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방법 논문

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

8.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58079

⸱

2018년 8월 29일

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Advanced Clinical Biosystems Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Institute of Analytical Chemistry of the Czech Academy of Sciences

이 논문에서

요약

여기 선물이 polysome 끼얹는다 절연된 마우스 마음에 프로 파일링을 수행 하는 프로토콜. 우리 심장 관류, 프로 파일링, polysome polysome 분수 mRNAs, miRNAs, 및 polysome 프로테옴의 분석에 대 한 방법을 설명 합니다.

초록

단백질 번역에 동적 변화에 연구 전문된 방법 필요합니다. 여기 우리는 국 소 빈 혈과 reperfusion polysome 프로 파일링과 함께 끼얹는다 절연된 마우스 마음을 사용 하 여 응답에서 새로 합성 된 단백질에 변화를 검사 합니다. 단백질 번역의 동적 변화를 더 이해 하기 우리 mRNAs cytosolic 리보솜 (polyribosomes 또는 polysomes)와 함께 로드 된 또한 미토 콘 드리 아 polysomes 복구 하 고 비교에서 mRNA와 단백질 분포 특징에 높은-효율성 분수 (수많은 리보솜 mRNA에 부착), 낮은-효율성 (적은 리보솜 부착) 또한 미토 콘 드리 아 polysomes, 그리고 번역 비 분수를 포함 하는. miRNAs는 번역 되 고, 번역의 효율성을 줄일 mRNAs와 연결할 수도, 우리는 분수에 걸쳐 miRNAs의 분포를 조사. MRNAs, miRNAs, 및 단백질의 분포는 글로벌 아니 흐름 허 혈과 reperfusion의 30 분 후 30 분 후에 기저 끼얹는다 조건 하에서 시험 되었다. 여기에 우리가이 분석을 수행 하는 데 사용 하는 방법을 제시-특히,이 자당 기온 변화도에서 단백질 추출의 최적화에 대 한 접근은 하지 설명 하기 전에-몇 가지 대표적인 결과 제공.

서론

마음은 (I) 허 혈과 reperfusion 동적 방식에서 (R)의 부상에 응답합니다. 그러나, 응답 하는 동안 단백질 합성의 급성 변화에 약간의 통찰력이 있다. 이 해결 하기 위해 우리가 했다 polysome1 단백질 풍부 리보솜 및 polysomes, cytosol에서 변환 규제 요인의 재분배를 반영 하는 변화를 식별 하기 위해 프로 파일링의 기초가 튼튼한 방법의 장점 및 새로 합성된 단백질 (NSPs)에 증가. 나의 설정에서 / R, 새로운 mRNAs2;의 전사와 일치 하지 않는 시간에 발생 하는 새로운 단백질 합성의 증가 또한, mRNA 식 수준 및 단백질 풍부 사이 부조화 보고3되었습니다. 이러한 이유로, 우리는 동적 프로테옴에서 변경 내용을 분석 하는 단백질 번역에 의해 반영 하기로 결정 했다. 이렇게 하려면, 우리는 polysome 분수에서 mRNA를 계량 하 고 polysome 분수의 단백질 구성을 분석. 마지막으로, microRNAs (미르) 번역에 대 한 mRNAs의 조절 및 단백질 번역4,5의 효율을 방해할 수 있습니다, 때문에 우리 검사 polysome 분수에 미르의 배포에 초점을 맞추고는 내가 응답 / R.

우리는 지속적인 관류, 그리고 국 소 빈 혈 reperfusion의 30 분 뒤의 30 분 30 분 글로벌 아니 흐름 허 혈 후의 기저 상태에서 수확 조직과 격리 마우스 Langendorff 관류 모델을 사용 하기로 결정 했습니다. 우리 심장 조직의 solubilized 그리고 자당 기온 변화도 통해 polysomes를 분리 proteomic 분석 및 선택적 검출 mRNAs와 PCR 및 microarray, miRNAs의 각각 다음. 방법의이 조합은 mRNA, 미르, NSPs의 동시 검출 뿐만 아니라 nontranslating 분수 사이 규제 단백질, 미르, 그리고 mRNA의 재배포 가능 동적 프로테옴을 이해 하는 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 낮은 효율 polysomes, 그리고 높은 효율 polysomes ( 그림 1참조). 이 프로세스의 동적 규칙에 eIF2α 또는 mTOR 등 규제 요인의 인 산화의 더 분석 하 여 연장 됩니다. 이러한 개별 단계 이제 자세히 설명 합니다.

