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방법 논문

뼈 재생을 위해 생체에서 생물학적 호환성 프로필

12.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58077

⸱

2018년 11월 16일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

이 논문에서

요약

큰 뼈 장애 복구에 대 한 설계 새로운 생체 재료의 수는 지속적으로 뼈 이식 수술과 관련 된 합병증을 극복 하 고 뼈 치유 향상을 목표로 확장 됩니다. 여기, 우리는 뼈 수리에 대 한 생체의 전 임상 생체 적합성 테스트를 위한 종합 전략을 제시.

초록

큰 비-연합 뼈 골절은 정형 외과 수술에 중요 한 도전입니다. 자동-및 수용자 뼈 이식 같은 병 변 치유를 위한 훌륭한 있지만, 그들의 사용을 가진 잠재적인 합병증이 있다. 따라서, 물자 과학자는 이러한 문제를 극복 하기 위해 합성, 생체 바이오 소재 개발 하 고 있다. 이 연구에서 우리는 뼈 수리에 대 한 생체 재료를 평가 하기 위한 종합 플랫폼 제시. 우리는 뼈 생물학 및 면역학 생체 외에서 osteoclast (OC)와 osteoblast (OB) 분석 실험 및 뼈 수리, immunogenicity, 및 allergenicity의 마우스 모델 vivo에서 포함 하는 플랫폼을 개발 하는 전문성을 결합. 실험을 수행, 결과 요약 및 생체 적합성 소재에 보고 하는 방법을 보여 줍니다. 특히, 테스트 산부인과 생존, 차별화, 그리고 강화 작용 및 OC 생존 및 차별화 β tricalcium 인산 (β-TCP) 디스크의 맥락에서. 우리는 또한 뼈 치료의 초기 단계에 대 한 효과 결정 하기 위해 뼈 수리 calvarial 뼈 크기의 중요 한 결함 마우스 모델에 대 한 임상 사용 상용 물자 인 β-TCP/콜라겐 (β-TCP/C) 거품을 테스트. 병렬 실험에서 우리는 쥐의 면역 및 알레르기 반응을 평가. 우리의 접근 방식은 다양 한 매개 변수 뼈 치유 및 복구 환자에 사용 하는 생체 재료의 생체 적합성 예측에 필요한 뼈 소재의 생물학 호환성 프로 파일을 생성 합니다.

서론

뼈 수리 혈 종 형성, 염증으로 시작 하는 복잡 한 과정, callus 형성 및1,2를 개장 하는 다음. 그러나, 뼈 재생 잠재적인 뼈 골절1,3의 크기로 제한 됩니다. 예를 들어, 큰 뼈 골절 외상, 암이 나 골다공증으로 인 한 치유 되지 않을 수 있습니다 그리고 비 연합 뼈 골절을 불린다. 이러한 뼈 병 변은 종종 건강 한 생리 뼈 수리 및 재생을 촉진 하는 치료를 필요로 합니다. 현재, autograft와 이식 뼈 이식 선택4 2.2 백만 뼈 대체 절차의 접근은 매년5. 비록 이러한 절차 높은 성공률을가지고, 합병증, 예를 들어 제한 된 가용성 뼈, 감염, 기증자 사이트 사망률, 그리고 거부4의 있을 수 있습니다. 뼈 조직 공학에 대 한 새로운 대안 이러한 과제를 해결 하기 위해 모색 되 고 있다.

천연 또는 합성 고분자, bioceramics 또는 세포 및 생리 활성 분자와 함께 금속 기반 생체 재료의 설계는 상승6에. 생리 뼈 치유와 생체의 맥락에서 치유의 우리의 현재 이해 기계적 특성 등 여러 요인 및 순환 및 골절 사이트7에서 셀을 포함 하 여 여러 로컬 및 조직 요인에 따라 달라 집니다. ,,89. 뼈 재생을 위한 바이오 osteogenicity 및 osseointegration10 홍보 하는 것을 목표로 고 이상적으로 생체, 생 분해성, 다공성 (추진 셀 마이그레이션, 산소, 영양분) 이다. 그들은 또한 고통을 구호 하 골절 사이트를 지원 하기 위해 충분히 강할 필요가. 또한, 선 동적인 요인 치유 과정을 시작 하려면 필요 합니다. 그러나, 경우는 소재는 과도 한 염증 및 알레르기 성 응답을 유도, 제한 하거나 뼈11,12치유를 억제 수 있습니다이. 따라서, 학 제 적인 접근은 뼈 수리를 위해 개발 하는 바이오 소재를 평가 하는 데 필요한.

이 연구에서는 거품 tricalcium 인산 염으로 구성 된 상용 수가 뼈 이식 대용품 이다 나노미터 크기의 순수한 β tricalcium 구성 1) Orthovita Vitoss 대표 물질의 전 임상 평가 소개 인산 (β-TCP) 입자와 유형 1 소 콜라겐 (C) (β-TCP/C 거품)과 2) β-TCP 디스크. 여기, 우리는 기본 osteoblast (OB)를 사용 하 여 이러한 생체 재료의 생체 적합성 테스트 설명 및 osteoclast (OC) 분석 실험, 뼈 복구, T 림프 구 확산 체 외에서 구성 된 면역학 평가의 vivo에서 모델 및 cytokine 생산, 그리고 vivo에서 immunogenicity allergenicity, 이전에 보고 된13.

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프로토콜

절차는 BALB/c 마우스 관심과 오스트리아 정부 교육, 과학 및 연구의 실험 동물의 사용에 대 한 모든 지침을 끝내 고 오스트리아 교육부, 과학의 윤리학에 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 연구입니다.

