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방법 논문

뼈 재생을 위해 생체에서 생물학적 호환성 프로필

12.6K 조회수

DOI:

10.3791/58077

2018년 11월 16일

이 논문에서

요약

큰 뼈 장애 복구에 대 한 설계 새로운 생체 재료의 수는 지속적으로 뼈 이식 수술과 관련 된 합병증을 극복 하 고 뼈 치유 향상을 목표로 확장 됩니다. 여기, 우리는 뼈 수리에 대 한 생체의 전 임상 생체 적합성 테스트를 위한 종합 전략을 제시.

초록

큰 비-연합 뼈 골절은 정형 외과 수술에 중요 한 도전입니다. 자동-및 수용자 뼈 이식 같은 병 변 치유를 위한 훌륭한 있지만, 그들의 사용을 가진 잠재적인 합병증이 있다. 따라서, 물자 과학자는 이러한 문제를 극복 하기 위해 합성, 생체 바이오 소재 개발 하 고 있다. 이 연구에서 우리는 뼈 수리에 대 한 생체 재료를 평가 하기 위한 종합 플랫폼 제시. 우리는 뼈 생물학 및 면역학 생체 외에서 osteoclast (OC)와 osteoblast (OB) 분석 실험 및 뼈 수리, immunogenicity, 및 allergenicity의 마우스 모델 vivo에서 포함 하는 플랫폼을 개발 하는 전문성을 결합. 실험을 수행, 결과 요약 및 생체 적합성 소재에 보고 하는 방법을 보여 줍니다. 특히, 테스트 산부인과 생존, 차별화, 그리고 강화 작용 및 OC 생존 및 차별화 β tricalcium 인산 (β-TCP) 디스크의 맥락에서. 우리는 또한 뼈 치료의 초기 단계에 대 한 효과 결정 하기 위해 뼈 수리 calvarial 뼈 크기의 중요 한 결함 마우스 모델에 대 한 임상 사용 상용 물자 인 β-TCP/콜라겐 (β-TCP/C) 거품을 테스트. 병렬 실험에서 우리는 쥐의 면역 및 알레르기 반응을 평가. 우리의 접근 방식은 다양 한 매개 변수 뼈 치유 및 복구 환자에 사용 하는 생체 재료의 생체 적합성 예측에 필요한 뼈 소재의 생물학 호환성 프로 파일을 생성 합니다.

서론

뼈 수리 혈 종 형성, 염증으로 시작 하는 복잡 한 과정, callus 형성 및1,2를 개장 하는 다음. 그러나, 뼈 재생 잠재적인 뼈 골절1,3의 크기로 제한 됩니다. 예를 들어, 큰 뼈 골절 외상, 암이 나 골다공증으로 인 한 치유 되지 않을 수 있습니다 그리고 비 연합 뼈 골절을 불린다. 이러한 뼈 병 변은 종종 건강 한 생리 뼈 수리 및 재생을 촉진 하는 치료를 필요로 합니다. 현재, autograft와 이식 뼈 이식 선택4 2.2 백만 뼈 대체 절차의 접근은 매년5. 비록 이러한 절차 높은 성공률을가지고, 합병증, 예를 들어 제한 된 가용성 뼈, 감염, 기증자 사이트 사망률, 그리고 거부4의 있을 수 있습니다. 뼈 조직 공학에 대 한 새로운 대안 이러한 과제를 해결 하기 위해 모색 되 고 있다.

천연 또는 합성 고분자, bioceramics 또는 세포 및 생리 활성 분자와 함께 금속 기반 생체 재료의....

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프로토콜

절차는 BALB/c 마우스 관심과 오스트리아 정부 교육, 과학 및 연구의 실험 동물의 사용에 대 한 모든 지침을 끝내 고 오스트리아 교육부, 과학의 윤리학에 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 연구입니다.