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프로토콜

모든 동물 연구 기관 지침에 따라 수행 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 삼목 시 나이 의료 센터에 의해 승인 했다.

1. Langendorff 마우스 심장의 관류

  1. 국 소 빈 혈과 reperfusion 마우스 마음의 Langendorff 관류
    1. 관리 복 pentobarbital 나트륨 70 mg/kg 성인 마우스 (8 주 오래 된, 남성, C57BL6/j). 핀치를 발 끝에 철수의 부족에 의해 깊은 마 취를 확인 합니다.
    2. 복 덤플링 500와 Anticoagulate U/kg.
    3. Sternal 절 개를 통해 가슴을 엽니다. 횡 경 막 열고 앞쪽 액 축에 늑 골 경계를 따라 잘라. 그런 다음 완전히 흉부 새 여 forelimb까지 앞쪽 액 축 잘라. 후, 마음을 시각화, 집게와 오름차순 대동맥을 클램프 하 고 마음을 빠르게 삭제할. 죽음은 exsanguination 때문 이다. 차가운 Krebs에서 마음을 배치 (NaCl 6.9 g/L, KCl 0.35 g/L, NaHCO3 2.1 g/L, KH2포4 0.16 g/L, MgSO4 0.141 g/L, 포도 당 2 g/L와 CaCl2 0.373 g/L).
    4. 블런트 팁 바늘으로 대동맥을 cannulate 하 고 perfuse retrogradely 일정 한 압력 모드로 Krebs 솔루션으로 마음.
    5. 안정화 기간 후 15 분, 30 분 뒤에 30 분 동안 reperfusion 글로벌 아니 흐름 허 혈을 심장 주제.
    6. 초기 관류 15 분, 30 분 허 혈, 또는 30 분 reperfusion 마음을 수확. 심 방에서 트리밍합니다 그리고 스냅-동결 조직 액체 질소.
    7. 사용까지-80 ° C에서 저장

2. 조직 균질, 가용 화, 그리고 자당 밀도 그라데이션 침전

  1. 그라데이션 준비
    1. 100ml 자당, NaCl 2.5 M; 4 mL를 혼합의 2 솔루션 (15%, 50%)를 준비
      0.8 mL MgCl2 1.25 M; 1 mL Tris HCl 1 M, pH 7.5; 15 g 또는 자당의 50 g (15%와 50%, 각각); 100 mL; 도달 초순 그리고 15% 솔루션을 자일 렌 cyanol (0.02 mg/mL)
    2. 각 솔루션 (0.22 μ m 필터) 필터
    3. 그라디언트 사용 될 것 이다 날 각 자당 솔루션의 40 mL를 준비 하 고 cycloheximide 100 µ g/mL의 최종 농도 달성 하기 위해 각 솔루션에 추가
      1. 그라데이션 메이커를 사용 하 여 15%와 50% 자당 해결책 사이 혼합을 준비
      2. 15% 자당 기온 변화도의 5 mL와 함께 왼쪽된 칸 채우기
      3. 오른쪽 구획 50% 자당 그라데이션으로 채우기
      4. 수도 꼭지를 열고 자력으로 두 개의 작은 구획을 저 어을 펌프에 전환
      5. 튜브를 사용 하 여 혼합된 자당 솔루션 얇은 벽 울트라 원심 분리 관에 흐름을 허용 하도록 두 번째 탭에 연결. 마지막 볼륨 약 10 mL를 있을 것입니다.
    4. 4 ° C에서 그래디언트를 유지 (필요한 경우, 하룻밤 하지만 되지 더 이상)
  2. 심 혼 직물의 균질 화
    1. 균질 (자당 그라데이션 분별에 대 한 수정)는 필터링 된 세포의 용 해 버퍼에서 polytron와 신선 또는 냉동 하트 100 m m KCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0.4% 포함 된 NP-40. Cycloheximide 100 µ g/mL polysome 구조, 0.1 U RNase 제와 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (1 태블릿 50 ml)을 유지 하기 위해 포함 됩니다.
    2. 품 어는 lysate에 15 분을 얼음.
    3. 불용 성 물질을 제거 하는 상쾌한 수집 4 ° C에서 15 분 18000 x g 에서 원심.
    4. 단백질 결정, RNA 격리 및 RNA 무결성 분석 ( 그림 2참조)에 대 한 50 µ L를 보유 합니다.
    5. 그래디언트 위에 상쾌한 (500-100 µ L) 레이어를 세포의 용 해 버퍼 튜브를 균형.
  3. 침전 및 분수의 컬렉션
    1. 37000 rpm 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 120 분 ultracentrifugation를 수행 합니다. 제조 업체에 따라이 최대 반경에서 228000 x g 에 해당합니다.
    2. 254에서 흡 광도의 지속적인 감시와 함께 microcentrifuge 튜브에서 17 분수 (분수 약 600 µ L)으로 각 그라디언트를 수집 nm (OD254).
    3. 다음과 같이 분수 수집기 프로그램:
      1. (그라데이션 하기 전에 튜브에 포함 된 액체에 해당) 하는 컬렉션의 첫 번째 3 분 삭제
      2. 19 분 4, 17 분수에 1 mL/min의 속도로 분수를 수집 합니다.
    4. 각 수집 되 자 마자 얼음에는 분수를 놓습니다. 그들은 즉시 처리 되지 않는 경우-80 ° C에서 샘플을 동결. 그라데이션의 전형적인 UV densitometric 추적 수집은 그림 1에 표시 됩니다.