1. 기본 마우스 산부인과 문화

  1. 산부인과에서 신생아 마우스 calvaria 소화 효소를 사용 하 여 격리
    1. 1-2 일 된 신생아 강아지 (총에서 60) 잘린 여 euthanize 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 살 균 1 페 트리 접시에 머리를 배치.
    2. 머리, 목의 목 덜 미를 잡고 하 고 떨어져 살 균가 위를 사용 하 여 피부를 잘라. 그것은 피어 싱으로 calvarium incise (약 0.1-0.3 m m) 그 다음은 두개골의 기지에서 머리 뒤쪽 calvarium 아래 삽입 되 고 귀 그리고 어 보 브의 위 앞 옆에서 다시 calvarial 가장자리를 잘라가 위를 전자 코 다리 (그림 1).
    3. 살 균 필터 소화 솔루션의 8 mL와 해 부 calvaria 품 어 (α-최소 필수 매체 (α-MEM) 300 단위/mL 콜라 유형 IV와 2.14 단위/mL dispase II 해산) 200 쉐이크에 떨고 인큐베이터에서 10 분 동안 37 ° C에서 50 mL 원뿔 튜브에 /min입니다.
    4. 첫 번째 상쾌한 무시 고 소화 프로시저 소화 솔루션의 8 mL를 세 번 반복 합니다. 셀을 포함 하는 각 소화 단계 후 상쾌한 수집 하 고 50 mL 원뿔 튜브에 추가. 소화 절차 (약 40 분) 완료 될 때까지 얼음 물 목욕에 셀으로 50 mL 원뿔 튜브를 저장 합니다.
    5. 300 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 (진공 펌프에 연결 된 파스퇴르 피 펫)와 상쾌한 발음 하 고 뼈 성장 매체 (BGM)의 α-MEM 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 포함 된 40 ml resuspend 페니실린-스 솔루션입니다. 4 조직 문화 접시 (10 cm)에 세포 현 탁 액 10 mL를 추가 합니다.
    6. 37 ° C, 5% CO2 셀 합류 (2-3 일)까지 문화.
    7. 합류에서 오래 된 매체를 발음 하 고 조직 문화 접시 1 x PBS (37 ° C)와 한 번 씻어. PBS를 발음 그리고 각 10cm 조직 문화 접시에 0.5 %ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)을 포함 하는 1 x trypsin 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다.
    8. 5 분 동안 37 ° C, 5% CO2 4 문화 접시를 품 어 고 플라스틱에서 셀 분리는 되도록 거꾸로 가벼운 현미경으로 번호판을 확인 합니다. 다음 모든 셀 정지 (총 8 mL) 신선한 BGM의 10 mL를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브 전송. 각 판 5 mL 신선한 BGM과 같은 50 mL 원뿔 튜브에 씻는 다.
    9. 300 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심는 상쾌한 발음 하 고, 16 ml 신선한 BGM의 셀 resuspend. 16 새로운 10cm 조직 문화 접시 (분할 1:4) 포함 된 BGM의 9 mL를 준비 합니다. 각 접시에 세포 현 탁 액 1 mL를 추가 합니다.
    10. 1.1.6 단계를 반복 합니다. 1.1.8 하.
    11. 300 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심는 상쾌한 발음 하 고, 신선한 BGM의 10 mL에 resuspend. 셀을 계산 하 고 셀 농도 계산.
      참고:이 절차는 약 7.5-8.3 105 셀/강아지 x를 생성합니다.
    12. 4 ° C에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심은 상쾌한 발음 하 고 중간 포함 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), 40% α-MEM 및 50%에 resuspend FBS. 세포 현 탁 액의 1.5 mL 유리병 당 2 × 106 세포의 총 2 mL cryovials 전송.
    13. 플래시는 액체 질소 탱크에서 장기 저장을 위한 액체 질소에 튜브를 고정 합니다. 1 년 이내 셀을 사용 하 여 전체 기능을 보장. 이러한 기본 OBs를 사용 하 여 확산 (1.2 단계), 차별화를 평가 하기 위한 (ALP 분석: 단계 1.4., 1.5.)와 생체 재료의 강화 (1.6 단계.). 이러한 세포를 사용 하 여 공동 문화 (2.3 단계) OC 선구자 뼈 골 수 유래의 성숙에 대 한.
  2. 산부인과 확산 분석 결과
    1. 전 37 ° C, 5% CO2 컨트롤에 대 한 기본 OBs. 사용 표준 조직 배양 배지를 추가 하기 전에 24 시간에서 24-잘 서 스 펜 션 문화 접시 및 소재 샘플을 위한 서 스 펜 션 문화 판에 BGM의 1 mL에 14 m m 직경 β-TCP 디스크를 품 어 플라스틱에 셀 첨부를 하지 마십시오.
    2. 발음 사전 인큐베이션 매체 및 다음 기본 마우스 OBs BGM에 resuspend. 24-잘 조직 배양 플레이트 (1 mL/음)에 4.4 x 104 OBs/cm2 미리 incubated β-TCP 디스크에 24-잘 서 스 펜 션 문화 접시에서와 컨트롤 그룹에 대 한 추가 합니다. OBs는 조직 배양 플레이트 나는 소재에 연결 됩니다.
    3. 37 ° C, 5% CO2에 14 일에 품 어. 인큐베이션 기간 동안 매체 2-3 일 마다 변경 하 고 각 우물에 신선한 BGM의 1 mL를 추가 합니다.
    4. 산부인과 확산을 평가 하기 위해 전송 β-TCP 디스크 7-14 일에 현 탁 액 문화 접시에 성장 하는 세포에서 신호를 제외 하려면 새로운 우물.
    5. 오래 된 매체를 발음, BGM (37 ° C)의 0.5 mL을 추가 하 고 30 분에서 37 ° C, 5% CO2배양 배지를 품 어. 다음 셀 확산 시 약 x 10의 55 µ L를 추가 (1시 10분 희석) 잘 문화에 직접. 공백, 3 웰 스 BGM의 0.5 mL 및 55 µ L 10 x 셀 확산 시 약의 준비. 37 ° C, 5% CO2에서 30 분 동안 모든 접시를 품 어.
    6. 철회 및 검은 96 잘 접시에는 상쾌한의 150 µ L 각 우물에서 전송 및 560 nm에서 여기와 590에서 방출 형광을 읽고 nm. 샘플 수치에서 빈 수치를 뺍니다.
  3. 산부인과 차별화 및 강화 분석 실험
    1. 전 37 ° C, 5% CO2 컨트롤에 대 한 OBs. 사용 표준 조직 배양 배지를 추가 하기 전에 24 시간에서 24-잘 서 스 펜 션 문화 접시와을 피하기 위해 소재 샘플에 대 한 서 스 펜 션 문화 판에 BGM의 1 mL에 14 m m 직경 β-TCP 디스크를 품 어 플라스틱을 셀 첨부 합니다.
    2. 발음 사전 인큐베이션 매체 및 다음 기본 마우스 OBs BGM에 resuspend. 24-잘 조직 배양 플레이트 (1 mL/음)으로 미리 incubated β-TCP 디스크에 104 OBs/cm2 x 8.8 24-잘 서 스 펜 션 문화 접시에서와 컨트롤 그룹에 대 한 추가 합니다. OBs는 조직 배양 플레이트 또는 소재 샘플에 연결 됩니다.