1. 기본 마우스 산부인과 문화

  1. 산부인과에서 신생아 마우스 calvaria 소화 효소를 사용 하 여 격리
    1. 1-2 일 된 신생아 강아지 (총에서 60) 잘린 여 euthanize 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 살 균 1 페 트리 접시에 머리를 배치.
    2. 머리, 목의 목 덜 미를 잡고 하 고 떨어져 살 균가 위를 사용 하 여 피부를 잘라. 그것은 피어 싱으로 calvarium incise (약 0.1-0.3 m m) 그 다음은 두개골의 기지에서 머리 뒤쪽 calvarium 아래 삽입 되 고 귀 그리고 어 보 브의 위 앞 옆에서 다시 calvarial 가장자리를 잘라가 위를 전자 코 다리 (그림 1).
    3. 살 균 필터 소화 솔루션의 8 mL와 해 부 calvaria 품 어 (α-최소 필수 매체 (α-MEM) 300 단위/mL 콜라 유형 IV와 2.14 단위/mL dispase II 해산) 200 쉐이크에 떨고....

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결과

Β-TCP 뼈 수리에 대 한 소재로 그것의 효과 대 한 평가, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 심사 방법 사용. 첫째, 우리는 초기 중간 혼자 컨트롤에 비해 β-TCP 디스크에 산부인과 응답 측정. 그림 2 문화의 7 및 14 일 OB 생존 β-TCP 디스크에 대 한 응답에서을 보여 줍니다. Β-TCP 디스크는이 소재는 강화도 산부인과 확산 억제를 나타내는 뿐만 아니라 조직 문화 플라스틱에서 매체와 문화 스에서 metabolically 활성 셀에서 측정 하는 세포 생존 능력 OBs에 대 한 동일 했다.

더 평가 OBs, 질적 및 양적 방법을 사용 하 여 차별화의 감 적으로 알프 활동을 측정 했습니다. 그림 2 는 문화의.......

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토론

여기, 우리가 대표적인 바이오 뼈 재생 및 복구에 대 한 개발에 대 한 생체 적합성의 전 임상 평가 대 한 다양 한 접근 방식을 보여줍니다. 우리 OBs, OCs의 응답을 테스트 하 고 중요 한 뼈의 결함의 에 비보 치유 응답 모델 쥐 뿐만 아니라 에 체 외 그리고 vivo에서 면역 반응. 우리는 분석 작업과 데이터와는 생체 재료의 시험에서 파생 된 결론을 요약 설명 목적입니다. 우리는 우리의 전략 뼈 소재 생체 적합성의 귀중 한 프로필 생성을 보여줍니다.