3. 절연 및 Polysome Nontranslating 분수에서 mRNAs의 분석

  1. MRNA의 추출
    1. 만약 그들이 플래시-냉동 컬렉션 후 얼음에 분수를 녹여
    2. 신선한 튜브 각 분수의 200 µ L 전송
      참고:이 단계에서 두 개 이상의 연속 분수 수 수 풀링된 함께. 그것은 행해져야 한다 신중 하 게 polysome 및 비 polysome 분수 혼합 하지 않습니다 있도록 OD254 그래프를 분석 후.
    3. 10 추가 luciferase 정규화 목적을 위해 각 샘플에 내부 제어로 RNA의 ng.
      참고: Luciferase 뇌관 해야 사용 내부 통제로 결과 정상화.
    4. 각 튜브를 RNA 추출 시 약 (페 놀 및 guanidine isothiocyanate monophasic 솔루션; 참조 테이블의 재료)의 700 µ L를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 RT (실내 온도)에서 5 분 동안 튜브를 품 어.
    5. 실시간에 2-3 분 15 미 품에 대 한 140 µ L 클로 프롬 및 소용돌이 추가
    6. 4 ° c.에 12000 x g 에서 15 분에 대 한 샘플을 원심
    7. 신중 하 게 새로운 튜브 위 수성 단계 전송.
    8. 분수의 RNA 콘텐츠 높은 이므로, 각 튜브를 캐리어로 glycogen의 10 µ g을 추가 합니다.
    9. 각 튜브를 350 µ L 소 프로 파 놀을 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 수익률을 높이기 위해 1 시간-20 ° C에서 품 어.
    10. 4 ° c.에 12000 x g 에서 15 분 동안 원심 분리기
    11. 삭제는 상쾌한 고 추가 700 µ L 에탄올 75 %RNA 펠 릿을 세척 합니다.
    12. 4 ° c.에 7500 x g 에 5 분 동안 원심 분리기
    13. 에탄올을 제거 하 고 펠 릿 어 10-15 분 동안 건조 하자.
      참고:-RNA 펠 릿 건조 물에 그것의 완전 한 가용 화가 되지 것입니다.
    14. RNase 무료 초순 H2o.의 50 μ에 RNA 펠 릿 resuspend
    15. 55 ° c.에서 10 분에 대 한 샘플을 품 어
    16. 각 샘플의 2 μ를 사용 하 여 추출 된 RNA의 양과 품질을 측정 하 여-80 ° c.에 나머지를 저장
  2. 반전 녹음 방송 및 정량
    1. 반전 녹음 방송 cDNA 합성의 4 μ를 사용 하 여 20 μ 반응 ( 재료의 표참조)을 키트. 샘플의 수에 따라 supermix을 준비 합니다. 각 관에 필요한 볼륨을 전송 하 고 각 관에 입력 RNA의 5 μ를 추가 합니다. 이 볼륨은 Taq 중 합 효소 근무 조건 범위에 대 한 관련성이 수정 될 수 있습니다.
    2. 제조업체에서 권장 하는 다음 프로그램으로 열 cycler에 튜브를 품 어: 25 ° C에서 5 분, 20 분 반전 녹음 방송에서 46 ° C, 20 분 동안 95 ° c.에 1 분 동안 역전사 비활성화
    3. 정량 Pcr 뇌관의 각 쌍에 대 한 최적화 된 프로그램으로 실행 합니다.
      참고: 분수에 특정 mRNAs의 존재를 감지, (격리 된 RNA)의 각 부분에서 동일 볼륨 반전 녹음 방송에 대 한 사용할 수 한다.
  3. 결과의 분석
    1. 관심 있는 유전자와는 luciferase Ct 값을 사용 하 여 델타 Ct 값 계산
    2. 다른 분수 (표 1)에 걸쳐 있는 mRNA의 분포를 시각화 하는 모든 분수에 포함 된 총 mRNA 값의 백분율로 각 분수 델타 Ct 값을 표현