    3. 포함 된 BGM, 50 µ g/mL ascorbic 산 5 m m β-glycerophosphate 24 h는 OBs의 추가 후 osteogenic 강화 매체 (MM)의 1 mL와 BGM을 장착 하 고 37 ° C, 5% CO2에 14 일에 품 어. 각 잘 갓된 m M의 1 mL와 함께 2-3 일 마다 매체를 변경 합니다.
  4. 산부인과 분화 세포 lysates에서 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 활동에 의해 평가
    1. 하루 7 m M의 추가 후에 높은 산 활동을 측정 하는 우물에서 문화 매체를 발음 하 고 살 균 1 x PBS (37 ° C)의 1 mL로 씻어. 조심 스럽게-80 ° c.에 플레이트를 고정 하 고 조직 문화 플라스틱이 나 소재에 유지 하는 연결 된 셀 수 있도록 PBS 발음
    2. 24 시간 후 (또는 최대 2 주), 제어 조직 문화 접시와 실내 온도 (RT) 산부인과 세포에 대 한 준비 하에 소재 현 탁 액 문화 접시를 녹여. 소재 샘플에 대 한 β-TCP 디스크 접시에 연결 된 셀을 제외 하는 새로운 서 스 펜 션 문화 접시에 전송 합니다. 두 접시를 세포 세포의 용 해 버퍼 x 1의 당 75 µ L를 추가 합니다. 400 쉐이크/분 통에 5 분 동안 접시를 흔들어.
    3. 0.5 mL microcentrifuge 튜브 및 파편을 제거 하는 RT에 6 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기에 세포 lysate를 전송할. 검은 96 잘 접시에 샘플 세포 lysate 상쾌한의 50 µ L을 추가 하 고 50 µ L 200 µ M 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl 인산 염 (DiFMUP) fluorogenic 기판 ALP 버퍼 (pH 10) 잘 당 x 2에 녹아 구성 된 솔루션의 추가. 1 x 세포 세포의 용 해 버퍼와 2 x ALP 버퍼를 포함 하는 1:1 솔루션의 100 µ L로 두 빈 우물을 설정 합니다.
    4. 8 기준 100 μ/는 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU)까지 0.5에서 1 x 세포 세포의 용 해 버퍼 및 표준 참조 커브를 생성 하는 2 x ALP 버퍼를 포함 하는 1:1 솔루션에 녹아 200 μ M와 잘 준비 합니다.
    5. 15 분 동안 37 ° C에서 검은 접시를 품 어 하 고 다음 읽기 358 nm에서 여기와 455에서 방출 형광 nm. 참조 표준에서 빈 읽기와 샘플 수치를 뺍니다.
    6. 단백질 농도 대 한 색도계 분석 실험을 사용 하 여 단백질의 총 금액을 세포 lysates에서 ALP 효소 활동을 정상화. 준비 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 단백질 기준 범위 0.05-2.5에서 µ g / µ L 표준 곡선을 생성 하기 위해 세포 세포의 용 해 버퍼 x 1에 녹아.
    7. 샘플 세포 lysates 및 BSA 단백질 표준 중복을 준비 합니다. 96 잘 접시에 샘플 세포 lysate의 5 µ L 또는 표준 BSA 단백질의 5 µ L을 추가 하 고 다음 시 A 약의 25 µ L을 추가 ' 및 세포 세포의 용 해 버퍼 x 1의 5 µ L로 두 빈 우물을 시 나 설정의 200 µ L. 15 분에 대 한 실시간에 번호판을 품 어 고 690에서 흡 광도 읽고 다음 nm. 참조 표준에서 빈 읽기와 샘플 수치를 뺍니다.
  5. 세포 배양에서 ALP를 얼룩에 의해 평가 하는 OB 차별화
    1. 하루 7 제어 조직 문화 접시에 현 탁 액 문화 접시에 소재 m M의 추가 후에 교양된 OBs에서 ALP를 얼룩.
    2. 우물에서 문화 매체를 발음 하 고 1x PBS (37 ° C)의 0.5 mL와 함께 그것을 대체. PBS를 발음 하 고 1 분 동안 RT에서 버퍼링 하는 10% 포 르 말린의 0.5 mL에 그들을 배양 하 여 세포를 수정.
    3. 단일 사용 피펫으로와 버퍼링 10% 포 르 말린을 발음 하 고 워시 버퍼 (0.05% Tween20 1 x PBS에) 0.5 mL를 추가 합니다.
    4. 1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl 인산 염/니트로 블루 tetrazolium (BCIP/NBT) 기판 태블릿 초순과 완전히 해산 때까지 소용돌이의 10 mL에 용 해. 솔루션 빛에서 보호 하 고 2 시간 이내에 사용 해야 합니다.
    5. 워시 버퍼를 발음 하 고 BCIP/NBT 기판 솔루션의 0.5 mL를 바꿉니다 및 RT에 접시 10 분 Aspirate에 대 한 어둠 속에 얼룩 솔루션을 품 어 워시 버퍼의 0.5 mL를 바꿉니다.
    6. 새로운 우물으로 얼룩진된 β-TCP 디스크 전송 및 ALP 묻은 접시 기록 ALP 얼룩을 기존의 평판 스캐너로 스캔.
  6. 오늘 강화 알리자린 레드 S (ARS)와 얼룩에 의해 평가
    1. M M의 추가 후 기본 OBs 14 일을 포함 하는 우물에서 문화 매체를 발음 하 고 린스 두 번 실시간 Aspirate에서 1 x PBS의 0.5 mL PBS 0.5 mL 10%의 10 분에 대 한 실시간에 말린 솔루션을 버퍼링 추가 하 여 셀을 해결.
    2. 단일 사용 피펫으로와 버퍼링 10% 포 르 말린을 발음 하 고 초순의 0.5 mL로 두 번 씻어.
    3. 고정된 OBs 40mm ARS 얼룩 솔루션 (pH 4.2)의 0.25 mL 초순에 녹이 고 100 쉐이크/분 통에 10 분에 대 한 실시간에 접시를 품 어 추가 합니다.
    4. 단일 사용 피펫으로 얼룩 솔루션을 발음 하 고 초순 물 1 mL로 씻어. 난다 제거 하려면이 시간 5-10 단계 반복 얼룩.
      참고: 헹 구는 솔루션 색 이어야 한다.
    5. 초순 수를 발음 하 고 차가운 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 100 쉐이크/분 통에 10 분에 대 한 실시간에 접시를 품 어.
    6. PBS를 발음 하 고 새로운 우물을 스테인드 β-TCP 디스크 전송 판 기록 강화를 평판 스캐너로 스캔.
    7. 10 %cetylpyridinium 염화 솔루션의 0.25 mL을 추가 하 고 분 100 쉐이크/ARS 염료를 추출 하는 통에 15 분 동안 RT에 접시를 품 어.
    8. 1.5 mL 튜브를 실시간에 5 분 동안 17000 x g 에서 원심 분리기는 supernatants 전송
    9. 희석 비율 1시 10분-1: 20의 추출 물에 10 %cetylpyridinium 염화 솔루션을 추가 하 고 샘플 (300 µ L)만 10 %cetylpyridinium 염화를 포함 하는 두 개의 빈 우물을 포함 하 여 96 잘 접시에 추가.
    10. 7 ARS 기준 표준 곡선을 생성 하기 위해 40mm ARS 솔루션 (pH 4.2) 10 %cetylpyridinium 염화 솔루션 얼룩을 diluting 하 여 400 µ M 4에서 배열 준비.
    11. 중복에 96 잘 접시 참조 표준의 300 µ L를 추가 합니다.
    12. 공백, 샘플의 흡 광도 읽었고 520에서 표준 참조 nm.
    13. 참조 표준에서 빈 읽기와 샘플 수치를 뺍니다.

