여기, 우리가 순진한 CD4 + T 세포, 순진한 CD4 + T 세포, THGM의 차별화의 격리를 포함 하 여에서 murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T 도우미 (THGM) 세포를 분화 하는 프로토콜을 제시 하 고 차별화 된 THGM 셀의 분석. 이 메서드는 규칙의 연구 및 THGM 세포의 기능에 적용할 수 있습니다.
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방법 논문
생체 외에서 마우스 Granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)-T (THGM) 도우미 셀 생산
이 논문에서
요약
초록
Granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)-T 도우미 (THGM) 셀 생산은 주로 인터페론 (IFN) γ 또는 인터 루 킨 (IL)-17 생산 하지 않고 GM-CSF를 분 비 하 고 발견 된다 새로 확인된 된 T 도우미 셀 하위 집합 면역 neuroinflammation에 필수적인 역할을 재생 합니다. Splenocytes의 단일 세포 현 탁 액에서 순진한 CD4 + T 세포 및 THGM 순진한 CD4 + T 세포에서 세포 생성의 격리 하는 방법 T 세포 중재 면역과 면역 질환의 연구에 유용한 기술 될 것 이다. 여기는 일리노이-7에 의해 추진 THGM 셀으로 마우스 순진한 CD4 + T 세포를 구분 하는 방법에 설명 합니다. 분화의 결과 세포내 cytokine cytometry, 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)와 함께 얼룩을 포함 하 여 다른 기술을 사용 하 여 cytokines 식의 분석에 의해 평가 되었다 고 효소 연결 된 immunosorbent 분석 (ELISA) 프로토콜을 사용 하는 THGM 차별화 설명 여기, 세포의 약 55 %IFNα 또는 IL-17의 최소한의 표현으로 GM-CSF를 표현. GM-CSF THGM 세포의 주된 표현 추가 GM-CSF, IFNα, 및 mRNA와 단백질 수준에서 IL-17의 발현의 분석에 의해 확인 되었다. 따라서,이 메서드는 순진한 CD4 + T 세포 T로 차별화 하는 데 사용할 수 있습니다HGM에서 생체 외에서세포는 THGM 세포 생물학의 연구에 도움이 될 것입니다.
서론
CD4 + T 도우미 (TH) 세포는 미생물 병원 체에 대 한 호스트 방어, 암 감시, 그리고 면역1,2,3중요 한 역할을가지고 면역 시스템의 필수적인 구성 요소입니다. T 세포 수용 체 (TCR) 활성화, 순진한 CD4 + T 세포는 TH1, TH2로 분화 될 수 있다, TH 17, 또는 규제 T (Treg) 세포 다른 cytokine milieus2,4, 의 영향 5. 최근, 주로 GM-CSF 생산, TH 세포의 새로운 하위 집합 확인 되었고 THGM6라는. THGM 세포의 분화는 신호 변환기의 활성화 및 전사 5 (STAT5)의 활성을 통해 일리노이-7에 의해 구동 됩니다. 다른 TH의 낮은 표현 하면서 GM-CSF의 큰 금액을 표현 하는 이러한 세포-세포 IFNγ 및 IL-176등 서명 cytokines. GM-CSF는 CD4 + T 세포 중재 neuroinflammation7,8의 개발에 중요 한 역할을 발견 했다. IFNγ-또는 IL-17-표현 autoreactive T 세포에 비해, GM-CSF 표현 T 세포는 이전 질병 발병과 높은 질병 심각도 야생-타입에 전송된 (WT) 마우스. 또한, Csf2-/-T 세포 하지 못했습니다 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) 유도 adoptively WT 받는 사람에 게 전송 후 IFNγ 또는 IL-17A 부족 한 T 세포 EAE7을 중재 하는 기능을 유지 하는 반면. 또한, 중화 항 체를 사용 하 여 GM-CSF의 봉쇄 ameliorated EAE 질병 심각도8. 또한, 마우스에서 T 세포에 STAT5의 결핍 EAE 개발6저하 THGM 세대에서 그리고, 따라서, 생쥐의 저항에서 결과. 이러한 연구 결과 면역 neuroinflammatory 질병에서 GM-CSF 표현 TH 세포의 중요성을 밑줄. 따라서, GM-CSF 표현 TH 순진한 CD4 + T 세포에서 세포를 분화 하는 방법을 구축 면역 neuroinflammation 및 T 세포 중재 면역 응답의 pathogenesis의 연구에서 중요 한 것입니다. 그러나, 프로토콜을 효율적으로 THGM 세포에서에서 생성 murine 순진한 CD4 + 설립 되지 않았습니다.