4. 절연 및 Polysome 분수와 Nontranslating 분수에서 miRNAs의 분석

  1. MRNA와 미르 추출
    참고:이 프로토콜 몇 가지 변화 제조업체의 지침을 따릅니다.
    1. 글 리 코겐 및 스파이크 컨트롤 해 동. 얼음에 계속.
    2. 풀링된 샘플의 200 µ L를 미르 추출 시 약의 700 µ L를 추가 합니다.
    3. Glycogen의 µ 1 µ g/L을 추가 하 고는 피 펫을 사용 하 여 균질. 실 온에서 5 분 동안 그것을 품 어.
    4. 1.6 제어 스파이크에서 108 x의 3.5 µ L을 추가 하 고 그것을 혼합.
    5. 클로 프롬 및 소용돌이의 200 µ L 추가 적어도 15 초 동안 그것.
    6. 실내 온도에 3 분 동안 품 어.
    7. 4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g 에서 원심 분리기
    8. 피 펫을 사용 하 여, 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 전송. 중간 및 아래 단계를 삭제 합니다.
    9. 100% 에탄올 1.5 x 볼륨은 상쾌한을 추가 섞는다.
    10. 미르 추출 열에이 혼합물의 700 µ L를 전송 및 15에 대 한 최고 속도로 원심 RT와 흐름; 통해 삭제 s 나머지 모든 예제와 함께이 단계를 반복 합니다.
    11. 열에 버퍼 1의 700 µ L을 추가 하 고 15 최고 속도로 원심 RT; s 흐름을 통해 삭제 합니다.
    12. 열에 버퍼 2의 500 µ L을 추가 하 고 15 최고 속도로 원심 RT; s 흐름을 통해 삭제 합니다.
    13. 열에 80% 에탄올 500 µ L을 추가 하 고 RT;에서 2 분에 대 한 최고 속도로 원심 흐름을 통해 삭제 합니다.
    14. 세척제 새로운 2 mL 튜브, 뚜껑을 열고 5 분 최고 속도로 실시간에 원심을 열을 전송 흐름을 통해 삭제 합니다.
    15. 열 및 원심 분리기 전체에 얼음에는 eluate 실시간 유지에 1 분 동안 속도 또는 미래의 분석-80 ° C에서 저장 RNAse 무료 물 16 µ L를 추가 합니다.
      참고: 각 샘플의 두 microliters OD 분석에 사용할 수 있습니다.
  2. 반전 녹음 방송
    1. 얼음에 준비 합니다. 각 20 µ L RT-PCR 반응에 대 한 추가 미르 RT 버퍼의 4 µ L, 핵 산의 2 µ L, 총 RNA 2 µ L의 효소, RNAse 무료 물; 3 µ L의 9 µ L 그것을 혼합 하 고 짧게 스핀 다운.
    2. 다음과 같이 열 Cycler 설정.
      60 분;에 대 한 37 ° C
      95 ° C 5 분;
      4 ° C를 개최.
    3. 열 cycler에서 튜브를 제거 하 고 물 RNAse 무료 200 µ L를 추가 합니다. -20 ° C에서 저장 또는 실시간 PCR로 진행.
  3. 실시간 PCR
    참고:이 프로토콜은 96 잘 접시 형식을 따릅니다. 얼음에 반응 혼합을 준비 합니다.
    1. PCR 반응 혼합을 준비 하 고는 프로토콜에 의해 허용 하는 범위에 따라 (위의 miRNAs) 로부터 cDNA를 추가. 여러 반응 일괄 처리에서 준비 될 수 있습니다.
    2. 각 잘에서 PCR 믹스 + cDNA의 25 µ L의 합계를 추가 합니다.
    3. 광 판 인감을 사용 하 여 접시를 봉인.
    4. 실 온에서 1000 x g 에서 1 분 동안 접시 원심
    5. 프로그램 실시간 cycler 다음과 같습니다.
      15 분 동안 95 ° C에서 초기 활성화 단계
      3 단계 자전거: 15 94 ° C에서 변성 s; 30 55 ° C에 어 닐 링 s; 30 70 ° C에서 확장 s (형광 데이터 수집을 수행); 추가 40 주기;
      녹는-cycler 기본에 따라 곡선입니다.
  4. 비교 분석
    1. 정규화의 예 ( 표 2참조):
      1. SCM의 최소 값을 찾을.
      2. 모든 SCM 값이이 최소한을 정상화.
      3. (나) 관심과 참조 유전자 (REF)의 miRNAs의 Ct 값에서이 값을 뺍니다.
      4. 2-ΔCt 수식을 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.