2. 마우스 오브 OC 공동 문화 성숙 OCs 파생

  1. 준비 및 소 외피 뼈 조각의 살 균
    1. 주변 조직에서 뼈의 세그먼트를 청소 하 고 배수 뼈와 골 수를 제거.
    2. 24 h 50 ° C에서 뼈를 건조.
    3. 더 작은 조각으로 뼈를 슬라이스 하 고 조각 (약 300-350 µ m 두께)으로 잘라 다이아몬드 블레이드를 보았다 낮은 속도 사용 하 여.
    4. 2 차 디스크 (1 c m2)에 300-350 µ m 조각 잘라.
    5. 청소 하려면 뼈 디스크 (1 c m2), 잠금식 유리 유리병 및 채우기 증류수에 넣어. 초음파 목욕으로 채워진된 유리 제 작은 유리병을 전송 하 고 sonicate 5 분 세 번이이 단계를 반복 하는 동안.
    6. 증류수는 떨어져 따르십시오, 70% 에탄올을 추가 하 고 5 분 동안 sonicate.
    7. 70% 에탄올을 부 어와 100% 에탄올을 바꿉니다.
      참고: 최대 4 주까지 4 ° C에서 100% 에탄올에 뼈 조각을 저장 합니다.
    8. 무 균 조건 하에서 각 측에 15 분 동안 자외선과 뼈 조각을 비추는합니다 추가 사용까지 소독된 뼈 조각 RT에서 메 마른 문화 접시에 저장 합니다.
  2. 골 수 OC 선구자의 분리
    1. 순진한 8-12 주 오래 된 BALB/c 마우스의 200 mg/kg 케 타 민 및 24 mg/kg xylazine 솔루션의 복 (i.p.) 주사를 사용 하 여 안락사
    2. 마우스 화관과 경골에서 골 수 OC 전 격리 합니다.
    3. 엉덩이 관절에 신체에 가장 가까운 지점에서 멸 균가 위로 다리를 제거 하 고 무릎과 발목 관절에 팔 다리를 잘라 살 균 메스와 집게 부드러운 조직을 제거. epiphyses를 잘라. 제거 하 고 세포 현 탁 액을 얻기 위해 1 mL 주사기에 부착 된 27 G 바늘을 사용 하 여 6 cm 멸 균 페 트리 접시에 1 mL BGM으로 골 수를 일시 중단.
    4. 50 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 추가, 6 cm의 BGM과 같은 50 mL 원뿔 튜브에 5 mL를 페 트리 접시를 씻어. 5 분에 대 한 350 x g 4 ° c에서 원심 분리기 Resuspend BGM, 1 nM 1,25-(OH)2포함 된 OC 차별화 매체 (DM)에 셀-비타민 d 3와 1 µ M 스타 글란 딘 E2 (1 mL/음).
      참고: 하나의 BALB/c 마우스는 한 24-잘 문화 접시 OC 선구자의 충분 한 숫자를 제공합니다.
  3. 마우스 오브 OC 소재 공동 문화의 준비
    1. 전 품 어 14 m m 직경 β-TCP 디스크 또는 소 뼈 조각 (1 c m2) 1 mL에 BGM의 24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 에 24-잘 서 스 펜 션 문화 접시에 셀을 추가 하기 전에.
      참고: 소 뼈 조각은 physiologic 기판 제어 생체 존재 OC 차별화를 공부.
    2. 8.8 x 기본 OBs는 생체 또는 제어 뼈는 24-잘 서 스 펜 션 문화 접시에서 또는 24-잘 조직 문화 접시에 BGM에 정지의 104 셀/c m2 를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2 24 h에서 품 어.
      참고: OBs는 플라스틱이 나 소재 또는 소 뼈를 연결합니다.
    3. 갓 절연 24 h 골 수 OC 전 5 일 동안 37 ° C, 5% CO2 주 문화와 OBs 교양 추가 합니다. 매일 갓 OC dm 매체를 교체 합니다. 다음에 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 (트랩) OC 차별화를 평가 하기 위해 OCs 얼룩.
  4. OC 차별화 트랩 얼룩에 의해 평가
    1. 성숙한 multinucleated OCs, 단계, 2.3.3에서에서 얻은 특성 제어 조직 문화 접시와 소재 현 탁 액 문화 접시에서 배양을 발음 하 고 1x PBS (37 ° C)의 1 mL를 추가 합니다. PBS를 발음 하 고 10 분 RT에서 버퍼링 하는 10% 포 르 말린 용액 1 mL에 그들을 배양 하 여 세포를 고치십시오.
    2. 단일 사용 피펫으로 버퍼링 10% 포 르 말린 솔루션 발음 및 1 x PBS의 1 mL에 추가 실시간 반복이이 단계 세 번, PBS 발음, 트랩 버퍼 (pH 5)의 1 mL를 바꿉니다 그리고 30 분 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어.
    3. 트랩 버퍼를 발음 하 고 1:1 100% 아세톤과 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 30에 대 한 단일 사용 피펫으로 aspirate 아세톤-에탄올 솔루션을 신속 하 게 s. 완전히 실시간에 접시를 건조 RT에서 접시를 품 어
    4. 솔루션 얼룩 트랩에 대 한 준비는 10 mg/mL N, N-dimethylformamide 디졸브 0.6 mg/mL 빠른 붉은 보라색의 트랩 버퍼에 소금과 빠른 붉은 보라 빛 소금 10 mL 0.1 mL naphthol-AS-MX 인산 재고 솔루션의 추가에 naphthol-AS-MX 인산 재고 솔루션 트랩 버퍼에서.
    5. 트랩 솔루션 얼룩의 1 mL를 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어 다음 얼룩이 솔루션, 트랩을 발음 하 고 반응을 중지를 초순의 1 mL를 추가.
    6. 가벼운 현미경을 사용 하 여 빨간색 스테인드 OCs 관찰 새로운 우물으로 얼룩 후 β-TCP 디스크 및 소 뼈 조각을 전송 (배율: 10 배) 트랩 + 3 개 이상의 핵으로 성숙한 OCs를 열거 하 고.

