기 위해 버퍼 BG11 중간²⁰ 에서 육성.
   참고: 표준 재배 조건 필요 제어 온도 (일반적으로 30 ℃, 최적 온도 35 ° C)²¹, 조명 (800 µmol [광양] 최대 강도의 일반적으로, 하얀 빛 / [m²·s])²¹, 그리고 CO ₂ 공급 (400 mL 평면 패널 photobioreactor CO₂ 농도 포화 성장 1700 ppm 이다)²¹.
2. 문화의 밀도 확인 하려면 spectrophotometrically 730에서 문화 광 밀도 측정 nm (OD₇₃₀) 또는 빛 경로 1 cm.의 베트를 사용 하 여 현미경으로 hemo....

결과

초기 메서드 테스트에 대 한 Synechocystis BG11 재배 매체²⁰ (17 mM HEPES 보충) 25 ° C, 50 µmol (광자)의 농도의 따뜻한 하얀 빛 아래에서 재배 통에 삼각 플라스 크에 배치 문화로는 / (m ²·s)와 1% CO₂ 자란 분위기에. 재배 기간 동안 문화 안전 잠금 튜브로 샘플링 된 centrifuged (15000 x g 5 분 동안 실험실 온도에서)는 상쾌한, 폐기 및 샘플 중-80 ° C에 저장 되었고 동결에 대 한 준비로는 이 프로토콜의 각 단계 또는-20 ° C 또는 추출 및 quantifications 비교 분석-80 ° C에 저장.

테스트 추출 절차 쥡니다, PBS 버퍼 및 동결 해빙 내 지 르 코니 아.......

토론

이 프로토콜 모델 cyanobacterium Synechocystis에서 phycobiliprotein 콘텐츠의 정량화에 대 한 간단한 빠르고 재현할 수 방법을 설명합니다. 셀 균질, 단백질 추출과 phycocyanin와 allophycocyanin 정량화의 몇 가지 메서드를 비교 하 고 마지막 프로토콜의 모든 단일 절차의 최적의 단계 조합을 나타냅니다. 대표적인 데이터, phycobiliproteins의 콘텐츠는 빛의 강도 증가에서 Synechocystis 셀에 정량 했다. 비록 분석이 비슷한 시간 및 실험실 장비 이전 게시 방법^{12,13,14,,1516}의 일부로,이 프로토콜의 장점은 아무 엽록소는 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Synechocystis sp. PCC 6803	Institut Pasteur, Paris, France	6803	시아노박테리움 균주
Roti-CELL PBS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	9143.1	인산염 완충 식염수(PBS) 용액, pH 7.4
Eppendorf safe-lock tubes	Eppendorf, Hamburk, Germany	30120086	Safe-lock tubes 1.5 ml
VWR 80-Place Storage System	VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA	30128-282	Safe-lock 튜브 홀더
RAININ 100 &마이크로; L -1000 &마이크로; 엘	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	17014382	피펫
GP-LTS-A-1000µ L-/F-768/8	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA	30389272	피펫 팁
Rotina 420R	Hettich, Kirchlengern, Germany	4701	1.5 ml 안전 잠금 튜브 및 15 ml 원추형 원심분리기 튜브용 냉장 원심분리기
LCexv 4010	Liebherr, Bulle, Switzerland	9005382197172	냉장고 및 냉동고 -20  &데그; C
Revco ExF -86° C 직립형 초저온 냉동고	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	EXF24086V	냉동고 -80  &데그; C
CoolSafe	LaboGene, Lillerø d, 덴마크	7.001.000.615	동결 건조기
UV-2600	Shimadzu, 교토, 일본	UV-2600	분광 광도계
Hellma 흡수 큐벳, 세미 마이크로	시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	Z600288	VIS/UV-VIS 반마이크로 큐벳 0.75-1.5 ml, 스펙트럼 범위 200-2500 nm
Silamat S6	Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein	602286WU	균질화기
고체 유리 구슬	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	Z273627	지름의 유리 구슬 2  mm
CPA225D-0CE	Sartorius AG, Gö ttingen, 독일	SECURA225D-1OBR	분석 저울
C-Phycocyanin from Spirulina sp.	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	P2172	Phycocyanin 표준
Allophycocyanin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7472	Allophycocyanin 표준
Bicinchoninic Acid Kit	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	BCA1, B9643	총 단백질 결정을 위한 완전한 키트
AlgaeTron	Photon System Instruments Ltd., Drá sov, 체코 AG	130-ECO	E. 플라스크용 배양실, 제어 가능한 빛과 분위기
광생물반응	Photon System Instruments Ltd., Drá sov, 체코 공화국	FMT-150	완전히 제어 가능한 환경을 가진 시아노박테리아 및 조류를 위한 재배 장비
셀로미터	Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA	Auto M10	Cell counter
Corning 15 mL 원심분리기 튜브	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS430791	건식 웨이그 샘플링을 위한 15ml 원심분리기 튜브
Herasafe KS	Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	51024579	층류 후드

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