5. Proteomic 분석

  1. Polysome 분수에서 단백질의 추출
    1. 수집 된 자당 분수를 결합 하 여 3 개의 마지막 조각으로. 무거운 (4, 5, 6 및 7 자당의 높은 농도 함께 풀링된 분수에 고효율 polysomes; 그라데이션 튜브의 아래쪽), 분수 표시 빛 (낮은 효율 polysomes 풀링된 분수 8, 9, 10, 11;의 중간에 그라데이션 튜브) 번역 비 (자당의 풀링된 분수 12, 13, 14 및 15 낮은 농도로, 그라데이션 튜브의 상단). 풀링된 분수에 단백질 분석을 수행 합니다.
    2. 100% 재고 trichloroacetic 산 (TCA)를 준비 하 고 어둠 속에서 4 ° C에서 그것을 저장. 100%의 60 µ L 샘플의 0.5 mL 혼합 TCA와 어둠 속에서 하룻밤-20 ° C에서 품 어.
      참고: 1.5 mL 낮은 단백질 보존 튜브 ( 재료의 표참조)를 사용 합니다.
    3. 밤새 부 화 후 얼음에 15000 x g30 분 삭제 상쾌한 4 ° C에서 원심 분리기 샘플을 녹여.
      참고: 샘플에서 총 단백질의 100 µ g 튜브 하단에 보이는 단백질 펠 릿을 제공합니다.
    4. 사전-20 ° C 냉장고에 아세톤을 진정. 단백질 펠 릿 및 15000 x g15 분 삭제 상쾌한 4 ° C에서 원심 분리기에 찬 아세톤의 0.5 mL를 추가 합니다. 이 단계를 두 번 반복 합니다.
    5. 공기 건조는 펠 릿. 50 mM Tris HCl 버퍼 (pH 8)의 360 µ L에 펠 릿을 resuspend.
      참고: 필요한 경우 사용 하 여 펄스 sonicator resuspend 펠 릿을.
    6. 0.1 m M dithiothreitol의 40 µ L을 추가 (최종 농도 10 m m)와 0.15 M iodoacetamide의 45 분 추가 50 µ L에 대 한 셰이 커에 55 ° C에서 품 어 (최종 농도 17 m m)와 어둠 속에서 30 분 통에 실 온에서 품 어.
    7. 트립 신 솔루션 준비: trypsin의 20 µ g 50 m m 염화 중 탄산염의 100 µ L에서 resuspend. 1:50 (w/w) trypsin 솔루션의 해당 볼륨 샘플을 추가 트립 신: 단백질 비율을 pH 8을 확인 하 고 37 ° C에서 셰이 커에 하룻밤 사이 품 어.
      참고: 추가 1 M 염화 중 탄산염 pH 8 하 려 합니다.
    8. 트립 신 소화 후 멋진 벤치 원심 분리기에서 짧게 원심 분리기 샘플 추가 10% 개미 산 트립 신 활동을 끄다 샘플 담 진행을 pH 2-3에.
      참고: 샘플 담 대 한 µ 차입 플레이트를 사용 합니다.
    9. 상태는 매 우물에 세 번 뒤 컨디셔닝 0.1% 개미 산의 200 µ L에 의해 세 번 진공을 사용 하 여 메탄올의 200 µ L 96 잘 접시의. 샘플을 로드 하 고 세 번 0.1% 개미 산의 200 µ L를 사용 하 여 샘플 세척을 수행 합니다. 낮은 단백질 보존 0.5 mL 튜브에 두 번 50 %acetonitrile/0.1% 포 름 산의 100 µ L로 샘플을 elute.
      참고: 샘플 Elute 천천히 처음에 인력을 사용 하 여 다음 낮은 진공.
    10. 집중 장치를 사용 하 여 건조를 샘플 eluate 증발 하 고 하거나 직접 수행 질량 분석 분석 또는 저장소 사용까지-80 ° C에서.
  2. 질량 분석 분석