3. 중요 한 크기의 마우스 Calvarial 결함 모델

  1. 0.1 mg/kg buprenorphine를 피하 주사 (사우스 캐롤라이나) 진통에 대 한 8 주 오래 된 BALB/c 마우스에.
  2. 100 mg/kg 케 타 민 및 5 mg/kg xylazine i.p.의 혼합물으로 마우스를 anesthetize, 그들을 축축한 유지와 저체온증을 방지 하기 위해 전체 절차 동안 37 ° C에서 난방 장치 플레이트에 마우스를 놓고 눈에 젤 이나 연 고를 추가 합니다. 발가락과 꼬리 핀치에 의해 마 취 깊이 평가 합니다.
  3. 귀 사이의 머리 위에 모피를 면도 하 고 7.5 %povidone 요오드 솔루션 및 70% 에탄올으로 표면 청소.
  4. 노출 하는 calvarium 고 메스로 근 근 의해 오른쪽 정수 리 뼈 위에 pericranium 결합 조직 제거 살 균 메스와 귀 사이 두개골 상단 화살 절 개를 중간 확인 합니다.
  5. 단계에서 오른쪽 정수 리 뼈는 ectocortex와 일부 endocortex 극복을 정상적인 염 분 해결책으로 일정 한 관개에서 직경 4 mm (2000 rpm)와 살 균 치과 판형을 사용 하 여 오른쪽 정수 리 뼈의 중요 한 크기의 결함을 만듭니다.
  6. Dura mater의 손상을 방지 하려면 나머지 endocortex를 돌파, 신중 하 게 calvarial 뼈를 들어올려 고 집게로 제거 작은 periosteal 엘리베이터를 사용 합니다. 결과 결함 직경에서 약 3.5 m m 원형 이어야 한다.
  7. 채워 calvarial 결함 미리 젖 (RT에서 살 균 1 x PBS) 집게를 사용 하 여 β-TCP/C 거품.
  8. 일치 하는 나이, 가짜 빈 결함 부정적인 컨트롤의 적절 한 수를 준비 합니다.
  9. 자리에는 소재를 유지, 두 반대 지점에서 결함의 가장자리에 조직 접착제의 0.5 µ L를 넣어.
  10. 비 흡수 성 봉합 사를 피부를 닫습니다.
  11. 마 취 마우스에 다음 수술을 수행 하기 전에 멸 균 상태를 유지 하기 위해 찬 sterilant와 모든 수술 기구를 청소.
  12. 수술 후 치료에 대 한 동물을 복구 기간 동안 적절 한 모니터링을 위한 수술 영역에서 37 ° C에서 건조 하 고 깨끗 한 난방 접시에 놓습니다. 그들은 일어날 때까지 호흡 속도, 온도 및 점 막 및 눈 마다 10 분의 색상을 모니터링 합니다.
  13. 음식과 물 전체 복구까지 다른 동물에서 분리와 함께 케이지에 운영된 의식 쥐를 전송 합니다. 0.1 mg/kg buprenorphine 주사 72 h. 반환에 대 한 하루에 두 번 수술 후 진통 치료에 대 한 사우스 캐롤라이나 완 그들의 감 금 소를 마우스.
  14. 소재의 효과 확인 하려면 200 밀리 그램/kg 케 타 민 및 24 mg/kg xylazine의 솔루션 마우스 i.p. 안락사.
  15. 8-12 주 후 이식에 안락사 마우스 날카로운가 위로 목을 벨.
  16. 수정 4.5 %30 mL에 잘린된 마우스 머리 버퍼링 조직에는 정착 액의 완전 침투 되도록 1-2 주 동안 말린 솔루션.
  17. 최대 1 년에 4 ° C에서 장기 저장을 위한 70% 에탄올으로 머리를 전송.
  18. 사용 하 여 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (microCT) 또는 뼈 재생을 평가 하기 위해 표준화 된 undecalcified 조직학 기술 계산. MicroCT 높은 해상도에서 사후 샘플에 대 한 검색을 사용 하 여 가능 하다 (90 k v, 4 분) 2D 및 3D 화살 및 정면 비행기에서.
  19. Undecalcified의 조직학에 대 한 에탄올의 성적 오름차순에서 머리를 탈수 하 고 글리콜 메 틸 메타 크 릴 산에 포함 합니다.
  20. 다이아몬드 톱으로 글리콜 메 틸 메타 크 릴 산 포함 된 블록을 잘라내어 약 80-100 µ m의 두께로 섹션을 갈기.
  21. Levai Laczko 뼈 섹션 스테인드 새로운 뼈 형성14식별을 평가 합니다.

4. 면역 반응 생체 외에서

  1. 순진한 8 주 오래 된 BALB/c 마우스 i.p. 200 mg/kg 케 타 민 및 24 mg/kg xylazine의 솔루션으로 안락사
  2. 마우스의 오른쪽에, 왼쪽에 모피를 면도 놓고 70% 에탄올과 복 부의 왼쪽에는 피부를 청소 합니다.
  3. 뒤로 살 균가 위를 사용 하 여 복 부에 갈비뼈를 따라 왼쪽에 마우스의 피부에는 길이가 10 mm이 고 1mm 깊은 절 개를 확인 합니다.
  4. 피부를 열고 후 복 막에 노출 합니다. 10 m m 길고 무 균 조건 하에서 위를 사용 하 여 복 막으로 1mm 깊은 절 개 보다는 더 적은 확인 합니다.
  5. 비장을 proximally 위를 밀어.
  6. 비장의 살 균 겸 부드럽게 잡고 고 조직과 그것을 아래에 첨부 하는 혈관을 절단 하 여 제거 합니다.
  7. 차가운 1x 살 균 PBS의 10 mL를 포함 하는 50 mL 튜브에 그대로 비장을 놓습니다.
  8. 2 살 균 겸 자 또는 2 살 균 유리 슬라이드를 사용 하 여 비장을 닦지에 의해 단일 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
  9. 1 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 차가운 1 x PBS를 가진 불 임 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 전달 하 여 파편을 제거 합니다.
  10. 단일 세포 현 탁 액 50 mL 원뿔 튜브에 4 ° C에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 발음 하 고, 삭제는 상쾌한. 다음에 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend.
  11. RT에서 14 분 세포 현 탁 액을 품 어 고 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체의 45 mL를 추가 하 여 반응을 중지.
  12. 4 ° C에서 10 분 동안 300 x g 에서 세포 세포의 용 해 한 후 세포를 원심 고는 상쾌한 다음 삭제.
  13. Resuspend splenocytes 10% 포함 된 RPMI 매체에 열-비활성화 FBS, 1% 페니실린 스 솔루션, 0.1 %gentamicin, 0.2% ß-mercaptoethanol, 및 1% 비 본질적인 아미노산.
  14. 전 셀 뿌리기 전에 37 ° C, 5% CO2 에서 24 h RPMI 매체를 포함 하는 96-잘 메 마른 문화 접시에 있는 β-TCP/C 거품을 품 어.
  15. 적정 한 숫자, 예를 들어splenocytes을 추가. 1.25 x 10,5, 2.5 x 105 와 5 x 105포함 된 RPMI 매체 및 첨가제, 또는 미리 incubated β-TCP/C 거품 없이 96-잘 조직 배양 플레이트에 웰 스 /well.
  16. 추가 10 µ g/mL concanavalin (Con A) 100 µ L/잘 적절 한 우물의 총에 대 한 매체에 녹이 고 다음 37 ° C, 5% CO2 72 h에 품 어.
  17. Bromodeoxyuridine (BrdU) 분석 결과와 세포 증식을 측정 합니다. 세포 배양의 48 h에 BrdU 라벨 솔루션의 10 µ L/잘 추가 하 고 추가 24 h에 대 한 접시를 품 어.
  18. 72 h에는 상쾌한을 수집 하 고 추가 사용까지-20 ° C에서 저장 합니다.
  19. 200 µ L/잘 고정 솔루션의 각 음을 추가 하 고에 실시간 Aspirate에서 30 분 동안 고정 솔루션 품 어. 100 µ L/잘 안티 BrdU 항 체 작업 솔루션을 추가 하 고 90 분 동안 품 어.
  20. 항 체 솔루션 발음, 세 번으로 200-300 µ L/잘 세척 솔루션의 웰 스를 헹 구 고 세척 솔루션을 제거.
  21. 100 µ L 기판 솔루션의 추가 RT에서 3-10 분 동안 품 어 다음 450에서 흡 광도 측정 nm.
  22. 인터 루 킨-1β (IL 1β), interleukin-2 (일리노이-2), 인터 루 킨-4 (IL-4) 및 인터페론-γ를 (IFN-γ) 수집된 supernatants 표준 ELISA를 사용 하 여 측정 합니다.