여기 우리 순진한 CD4 + T 세포에서 murine THGM 셀을 구분 하는 방법 제시. 이 프로토콜에서 마우스 비장 추출, 단일 세포 현 탁 액, CD4 긍정적인 선택, 정렬 (FACS), 형광 활성화 된 세포 및 TH 세포의 준비를 포함 하 여 모든 절차에 설명 감 별 법 및 분석입니다. 차별화 된 T 보조 세포 mRNA 수준에서 cytokine 식을 결정 하려면 양적 실시간 PCR에 의해 단일 세포 수준에서 cytokine 식을 결정 하려면 cytometry 결합 얼룩이 지는 세포내 cytokine에 의해 분석 되 고 단백질 수준에서 cytokine 식 평가 하 일 라 여. 이 메서드는 THGM EAE, GM-CSF, 병 인에 중요 한 역할 등 다양 한 조건 하에서 세포 생물학의 연구에 적용할 수 있습니다.
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프로토콜
이 프로토콜에서 사용 하는 모든 마우스 C57BL/6 유전 배경에 되었고 싱가포르 국립 대학에서 특정 병원 체 자유로운 조건에서 보관. 모든 실험 기관 동물 관리 및 사용의 싱가포르의 국가 대학 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜을 사용 하 여 수행 했다.
1. 시 약 및 재료 준비
- 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 포함 하는 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)과 1 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 500 mL를 준비 합니다.
참고: 최적의 결과 대 한 전체 절차를 통해 얼음에 버퍼를 유지 합니다. - 완전 한 RPMI 미디어 포함 된 RPMI 1640, 10 %FBS, 및 1% 페니실린 스 50 mL를 준비 합니다. 50 µ M THGM 세포 분화에 대 한 β-mercaptoethanol을 포함 하는 완전 한 RPMI 미디어를 사용 합니다. 증기 두건에서 β-mercaptoethanol을 추가 합니다.
- 안티-CD3e 집중 재고 3 μ g/mL PBS에 희석 하 여 안티-CD3e 항 체 혼합물의 7.5 mL를 준비 합니다. 각 항 체 혼합물의 추가 150 μ에 의해 코트 48-잘 접시 고 하룻밤 또는 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 4 ° C에서 접시를 품 어.
- 한 쌍의가 위와 집게를 소독 하 고 70% 에탄올 해 사이에서 그들을 유지.
2입니다. Murine Splenocytes의 준비
- (6-8 주 이전)의 마우스를 안락사 제도 승인 CO2 질 또는 자 궁 경부 전위를 사용 하 여. 70% 에탄올으로 마우스를 살포 하 고 그 뒤에 폴리스 티 렌 블록에 마운트. 생물 안전 캐비닛 다음 단계를 진행 하는 마우스를 전송 합니다.
- 집게의 쌍을 사용 하 여 피부를 개최 하 고 약 4 cm,가 위를 사용 하 여 왼쪽에 흉 곽 아래 피부를 잘라. 비장을 노출 하 고 메 마른 집게를 사용 하 여 비장 추출 복 주머니를 엽니다.
- 50 mL 튜브에 70 μ m 셀 스 트레이너를 놓고 미리 버퍼의 2 mL와 함께 그것을 젖은. 셀 스 트레이너 (한 셀 스 트레이너에 대 한 2-3 spleens)에 spleens를 놓고 5 mL 주사기 플런저의 끝을 사용 하 여 macerate.
- 모든 셀 튜브에 플러시됩니다 때까지 스 트레이너 및 여러 번 셀 절연 버퍼의 1-2 mL와 함께 튜브를 헹 굴. 셀 스 트레이너를 삭제 하 고 350 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심 폐기는 상쾌한.
- 감기 (4 ° C) 암모늄-염화-칼륨 (ACK) lysing 버퍼 (150 m m NH4Cl, 10 m m KHCO3, 0.1 m m 나2EDTA, pH 7.2-7.4)의 5 mL와 함께 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 부드럽게 중화 ACK를 완전 한 RPMI 미디어의 2 분 추가 10 ml 그들을 혼합합니다 버퍼 및 즉시 350 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심 원심 분리 후에 상쾌한 폐기.
3. 격리의 CD4 + T 세포 세포 분리 열과 마그네틱 CD4 Microbeads를 사용 하 여
- 셀 절연 버퍼의 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 세포 현 탁 액 모든 파편을 제거 하는 새로운 15 mL 튜브에 사전 분리 필터 (30 μ m)를 사용 하 여 필터링 합니다.
- 세포 현 탁 액의 10 μ 고 버퍼의 90 μ를 추가 하 여 10 배 희석을 만들. 10 μ 희석된 세포 현 탁 액의 고 trypan 블루 셀 카운팅을 위한 10 μ 함께 섞는다. 실행 가능한 세포의 수익률을 확인 하려면 hemocytometer 셀을 계산 합니다.
- 350 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 및 삭제는 상쾌한.