    1. 50-100 µ L에서 각 펠 릿 (tryptic 펩 티 드로 구성 된)를 다시 구성 하 고 1 µ L을 질량 분석기에 주입.
      참고: 최대 강도 LC/MS/MS 신호를 재구성 및 사출 볼륨을 최적화 합니다. 우리의 경우, 최대 신호 (총 이온 전류; TIC)에 스캔의 2E9에 1E8의 범위에서 했다.
    2. 트랩 열 C18 (300 µ m 아이디 x 5 m m, 5 µ m, 100Å) 다음 펩타이드 분리 C18 열 (250 m m, 2 µ m, 100Å x 75 µ m 아이디)를 사용 하 여 흐름 속도 설정은 300 nL/분 세트 나노 소스 모 세관 온도에서 275 ° C와 2 스프레이 전압 kV.
    3. 5-35% B 90 분, 7 분 및 25 분 (a: 0.1% 포 름 산/물과 이기에 b: 0.1% 포 름 산) 5 %B 평형에 대 한 95 %B 3 분 35-95 %B 선형 그라데이션이 적용 됩니다. CID 모드를 사용 하 여 각 MS1 스캔에서 15 높은 강도 이온에 대 한 MS2 스펙트럼을 취득. 3 질량 분석 복제를 사용 하 여 분석 하는 각 샘플에 대 한.
      참고: 최적화 하 고 실험 조건 및 특정 질량 분석 악기에 샘플에 대 한 적합 한 매개 변수를 사용 하 여. 조건/매개 변수 섹션 5.2에서에서 언급입니다. 사용 하 고 우리의 실험실에 최적화 되었다.
  3. 단백질 식별/정량
    1. 질량 분석 분석 후 원시 스펙트럼 파일 MSConvert 소프트웨어 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html)를 사용 하 여 호환 mzXML 파일으로 변환.
    2. SEQUEST 검색 엔진 검색 기준으로 예를 들어, UniProtKB/스위스-보호 마우스 데이터베이스 (가장 최신 정식 검토);로 변환 된 파일을 제출 트립 신을 사용 하 여 세미 효소 다이제스트 (KR 후 /-); 최대 2 놓친 분열; 선구자 질량 범위: 400 4500 amu; 정적 수정: carbamidomethyl (C) 57.021465 amu; 펩 티 드 대량 허용 오차: 50 ppm; 조각 대량 유형: monoisotopic.
      참고: 다른 단백질 데이터베이스 검색 엔진 및 데이터 파이프라인 사용할 수 있습니다. 예: 쥐, 마우스 및 인간의 데이터베이스 보다 덜 완전 한 인에 대 한 데이터베이스를 사용 하 여 마우스 (또는 인간)에 대 한 검색을 할 수 있습니다 프로테옴 범위 증가 데이터베이스. 이 경우에, 단백질 이름 중복 제거 해야 합니다.
    3. 포스트 검색 분석을 수행 합니다. 데이터를 보기 위한 필터를 설정 합니다. 예를 들어 95% 또는 99%, 즉, 통계 분석 의미 95% 또는 99% 확률의 샘플에 존재 하는 단백질만이 표시 됩니다 확률을 최소 단백질 (단백질 임계값)를 설정 합니다. 펩 티 드 임계값 (예: 95%)에 대 한 필터 설정 즉, 스펙트럼은 펩 티 드를 식별 하는 여부 결정에 사용 될 최소 확률. 펩 티 드 단백질 존재 인지를 결정 하는 최소 수 선택 (2 펩 티 드 단백질 식별을 위한 최소 권장).
    4. 품질/수량에 대 한 확인 된 단백질을 평가 합니다. Proteotypic 펩 티 드 정량화에 사용 되는 확인 하십시오. Isoform 식별 확인 그것 특정 isoform에 고유한 아미노산 시퀀스의 구성 tryptic 펩 티 드의 관찰에 기초 합니다. 어떤 "비슷한" 또는 가상 단백질 있는지 비교 받아야 한다 관찰 알려진된 단백질에 해당 하는 펩 티 드.