1 차 셀 분석 OB와 OC 기능을 평가 하기 위해 사용 되었다. OBs는 뼈 형성과 생리 수리 하는 일을 담당 합니다. 그들은 가능한 유지, 차별화, 고 강화를 유도 해야 합니다. 이 연구에서 우리는 형성할 수 있는 능력으로 순수 차별화 된 세포의 표식으로 세포 생존 능력, ALP, 및 ARS에 대 한 분석을 수행 하는 방법을 보여줍니다. 분석에 대 한 컨트롤 포함 매체, 기준.......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 연구 프로젝트 부여 계약 번호 263363 아래 유럽 연합의 일곱 번째 기구 프로그램 (FP7 2007-2013 년)에서 자금을 받고 있다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm)디스크를 1150°C의 온도에서 머플 용광로에서 소결하였다. 제작에 대한 자세한 설명은 Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639)에서 찾을 수 있다. 샘플은 세포 배양에 사용하기 전에 UV 조사(각 면당 15분)되었습니다.
Orthovita Vitoss 폼 (β -TCP / C 폼)Orthovita2102-1405
< 강> 마우스 골 세포 배양 < / 강>
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
ALP 분석 버퍼 (2x) pH 10.4초순수에 200 mM 글리신, 2 mM 염화 마그네슘, 2 mM 염화 아연을 용해하고 pH 10으로 조정하십시오.
뼈 성장 배지(BGM)&알파;-MEM + 10% 열 비활성화 FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신
세포 용해 완충액: CyQuant 세포 용해 완충액 20배 농축Thermo ScientificC7027농축 세포 용해 완충액을 초순수에 20배 희석합니다.
세포 생존도 시약: Presto Blue 세포 생존도 시약Invitrogen, Thermo Fisher ScientificA13261
클로스트리듐 히스톨리티쿰의 콜라겐분해효소 IV형Sigma-AldrichC5138
DC 단백질 분석 키트 IIBio Rad5000112DC 단백질 분석 키트에는 참조 표준물질에 대한 시약 A, 시약 B, 시약 S 및 BSA가 포함되어 있습니다. 시약 A'의 경우 20 µ를 추가하십시오. L 시약 S에서 1000 &마이크로; L 시약 A. 
디메틸설폭사이드(DMSO)Sigma-AldrichD8418멸균 필터 DMSO 사용 전. 
Dispase II (중성 프로테아제, 등급 II)Roche4942078001
EnzCheck 인산가수분해효소 분석 키트, 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 위한 키트 Invitrogen, Thermo Fisher ScientificE12020EnzCheck 포스파타제 분석 키트에는 6,8-디플루오로-4-메틸룸벨리페릴포스페이트(DiFMUP), N,N-디메틸포름아미드 및 6,8-디플루오로-7-하이드록시-4-메틸쿠마린(DiFMU)이 포함되어 있습니다.
소 태아 혈청 (FBS)시그마 - 알드리치F7524
포르말린 용액 중성 완충 10 %시그마 - 알드리치HT501128
글리신시그마 - 알드리치G8898
헥사 데실 피르 디늄 (세틸 피리디늄) 염화물 일 수화물시그마 - 알드리치C9002
L- 아스코르브 산 2- 인산 세스키 마그네슘 염 수화물Sigma-AldrichA8960
염화마그네슘 육수화물Sigma-AldrichM2670
MEM 알파 매체(α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
골형성 광물화 매체 (MM)&알파;-MEM + 10% 열 비활성화 FBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신 + 50 &마이크로; g/mL 아스코르브산 + 5 mM β-글리세로포스페이
페니실린-스트렙토마이신   Sigma-AldrichP4333
인산염 완충 식염수 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Sigmafast BCIP/NBTSigma-AldrichB5655
Trypsin-EDTA (0.5%), 페놀 레드 없음 (10x)Gibco, Thermo Fisher Scientific 15400054농축 원액을 1x PBS에 10배 희석합니다.
Tween20Sigma-AldrichP1379
초순수: 세포 배양수 발열원 무료VWRL0970-500
세척 버퍼추가  0.05% Tween20 to 1x PBS.
염화아연Sigma-Aldrich1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-AldrichG5422
24-well suspension culture plateGreiner bio-one662102
24-well tissue culture plateGreiner bio-one662160
50 mL conical tubeGreiner bio-one227261
96웰 블랙 플레이트Greiner bio-one655076
96웰 투명 플레이트Greiner bio-one655001
원심분리기: VWR Mega Star 600RVWR
CO2 인큐베이터: HeraCell 240Thermo Scientific
Cryovial 2 mLGreiner bio-one122263
일회용 필터 유닛 FP30/0.2 CA-SGE Healthcare Life Sciences Whatman10462200효소 용액의 멸균 여과용.
평판 스캐너: Epson Perfection 1200 PhotoEpson
Infinite M200 Pro 마이크로플레이트 리더Tecan
마이크로원심분리기 튜브: Eppendorf 튜브 safe-lock 0.5 mLVWR20901-505
마이크로원심분리기 튜브: Eppendorf 튜브 safe-lock 1.5 mLVWR21008-959
Shaker Swip (궤도 및 수평) 에드먼드 뷸러 
쉐이킹 인큐베이터 GFL3032GFL 3032
일회용 피펫: 혈청 피펫Greiner bio-one612301
멸균 기구(가위, 핀셋, 곡선 집게)