- 107 셀 당 90 μ 버퍼의 셀을 resuspend. 마그네틱 CD4 microbeads 107 셀 당 10 μ를 추가 합니다. 4 ° c.에서 15 분에 대 한 셀을 품 어 최적의 결과 대 한 혼합 셀 서 스 펜 션 5 분에 부드럽게 부 화 하는 동안.
- 셀은 잠복기 동안 마그네틱 스탠드에 분리 열을 배치 합니다. 미리 열 버퍼의 2 mL을 젖은.
- 셀/구슬 외피의 끝에, 버퍼의 5 mL로 세포 세척 및 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g 에서 원심 폐기는 상쾌한.
- Resuspend 버퍼의 1 mL에 셀, 셀 분리 열에는 샘플을 로드 하 고 통과 하자. 15 mL 원심 분리기 튜브를 사용 하 여 CD4 세포 분수를 수집. 그것은 건조 하기 전에 저수지를 씻어 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 2 x 세척 단계를 반복 합니다.
- 마그네틱 스탠드에서 셀 분리 열을 제거 하 고 새로운 15ml 원심 관에 배치. 셀 분리 열 셀 절연 버퍼의 2 개 mL를 추가 하 고 열에서 셀을 단단히 플런저를 적용.
- CD4 + 세포를 4 ° C에서 5 분 동안 350 x g 에서 분수 원심 폐기는 상쾌한.
4. 정화 순 CD4 + T 세포 (CD4+CD25-CD44loCD62L안녕) 형광 활성화 된 세포 분류와 THGM 차별화 하 여
- 버퍼의 500 µ L에서 얻은 CD4 + 세포 pellet을 resuspend. 형광 활용 된 항 체 혼합물 CD4-PerCp를 포함 하는 셀 믹스 (2.8 µ g/mL), CD44 APC (2.4 µ g/mL), CD25-PE (2 µ g/mL), 및 CD62L FITC (10 µ g/mL) (표 1). 빛에서 그들을 보호 하면서 20-30 분 동안 얼음에 셀을 품 어.
참고: 항 체의 농도 이전 실험실에 최적화 했다. 나열 된 항 체의 수는 1-2 마우스에서 셀입니다. - 부 화 후 버퍼의 5 mL로 세포 세척 하 고 350 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심
- 삭제는 상쾌한 고 resuspend 버퍼의 500 µ L에 셀. 다시 나일론 메쉬를 사용 하 여 셀을 필터링 합니다.
- 셀 정렬 FACS 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 버퍼의 500 µ L 컬렉션 FACS 튜브 precoat
- 얻기는 CD4+CD25-CD44loCD62L안녕하세요 인구 (순진한 CD4의+ T 세포) FACS 정렬. CD4에 게이트+CD25- 첫 번째, 및 다음 선택 CD44loCD62L안녕하세요 셀이이 인구에서.
- 순진한 CD4 수집+ T 새로운 15 mL 원심 분리기 관으로 분수를 셀. 350 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 및 삭제는 상쾌한.
- 50 µ M β-mercaptoethanol을 포함 하는 완전 한 RPMI 미디어에 106 셀/mL의 농도에서 순진한 CD4 + T 세포 resuspend
- 안티-CD3e 항 체를 precoating 48-잘 접시에 대 한 사용 발음 일리노이-7 각 잘에서 씨 0.25 백만 (250 µ L) 셀 (2 ng/mL), 안티-CD28 (1 µ g/mL), 및 안티-IFNγ (10 µ g/mL) (표 1).
참고: 사이토카인 및 항 체의 농도 이전 THGM 세포 분화에 대 한 실험실에 최적화 했다. - 3 일 동안 5% CO2 와 37 ° C에서 세포를 품 어. 매체는 인큐베이션 기간 동안 변경 하지 마십시오.
5. 마우스 THGM 셀의 분석 생체 외에서 생성
- 현미경을 사용 하 여, 세포 분화 3 d 분화 후 확인 합니다. 세포를 수확 하 고 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g 에서 원심 2 세포를 씻어 완전 한 RPMI 미디어와 x.
참고: 차별화 된 셀은 순진한 CD4 + T 세포 보다 크기가 큽니다. - 완전 한 RPMI 미디어의 1 mL에 셀 resuspend 세포 현 탁 액의 10 μ 고 trypan는 hemocytometer와 휴대폰 번호를 확인 하려면 파란색의 10 μ 함께 잘 섞는다. Restimulation 및 분석에 대 한 세 가지 묘약으로 차별화 된 셀을 나눕니다.
참고: 세포내 cytokine 얼룩과 ELISA 분석 실험 필요 이들 백만 셀, 그리고 정량 분석 ≥ 1 백만 세포가 필요 합니다. -
세포내 cytokine 얼룩에 대 한 restimulate phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 셀 (100 ng/mL)와 단백질 수송 억제제 (1 µ L/mL) 4-6 h 존재 ionomycin (1 μ g/mL).