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결과

mRNA 분석
mRNA 결과 각 분수 (그림 3A); 특정 mRNA의 배포로 표현 될 수 있습니다. 정량화, polyribosomal 번역 분수를 결합 하 고 nontranslating 분수 번역 mRNA 풍부의 비율을 제시 번역 비 분수 (그림 3B), 비교. 추가 정보는 별도로에서 낮은 효율 polysome 분수 (그리고 nontranslating 분수에서 별도) 고효율 polysome 분수를 검사 하 여 얻었다. (그들은 그들의 표적 mRNAs의 단백질 번역 방해 어디에) 낮은 효율 분수에 농축 miRNAs를 분석할 때 특히 중요 하다.

담당자 변경 마우스 마음 허 혈 및 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 대상이 됐다 후 번...

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토론

Polysome 프로필 분석 특정 mRNA 또는 전체 transcriptome6,7의 변환 상태를 분석 하 여 단백질 번역의 연구에 대 한 수 있습니다. 그것은 또한 큰 도움이 현지 번역 synaptosomes8같은 공부 될 필요가 있을 때입니다. 전통적으로,이 방법은 모노-및 polyribosomes 및 자당 그라디언트는 수와 결합 게놈 또는 의도 된 결과6,9를 proteomic 기술을에 관련 된 mRNAs의 분리를 포함 한다. 예를 들어, 우리의 그룹에 의해 수행의 최근 연구는 환자 CPB, 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해 모방의 마음에서 실행 post-transcriptional 규제 메커니즘을 밝혔다. Polysome 프로 파일 분석을 이용해 우리 CPB ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