5. 높은 처리량 복 모델

  1. 100 mg/kg 케 타 민 및 5 mg/kg xylazine i.p.의 혼합물으로 여성 6 8 주 오래 된 BALB/c 마우스를 anesthetize 하 고 그들을 축축한 유지 하 고 저체온증을 방지 하기 위해 전체 절차 동안 37 ° C에서 난방 장치 플레이트에 마우스를 배치 하는 눈에 젤 이나 연 고를 추가 합니다. 발가락과 꼬리 핀치에 의해 마 취 깊이 평가 합니다.
  2. 복 부 털을 면도 하 고 7.5 %povidone 요오드 솔루션 및 70% 에탄올으로 청소.
  3. 교육을 따라 피부를 통해 8 m m 긴 중간 절 개 알바. 메스를 사용 하 여 복 막에 작은 절 개를 확인 합니다.
  4. 장소 살 균 PBS 복 막 구멍으로 β-TCP/C 거품 이식 (2 x 2 x 2 m m3) 젖 었 또는 없이 나이 일치 하는 가짜 통제 쥐에 대 한 자료를 추가 합니다.
  5. 복을 봉합 하 고 각각 흡수 성 및 비 흡수 성 봉합 사를 피부.
  6. 마 취 마우스에 다음 수술을 수행 하기 전에 멸 균 상태를 유지 하기 위해 찬 sterilant와 모든 수술 기구를 청소.
  7. 수술 후 치료에 대 한 동물을 복구 기간 동안 적절 한 모니터링을 위한 수술 영역에서 37 ° C에서 건조 하 고 깨끗 한 난방 접시에 놓습니다. 그들은 일어날 때까지 호흡 속도, 온도 및 점 막 및 눈 마다 10 분의 색상을 모니터링 합니다.
  8. 음식과 물 전체 복구까지 다른 동물에서 분리와 함께 케이지에 운영된 의식 쥐를 전송 합니다. 그들의 감 금 소를 완벽 하 게 복구 된 쥐를 반환 합니다.
    참고:이 절차는 최소한의 고통을 유도 한다. 수술 후 진통 요법 일반적으로 필요 하지 않습니다. 운영 0.1 mg/kg buprenorphine 주사 동물 고통의 흔적을 표시 하는 경우 사우스 캐롤라이나 또는 통증에 대 한 다른 적절 한 진통 약물.
  9. 200 mg/kg 케 타 민 및 24 mg/kg xylazine i.p. 솔루션 마우스 7 일 후 이식 안락사
  10. 7 일 후 이식에 게 1 mL를 사용 하 여 복 막 구멍 마우스 머리를 잡고 왼쪽된 낮은 복 부의 사분면에 바늘을 삽입 하 여 차가운 PBS의 3 mL의 총 25 G 바늘 주사 통 그리고 proximally 목표로.
    참고: 복 막 액체 RBCs의 무료 되어야 합니다.
  11. 4 ° C에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 복 막 게 유체 원심 고 IL 1β, 일리노이-2, 및 IL-4 cytokines의 ELISA 측정-20 ° C에서 저장 하는 복 막 액체를 수집 합니다.
  12. 발음은 상쾌한, 셀 펠 릿 1 ml의 PBS, resuspend 및 복 막 세포는 hemocytometer에 trypan 블루를 사용 하 여.
  13. Cytocentrifuge 유리 슬라이드에 5 x 105 세포에 세포 현 탁 액 건조 하 고 차동 셀 개수에 대 한 얼룩 슬라이드 수 있습니다.
  14. 가벼운 현미경을 사용 하 여, 총에서 300 셀의 최소를 계산 하 고 대 식 세포, 호 산 구는, 호 중구, 림프 톨 사이 차별화 합니다.

6. 아민 피하 모델

  1. 100 mg/kg 케 타 민 및 5 mg/kg xylazine i.p.의 혼합물으로 여성 6-8 주 오래 된 BALB/c 마우스를 anesthetize, 그들을 축축한 유지와 저체온증을 방지 하기 위해 전체 절차 동안 37 ° C에서 난방 장치 플레이트에 마우스를 놓고 눈에 젤 이나 연 고를 추가 합니다. 발가락과 꼬리 핀치에 의해 마 취 깊이 평가 합니다.
  2. 마우스의 뒷면에, 복 부 털을 면도 놓고 7.5 %povidone 요오드 솔루션 및 70% 에탄올과 면도 표면을 청소 합니다.
  3. 8 m m 긴 중간 절 개는 교육을 따라 피부를 통해 알바 메스 그리고 이식 PBS를 사용 하 여 복 부의 피부 아래 소재 (2 x 2 x 2 m m3) 젖 었 또는 아무 자료 나이 일치 하는 가짜 통제 쥐에 대 한 추가.
  4. 비 흡수 성 봉합 사로 봉합은 피부.
  5. 마 취 마우스에 다음 수술을 수행 하기 전에 멸 균 상태를 유지 하기 위해 찬 sterilant와 모든 수술 기구를 청소.
  6. 수술 후 치료에 대 한 동물을 복구 기간 동안 적절 한 모니터링을 위한 수술 영역에서 37 ° C에서 건조 하 고 깨끗 한 난방 접시에 놓습니다. 그들은 일어날 때까지 호흡 속도, 온도 및 점 막 및 눈 마다 10 분의 색상을 모니터링 합니다.
  7. 음식과 물 전체 복구까지 다른 동물에서 분리와 함께 케이지에 운영된 의식 쥐를 전송 합니다. 그들의 감 금 소를 완벽 하 게 복구 된 쥐를 반환 합니다.
    참고:이 절차는 최소한의 고통을 유도 한다. 수술 후 진통 요법 일반적으로 필요 하지 않습니다. 운영 0.1 mg/kg buprenorphine 주사 동물 고통의 흔적을 표시 하는 경우 사우스 캐롤라이나 또는 다른 적절 한 진통제.
  8. 때 이식 사이트 검토 준비, 200 mg/kg 케 타 민 및 24 mg/kg xylazine의 솔루션 마우스 i.p. 안락사.
  9. 8 주 후 주입, 주입 사이트 주위 조직 (1 c m2)을 삭제할.
  10. 버퍼링 4.5% 포 르 말린 용액에 하룻밤 조직을 해결 하 고 파라핀에 포함 한 4 µ m 섹션으로 잘라.
  11. 염증 또는 Masson의 콜라겐 증 착 및 섬유 증 trichrome Hematoxylin와 오신 (H & E) 4 µ m 파라핀 끼워 넣어진 조직 단면도 착 색.

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결과

Β-TCP 뼈 수리에 대 한 소재로 그것의 효과 대 한 평가, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 심사 방법 사용. 첫째, 우리는 초기 중간 혼자 컨트롤에 비해 β-TCP 디스크에 산부인과 응답 측정. 그림 2 문화의 7 및 14 일 OB 생존 β-TCP 디스크에 대 한 응답에서을 보여 줍니다. Β-TCP 디스크는이 소재는 강화도 산부인과 확산 억제를 나타내는 뿐만 아니라 조직 문화 플라스틱에서 매체와 문화 스에서 metabolically 활성 셀에서 측정 하는 세포 생존 능력 OBs에 대 한 동일 했다.

더 평가 OBs, 질적 및 양적 방법을 사용 하 여 차별화의 감 적으로 알프 활동을 측정 했습니다. 그림 2 는 문화의...