- 세포를 수확 하 고 안티-CD4 항 체로 그들을 얼룩 (PerCP 활용 된 0.2 mg/mL, 1: 100 희석; 또는 FITC 활용, 0.5 mg/mL, 1: 100 희석) 30 분.
- 20-60 분에 대 한 고정 버퍼의 200 μ와 셀을 수정 합니다. 고정 후 씻어 셀 2 x permeabilization 버퍼의 1 mL.
- GM-CSF (PE 활용, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석)에 대 한 항 체와 세포내 얼룩 IL-17A (FITC 활용, 0.5 mg/mL, 1: 100 희석; 수행 APC-conjugated, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석), 일리노이-4 (APC 활용, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석), 및 IFNγ (APC 활용, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석; PE-conjugated, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석) 어둠 속에서 30 분.
- 차별화 된 세포 cytokine 유전자 발현의 정량 분석을 위해 (1.3 단계에서 설명한 대로 접시 precoating) 플레이트-바인딩 안티-CD3e (3 μ g/mL)와 셀을 활성화 합니다. 자극 후 3 h는 정량에 대 한 cDNA를 준비 하는 페 놀 RNA 추출 시 약을 사용 하 여 전체 RNA를 분리 하는 세포를 수확. 프라이 머와는 정량에 사용 하는 프로그램 표 2 와 3, 각각 나열 됩니다.
- 차별화 된 세포 cytokine 단백질 분 비의 분석을 위해 24 h (1.3 단계에서 설명한 대로 접시 precoating) 플레이트-바인딩 안티-CD3e (3 μ g/mL)와 셀 restimulate. 그들의 농도 결정 하는 IL-17 및 GM-CSF ELISA 표면에 뜨는 세포 배양 수확.
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결과
2 8 주 오래 된 남성 C57BL/6 쥐에서 고립 된 naive CD4 + T 세포 세 부분으로 분할 되었다. 세포의 한 부분 설명 하는 프로토콜에 따라 THGM 세포로 분화 했다. 다른 부분 THGM의 차별화에서 IL-4 봉쇄의 영향을 테스트 안티-일리노이-4 항 체 (10 µ g/mL)의 THGM 조건 하에서 경작 되었다. 마지막 부분 (3 µ g/mL 안티-CD3e, 1 µ g/mL 안티-CD28, 10 ng/mL TGFβ, 30 ng/mL 일리노이-6, 10 µ g/mL 안티-IFNγ, 및 안티-일리노이-4 10 µ g/mL) TH17 차별화 조건 하에서 경작 되었다. 차별화의 3 일 후 세포 수확 되었고 세포내 cytokine 얼룩, 정량, 그리고 ELISA cytokine 식 분석을 restimulated. 세포내 cytokine 얼룩 및 FACS 분석 결과를 보여주는 T...
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토론
여기 우리는 생체 외에서 THGM 차별화의 마우스 순진한 CD4 + 세포, 메서드를 확인 하기 위해 차별화 된 세포의 분석에 의해 뒤에서 프로토콜을 설명 합니다. 노트, 비장 및 림프절 순진한 CD4 + T 세포 정화와 THGM 차별화에 대 한 사용할 수 있습니다. 세포내 cytokine 얼룩 cytometry 셀의 약 55% 보여주었다 결합에 의해 결정 하는 cytokine 식 THGM 상태 (그림 1A)에서 GM-CSF 표현 세포가를 유도 했다. TH17 차별화 조건 셀에 비해, THGM 상태 하에서 분화 하는 셀에 포함 된 IL 17 표현 인구;의 배경 수준 그러나, il17 유전자 발현의 정량 (그림 2A)에 의해 감지 되지 않습니다.
흥...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 연구는 싱가포르 국립 대학교 건강 시스템 (T1-2014 년 10 월-12 및 T1-2015 년 9 월-10)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS 열 비활성화 | 염소자리 | FBS-HI-12A | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | 멸균수에서 1x PBS로 희석 |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK 버퍼 | Biolegend | 420301 | 멸균수에 희석 |
| strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LScolumn | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 마그네틱 스탠드 | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL 주사기 | Terumo | SS+01T | |
| 원심분리기 | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 세포 분류기 | Sony | Sony SY3200 세포 분류기 | |
| 50 mL 코니컬 원심분리기 | 튜브, Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL 코니컬 원심분리기 튜브 | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS 튜브 | Corning | 352054 | |
| 24웰 세포 배양 플레이트 | Greiner Bio-One | 662160 | |
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참고문헌
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- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149(2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
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- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
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- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
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재인쇄 및 허가