NIH P01 HL112730 (걸 레, JVE), NIH R01 HL132075 (걸 레, JVE), 바브라 스 트라이 샌드 여자의 심장 센터 (걸 레, JVE), 도로시와 E. 필립 리옹 분자 심장 (걸 레)에서 자, 에리카 글 레이저 부여 여성의 심장 건강 (JVE)에 체코 과학 아카데미의의 자 제도적 지원 RVO: 68081715 (MS)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PentobarbitalVortech Phamaceuticals9373안락사에 대한
헤파린Sagent103424langendorff 준비
겸자에파인 사이언스 도구91110-10심장을 걸기 위해 사용
Langendorff 시스템Radnoti + 집에서 만든n / a사용자 정의 불어 유리, 튜브 및 수조로 구성된 '4 개의 심장'시스템
NaCl시그마S7653-5KG크렙스 완충액 및 자당 구배
KCl시그마P5405크렙스 완충액 및 용해 완충액
KH2PO42SigmaP-5504크렙스 완충액
MgSO4SigmaM7774-500G크렙스 완충액
포도당시그마G5767크렙스 버퍼
CaCl2SigmaC1016-500G크렙스 완충액
자당 분말SigmaS0389-1KG자당 구배
MgCl2Sigma208337자당 구배 및 용해 완충액
Tris-baseSigmaT1503-1KG자당 구배 및 용해 완충액
Xylene CyanoleSigmaX-4126자당 구배
Cycloheximide시그마-알드리치, 239763자당 구배 및 용해 완충액
RNaseOUTLife TechnologiesC00019용해 완충액용 RNAse 억제제
Igepal CA-360 (NP40)SigmaI3021용해 완충액
프로테아제 억제제 칵테일 정제, EDTA 무료Roche5056489001
튜브, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mmBeckman Coulter344059
UltracentrifugeBeckmanLE-80K그래디언트 초원심분리
RotorBeckmanSW41그래디언트 초원심분리
Biologic LP (pump)Biorad731-8300그래디언트 분획
BioFracBiorad741-0002그래디언
Eppendorf RNA/DNA LoBind 마이크로 원심분리 튜브, 2 mL 튜브SigmaZ666513-100EA그래디언트 분획 및 RNA 추출
TRIzol 시약Life TechnologiesAM9738RNA 추출
Luciferase Control RNAPromegaL4561RNA 추출
ChloroformFisher ScientificC606-4RNA 추출
글리코겐, RNA 등급Thermo Fisher ScientificR0551RNA 추출
이소프로판올시그마I9516RNA 추출
에탄올시그마E7023-1LRNA 추출
iScript cDNA 합성 키트BioRad170-8891역전사
iTaq Universal SYBR Green SupermixBioRad175-5122Quantative PCR
miRNeasy Micro Kit (50)총 RNA 분리를 위한Qiagen217084
miScript II RT Kit (50)miRNA 역전사를 위한Qiagen218161
miScript Sybr Green PCR Kit (200)miRNA의 real-time PCR 발현 분석을 위한Qiagen218073
Centrifuge 5424REppendorf다양한 온도에서 1.5 mL 또는 2.0 mL 튜브의 원심분리용. 최대 속도 - 21130 x g
Centrifuge 5810REppendorf다양한 온도에서 Real-Time PCR 플레이트 원심분리용. 최대 속도 - 2039 x g
My Cycler Thermal CyclerBio-Rad역전사용
CFX96 실시간 시스템/C1000 터치 Thermal CyclerBio-Rad실시간 PCR 분석용
miRNeasy 혈청/혈장 스파이크 인 제어Qiagen219610RNA 분리의 품질 관리용
하드-쉘 96-Well PCR 플레이트, 로우 프로파일, 얇은 벽, 스커트, 녹색/투명Bio-RadHSP9641실시간 PCR 분석용
Microseal 'B' PCR 플레이트 밀봉 필름, 접착제, 광학Bio-RadMSB1001실시간 PCR 플레이트 밀봉
연구용 및 단일 채널 피펫, 회색;0.5-10 &마이크로; LEppendorfUX-24505-02
PIPETMAN Classic 피GilsonF123600G
PIPETMAN Classic 피펫 피펫, P200GilsonF144565
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS 피펫 100-1000 µ LGilson17011782피펫팅용
, RNA 등급Thermo Fisher ScientificR0551총 RNA 분리 효율 향상
Posi-Click 1.7 mL 튜브, 자연색DenvilleC2170RNA 분리 및 보관; 시약 혼합
Thermal Cycling Tubes -0.2 mL 개별 캡, 광학DenvilleC18098-4 (1000910)가 있는 표준 0.2 mL 튜브역전사 반응
Sharp 10 정밀 배리어 팁DenvilleP1096-FR피펫팅용
Sharp 20 정밀 배리어 팁DenvilleP1121피펫용
Sharp 200 정밀 배리어 팁DenvilleP1122피펫팅
팁 LTS 1 mL 필터RaininRT-L1000F피펫팅용
miScript Primer Assay ( 200)Qiagen(miRNA에 따라 변화)실시간 PCR 분석용
Gradient Master ver 5.3 Model 108BioComp Instruments당 구배
트리클로로아세트산제조용 Sigma AldrichT6399
아세톤Sigma Aldrich650501
Tris hydrochlorideAmrescoM108
디티오트레이톨피셔 사이언티픽BP172
요오드아세트아미드Gbiosciences,RC-150
염기서열분석 등급, 변형 트립신, 돼지프로메가V5111,
암모늄 바이카보네이BDHBDH9206
포름산, 옵티마 LC/MS, 피셔 케미컬A117
메탄올, 옵티마 LC/MSFisher ChemicalA454
아세토니트릴, Optima LC/MSFisher ChemicalA996
Protein LoBind 튜브 0.5 mLEppendorf AG22431064
Protein LoBind 튜브 1.5 mLEppendorf AG22431081
HLB µ 용출판 30&마이크로; mOasis186001828BA
SpeedVac 집중 장치, Thermo ScientificSavant SPD2010
초음파 발생기QsonicaOasis180
원심분리기, Thermo ScientificSorvall, Legend micro, 21R
LC, 트랩 컬럼, PepMap 100 C18Thermo Scientific160454
LC 분리 컬럼, PepMap, RSLC C18Thermo Scientific164536
질량분석기Thermo ScientificOrbitrap Elite 이온 트랩 질량분석기
MSConvert 소프트웨어ProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST 소프트웨어Sage-N Research, Inc.
사용 , , , 트 Kit Kit Kit펫 피펫, P20 글리코겐 자, , , , , 트, , , , , , ,

참고문헌

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