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토론

여기, 우리가 대표적인 바이오 뼈 재생 및 복구에 대 한 개발에 대 한 생체 적합성의 전 임상 평가 대 한 다양 한 접근 방식을 보여줍니다. 우리 OBs, OCs의 응답을 테스트 하 고 중요 한 뼈의 결함의 에 비보 치유 응답 모델 쥐 뿐만 아니라 에 체 외 그리고 vivo에서 면역 반응. 우리는 분석 작업과 데이터와는 생체 재료의 시험에서 파생 된 결론을 요약 설명 목적입니다. 우리는 우리의 전략 뼈 소재 생체 적합성의 귀중 한 프로필 생성을 보여줍니다.

1 차 셀 분석 OB와 OC 기능을 평가 하기 위해 사용 되었다. OBs는 뼈 형성과 생리 수리 하는 일을 담당 합니다. 그들은 가능한 유지, 차별화, 고 강화를 유도 해야 합니다. 이 연구에서 우리는 형성할 수 있는 능력으로 순수 차별화 된 세포의 표식으로 세포 생존 능력, ALP, 및 ARS에 대 한 분석을 수행 하는 방법을 보여줍니다. 분석에 대 한 컨트롤 포함 매체, 기준...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 연구 프로젝트 부여 계약 번호 263363 아래 유럽 연합의 일곱 번째 기구 프로그램 (FP7 2007-2013 년)에서 자금을 받고 있다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm)디스크를 1150°C의 온도에서 머플 용광로에서 소결하였다. 제작에 대한 자세한 설명은 Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639)에서 찾을 수 있다. 샘플은 세포 배양에 사용하기 전에 UV 조사(각 면당 15분)되었습니다.
Orthovita Vitoss 폼 (β -TCP / C 폼)Orthovita2102-1405
< 강> 마우스 골 세포 배양 < / 강>
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
ALP 분석 버퍼 (2x) pH 10.4초순수에 200 mM 글리신, 2 mM 염화 마그네슘, 2 mM 염화 아연을 용해하고 pH 10으로 조정하십시오.
뼈 성장 배지(BGM)&알파;-MEM + 10% 열 비활성화 FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신
세포 용해 완충액: CyQuant 세포 용해 완충액 20배 농축Thermo ScientificC7027농축 세포 용해 완충액을 초순수에 20배 희석합니다.
세포 생존도 시약: Presto Blue 세포 생존도 시약Invitrogen, Thermo Fisher ScientificA13261
클로스트리듐 히스톨리티쿰의 콜라겐분해효소 IV형Sigma-AldrichC5138
DC 단백질 분석 키트 IIBio Rad5000112DC 단백질 분석 키트에는 참조 표준물질에 대한 시약 A, 시약 B, 시약 S 및 BSA가 포함되어 있습니다. 시약 A'의 경우 20 µ를 추가하십시오. L 시약 S에서 1000 &마이크로; L 시약 A. 
디메틸설폭사이드(DMSO)Sigma-AldrichD8418멸균 필터 DMSO 사용 전. 
Dispase II (중성 프로테아제, 등급 II)Roche4942078001
EnzCheck 인산가수분해효소 분석 키트, 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 위한 키트 Invitrogen, Thermo Fisher ScientificE12020EnzCheck 포스파타제 분석 키트에는 6,8-디플루오로-4-메틸룸벨리페릴포스페이트(DiFMUP), N,N-디메틸포름아미드 및 6,8-디플루오로-7-하이드록시-4-메틸쿠마린(DiFMU)이 포함되어 있습니다.
소 태아 혈청 (FBS)시그마 - 알드리치F7524
포르말린 용액 중성 완충 10 %시그마 - 알드리치HT501128
글리신시그마 - 알드리치G8898
헥사 데실 피르 디늄 (세틸 피리디늄) 염화물 일 수화물시그마 - 알드리치C9002
L- 아스코르브 산 2- 인산 세스키 마그네슘 염 수화물Sigma-AldrichA8960
염화마그네슘 육수화물Sigma-AldrichM2670
MEM 알파 매체(α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
골형성 광물화 매체 (MM)&알파;-MEM + 10% 열 비활성화 FBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신 + 50 &마이크로; g/mL 아스코르브산 + 5 mM β-글리세로포스페이
페니실린-스트렙토마이신   Sigma-AldrichP4333
인산염 완충 식염수 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Sigmafast BCIP/NBTSigma-AldrichB5655
Trypsin-EDTA (0.5%), 페놀 레드 없음 (10x)Gibco, Thermo Fisher Scientific 15400054농축 원액을 1x PBS에 10배 희석합니다.
Tween20Sigma-AldrichP1379
초순수: 세포 배양수 발열원 무료VWRL0970-500
세척 버퍼추가  0.05% Tween20 to 1x PBS.
염화아연Sigma-Aldrich1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-AldrichG5422
24-well suspension culture plateGreiner bio-one662102
24-well tissue culture plateGreiner bio-one662160
50 mL conical tubeGreiner bio-one227261
96웰 블랙 플레이트Greiner bio-one655076
96웰 투명 플레이트Greiner bio-one655001
원심분리기: VWR Mega Star 600RVWR
CO2 인큐베이터: HeraCell 240Thermo Scientific
Cryovial 2 mLGreiner bio-one122263
일회용 필터 유닛 FP30/0.2 CA-SGE Healthcare Life Sciences Whatman10462200효소 용액의 멸균 여과용.
평판 스캐너: Epson Perfection 1200 PhotoEpson
Infinite M200 Pro 마이크로플레이트 리더Tecan
마이크로원심분리기 튜브: Eppendorf 튜브 safe-lock 0.5 mLVWR20901-505
마이크로원심분리기 튜브: Eppendorf 튜브 safe-lock 1.5 mLVWR21008-959
Shaker Swip (궤도 및 수평) 에드먼드 뷸러 
쉐이킹 인큐베이터 GFL3032GFL 3032
일회용 피펫: 혈청 피펫Greiner bio-one612301
멸균 기구(가위, 핀셋, 곡선 집게)
조직 배양 플레이트(10cm)Greiner bio-one664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25- 디하이드록시비타민 D3시그마-알드리치179361000x 농축 주식 (10 &마이크로; M in ethanol 100%)
아세톤VWR Chemicals22065.327
뼈 성장 매체(BGM)&알파;-MEM + 10% 열 비활성화 FBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신
증류수Carl Roth3478.4
에탄올(100% vol/vol)VWR Chemicals20821.365
에탄올(70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
패스트 레드 바이올렛 LB 염Sigma-AldrichF3381
소 태아 혈청 (FBS)Sigma-AldrichF7524
포르말린 용액 중성 완충 10%Sigma-AldrichHT501128
MEM 알파 배지(α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
N, N- 디메틸 포름 아미드시그마 - 알드리치D4551
나프톨 AS-MX 인산시그마 - 알드리치N4875
골 세포 분화 매체 (DM)&알파; -MEM + 10 % 열 비활성화 FBS + 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 + 1 nM 1,25- (OH) 2- 비타민 D3 + 1 &마이크로; M 프로스타글란딘 E2 
페니실린-스트렙토마이신 Sigma-AldrichP4333
인산염 완충 식염수 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
프로스타글란딘 E2 (PGE2)Cayman Chemical Company90030161000x 농축 주식 (에탄올 100 % 중 1 mM)
아세트산 나트륨 삼수화물Sigma-AldrichS7670
주석산 나트륨 이염기 이수화물Sigma-AldrichS8640
멸균 기기 (가위, 집게, 메스)
TRAP 완충기 pH 5.0초순수에 40mM 아세트산나트륨, 10mM 주석산나트륨을 용해시키고 pH 5로 조정합니다.
초순수: 세포 배양수 발열원 무함유VWRL0970-500
24웰 현탁 배양 플레이트Greiner bio-one662102
24웰 조직 배양 플레이트Greiner bio-one662160
50mL 원추형 튜브Greiner bio-one227261
원심분리기: VWR Mega Star 600RVWR
CO2-인큐베이터: HeraCell 240Thermo Scientific
다이아몬드 웨이퍼 블레이드(10.2 cm x 0.3 cm)Buehler
Isomet 저속 톱Buehler