조직 배양 플레이트(10cm)Greiner bio-one664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25- 디하이드록시비타민 D3시그마-알드리치179361000x 농축 주식 (10 &마이크로; M in ethanol 100%)
아세톤VWR Chemicals22065.327
뼈 성장 매체(BGM)&알파;-MEM + 10% 열 비활성화 FBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신
증류수Carl Roth3478.4
에탄올(100% vol/vol)VWR Chemicals20821.365
에탄올(70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
패스트 레드 바이올렛 LB 염Sigma-AldrichF3381
소 태아 혈청 (FBS)Sigma-AldrichF7524
포르말린 용액 중성 완충 10%Sigma-AldrichHT501128
MEM 알파 배지(α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
N, N- 디메틸 포름 아미드시그마 - 알드리치D4551
나프톨 AS-MX 인산시그마 - 알드리치N4875
골 세포 분화 매체 (DM)&알파; -MEM + 10 % 열 비활성화 FBS + 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 + 1 nM 1,25- (OH) 2- 비타민 D3 + 1 &마이크로; M 프로스타글란딘 E2 
페니실린-스트렙토마이신 Sigma-AldrichP4333
인산염 완충 식염수 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
프로스타글란딘 E2 (PGE2)Cayman Chemical Company90030161000x 농축 주식 (에탄올 100 % 중 1 mM)
아세트산 나트륨 삼수화물Sigma-AldrichS7670
주석산 나트륨 이염기 이수화물Sigma-AldrichS8640
멸균 기기 (가위, 집게, 메스)
TRAP 완충기 pH 5.0초순수에 40mM 아세트산나트륨, 10mM 주석산나트륨을 용해시키고 pH 5로 조정합니다.
초순수: 세포 배양수 발열원 무함유VWRL0970-500
24웰 현탁 배양 플레이트Greiner bio-one662102
24웰 조직 배양 플레이트Greiner bio-one662160
50mL 원추형 튜브Greiner bio-one227261
원심분리기: VWR Mega Star 600RVWR
CO2-인큐베이터: HeraCell 240Thermo Scientific
다이아몬드 웨이퍼 블레이드(10.2 cm x 0.3 cm)Buehler
Isomet 저속 톱Buehler
Petri 접시(6 cm)Greiner bio-one628,161
스크류 캡 유리병 20 mLCarl RothEXY4.1
일회용 멸균 주사기 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
일회용 피펫: 혈청 피펫Greiner bio-one612301
멸균 바늘: 피하 주사 바늘 RW 27 G x 3/4''Henry Schein Animal Health9003340
Mouse calvarial defect model
진통제: 부프레노르핀 (Bupaq)Richter Pharma AG
마취 : 케타민 (Ketamidor), 자일라진 (Rompun)Richter Pharma AG / Bayer HealthCare
냉 살균제 : SafeSept MaxHenry Schein 동물 건강9882765
에탄올 (70 % vol / vol)VWR Chemicals93003.1006
눈 연고 : VitA POS 5gUrsapharm
생리 식염수 (0.9 % 염화나트륨 용액)Fresenius Kabi
인산염 완충 식염수 1x(PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Povidone 요오드 용액: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4.5% 완충 포르말린Carl Roth2213.6
조직 접착제: Histoacryl 5 x 0.5 mL B. Braun Surgical1050060
개인 보호 장비: 수술용 장갑, 모자 및 마스크, 가운Henry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
멸균 기구 (메스, 가위, 펜치, 바늘 홀더)
멸균 바늘: 피하 주사 바늘 RW 27 G x 3/4'' 및 30 G x 1/2'' Henry Schein 동물 건강9003340, 9003630
일회용 멸균 주사기 1mLHenry Schein 동물 건강9003016
가열판: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
멸균 거즈 면봉Henry Schein 동물 건강220192
멸균 일회용 메스(그림 20)Henry Schein 동물 건강9008957
외과/치과 드릴: 임플란트 SI-923W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH16929000
핸드피스 유형 S-IIW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH30056000
트레핀, 직경 4mmHager& Meisinger GmbH229040
관개 튜빙 세트 2.2mW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH4363600
페리오스틸 엘리베이터 2 mm / 3 mmHenry Schein 동물 건강472683
비흡수성 봉합사: 폴리에스터 그린, DS19, 충족. 1.5, USP 4/0 75 cmHenry Schein 동물 건강300715
시험관내 면역 반응
를 위한 마취: 케타민(케타미도르), 자일라진(Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
세포 증식 ELISA, BrdU(비색) 분석 키트Sigma-Aldrich11647229001키트에는 BrdU 라벨링 용액, 고정 용액(FixDenat), 항-BrdU 항체 용액, 세척 완충액 및 기질 용액이 포함되어 있습니다.
Concanavalin A (ConA)MP Biomedicals150710