Petri 접시(6 cm)Greiner bio-one628,161
스크류 캡 유리병 20 mLCarl RothEXY4.1
일회용 멸균 주사기 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
일회용 피펫: 혈청 피펫Greiner bio-one612301
멸균 바늘: 피하 주사 바늘 RW 27 G x 3/4''Henry Schein Animal Health9003340
Mouse calvarial defect model
진통제: 부프레노르핀 (Bupaq)Richter Pharma AG
마취 : 케타민 (Ketamidor), 자일라진 (Rompun)Richter Pharma AG / Bayer HealthCare
냉 살균제 : SafeSept MaxHenry Schein 동물 건강9882765
에탄올 (70 % vol / vol)VWR Chemicals93003.1006
눈 연고 : VitA POS 5gUrsapharm
생리 식염수 (0.9 % 염화나트륨 용액)Fresenius Kabi
인산염 완충 식염수 1x(PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Povidone 요오드 용액: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4.5% 완충 포르말린Carl Roth2213.6
조직 접착제: Histoacryl 5 x 0.5 mL B. Braun Surgical1050060
개인 보호 장비: 수술용 장갑, 모자 및 마스크, 가운Henry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
멸균 기구 (메스, 가위, 펜치, 바늘 홀더)
멸균 바늘: 피하 주사 바늘 RW 27 G x 3/4'' 및 30 G x 1/2'' Henry Schein 동물 건강9003340, 9003630
일회용 멸균 주사기 1mLHenry Schein 동물 건강9003016
가열판: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
멸균 거즈 면봉Henry Schein 동물 건강220192
멸균 일회용 메스(그림 20)Henry Schein 동물 건강9008957
외과/치과 드릴: 임플란트 SI-923W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH16929000
핸드피스 유형 S-IIW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH30056000
트레핀, 직경 4mmHager& Meisinger GmbH229040
관개 튜빙 세트 2.2mW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH4363600
페리오스틸 엘리베이터 2 mm / 3 mmHenry Schein 동물 건강472683
비흡수성 봉합사: 폴리에스터 그린, DS19, 충족. 1.5, USP 4/0 75 cmHenry Schein 동물 건강300715
시험관내 면역 반응
를 위한 마취: 케타민(케타미도르), 자일라진(Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
세포 증식 ELISA, BrdU(비색) 분석 키트Sigma-Aldrich11647229001키트에는 BrdU 라벨링 용액, 고정 용액(FixDenat), 항-BrdU 항체 용액, 세척 완충액 및 기질 용액이 포함되어 있습니다.
Concanavalin A (ConA)MP Biomedicals150710
배양 매체 플레녹세포RPMI 매체 + 10% 열 비활성화 FBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액 + 0.1% 겐타마이신 + 0.2% ß-메르캅토에탄올 + 1% 비필수 아미노산
에탄올 (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
태아 소 혈청 (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific& 주의;
GentamicinGibco, 써모 피셔 사이언티픽 
마우스 IL-1β ELISA 레디-셋-고!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
마우스 IL-2 ELISA MAX 표준BioLegend431001
마우스 IL-4 ELISA MAX 표준BioLegend431101
마우스 INF-γ ELISA MAX StandardBioLegend430801
비필수 아미노산 솔루션Gibco, Thermo Fisher Scientific 
11140050 페니실린-스트렙토마이신 Gibco, 써모 피셔 사이언티픽 
인산염 완충 식염수 1x(PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
적혈구(RBC) 용해 완충액: BD Pharm LyseBD Bioscience555899
RPMI 1640 medium, HEPESGibco, Thermo Fisher Scientific 52400025
β-MercaptoethanolGibco, Thermo Fisher Scientific 
50 mL 원뿔형 튜브Greiner bio-one227261
96-well 조직 배양 플레이트Greiner bio-one655180
원심분리기: VWR Mega Star 600RVWR
Cell strainer 40 µ mBD Bioscience352340
Infinite M200 Pro 마이크로플레이트 리더Tecan
일회용 멸균 주사기 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
멸균 수술 기구(집게, 유리 슬라이드)
<강력한>고처리량 복강내 모델
마취: 케타민(케타미도르), 자일라진(롬푼)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
냉막제: SafeSept MaxHenry Schein 동물 건강9882765
에탄올(70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
눈 연고: VitA POS 5gUrsapharm
마우스 IL-1β ELISA 레디-셋-고!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
마우스 IL-2 ELISA MAX 표준BioLegend431001
마우스 IL-4 ELISA MAX 표준BioLegend431101
인산염 완충 식염수 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
포비돈 요오드 용액: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff 염색 키트Thermo Scientific9990700차등 세포 수용.
가열판: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
혈구계: Neubauer 챔버Carl RothPC72.1
비흡수성 봉합사: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
흡수성 봉합사: PolysorbCovidienSL-5628
Shandon centrifuge for cytopsinThermo Scientific
일회용 멸균 주사기 1mLHenry Schein Animal Health9003016
멸균 거즈 면봉Henry Schein Animal Health220192
멸균 바늘: 피하 주사 바늘 RW 27 G x 3/4'' 및 25 GHenry Schein Animal Health9003340, 420939
멸균 수술 기구(메스, 가위, 집게, 바늘 홀더)
Trypan 블루 솔루션 0.4%Gibco, Thermo Fisher Scientific 15250061
Subchronic 피하 모델
마취: 케타민(Ketamidor), 자일라진(Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
냉균제: SafeSept MaxHenry Schein 동물 건강9882765
에탄올(70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
눈 연고: VitA POS 5 gUrsapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
포비돈 요오드 용액: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4.5% 완충 포르말린Carl Roth2213.6
가열판: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
비흡수성 봉합사: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
개인 보호 장비: 외과적 장갑, 모자 및 마스크, 가운Henry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
일회용 멸균 주사기 1mLHenry Schein Animal Health9003016
멸균 거즈 면봉Henry Schein Animal Health220192
멸균 기구(메스, 가위, 집게, 바늘 홀더)
멸균 바늘: 피하 주사 바늘 RW 27 G x 3/4'' Henry Schein 동물 건강9003340, 420939
액 트 10010023염 1001002310010023안락사10500064157500371514012210010023313500101001002310010023

참고문헌

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