배양 매체 플레녹세포RPMI 매체 + 10% 열 비활성화 FBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액 + 0.1% 겐타마이신 + 0.2% ß-메르캅토에탄올 + 1% 비필수 아미노산
에탄올 (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
태아 소 혈청 (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific& 주의;
GentamicinGibco, 써모 피셔 사이언티픽 
마우스 IL-1β ELISA 레디-셋-고!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
마우스 IL-2 ELISA MAX 표준BioLegend431001
마우스 IL-4 ELISA MAX 표준BioLegend431101
마우스 INF-γ ELISA MAX StandardBioLegend430801
비필수 아미노산 솔루션Gibco, Thermo Fisher Scientific 
11140050 페니실린-스트렙토마이신 Gibco, 써모 피셔 사이언티픽 
인산염 완충 식염수 1x(PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
적혈구(RBC) 용해 완충액: BD Pharm LyseBD Bioscience555899
RPMI 1640 medium, HEPESGibco, Thermo Fisher Scientific 52400025
β-MercaptoethanolGibco, Thermo Fisher Scientific 
50 mL 원뿔형 튜브Greiner bio-one227261
96-well 조직 배양 플레이트Greiner bio-one655180
원심분리기: VWR Mega Star 600RVWR
Cell strainer 40 µ mBD Bioscience352340
Infinite M200 Pro 마이크로플레이트 리더Tecan
일회용 멸균 주사기 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
멸균 수술 기구(집게, 유리 슬라이드)
<강력한>고처리량 복강내 모델
마취: 케타민(케타미도르), 자일라진(롬푼)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
냉막제: SafeSept MaxHenry Schein 동물 건강9882765
에탄올(70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
눈 연고: VitA POS 5gUrsapharm
마우스 IL-1β ELISA 레디-셋-고!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
마우스 IL-2 ELISA MAX 표준BioLegend431001
마우스 IL-4 ELISA MAX 표준BioLegend431101
인산염 완충 식염수 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
포비돈 요오드 용액: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff 염색 키트Thermo Scientific9990700차등 세포 수용.
가열판: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
혈구계: Neubauer 챔버Carl RothPC72.1
비흡수성 봉합사: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
흡수성 봉합사: PolysorbCovidienSL-5628
Shandon centrifuge for cytopsinThermo Scientific
일회용 멸균 주사기 1mLHenry Schein Animal Health9003016
멸균 거즈 면봉Henry Schein Animal Health220192
멸균 바늘: 피하 주사 바늘 RW 27 G x 3/4'' 및 25 GHenry Schein Animal Health9003340, 420939
멸균 수술 기구(메스, 가위, 집게, 바늘 홀더)
Trypan 블루 솔루션 0.4%Gibco, Thermo Fisher Scientific 15250061
Subchronic 피하 모델
마취: 케타민(Ketamidor), 자일라진(Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
냉균제: SafeSept MaxHenry Schein 동물 건강9882765
에탄올(70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
눈 연고: VitA POS 5 gUrsapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
포비돈 요오드 용액: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4.5% 완충 포르말린Carl Roth2213.6
가열판: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
비흡수성 봉합사: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
개인 보호 장비: 외과적 장갑, 모자 및 마스크, 가운Henry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
일회용 멸균 주사기 1mLHenry Schein Animal Health9003016
멸균 거즈 면봉Henry Schein Animal Health220192
멸균 기구(메스, 가위, 집게, 바늘 홀더)
멸균 바늘: 피하 주사 바늘 RW 27 G x 3/4'' Henry Schein 동물 건강9003340, 420939
액 트 10010023염 1001002310010023안락사10500064157500371514012210010023313500101001002310010023

참고문헌

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al.

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재인쇄 및 허가

태그

Alizarin Red S