생체 외에서 마우스 Granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)-T (THGM) 도우미 셀 생산

요약

여기, 우리가 순진한 CD4 + T 세포, 순진한 CD4 + T 세포, T_HGM의 차별화의 격리를 포함 하 여에서 murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T 도우미 (T_HGM) 세포를 분화 하는 프로토콜을 제시 하 고 차별화 된 T_HGM 셀의 분석. 이 메서드는 규칙의 연구 및 T_HGM 세포의 기능에 적용할 수 있습니다.

초록

Granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)-T 도우미 (T_HGM) 셀 생산은 주로 인터페론 (IFN) γ 또는 인터 루 킨 (IL)-17 생산 하지 않고 GM-CSF를 분 비 하 고 발견 된다 새로 확인된 된 T 도우미 셀 하위 집합 면역 neuroinflammation에 필수적인 역할을 재생 합니다. Splenocytes의 단일 세포 현 탁 액에서 순진한 CD4 + T 세포 및 T_HGM 순진한 CD4 + T 세포에서 세포 생성의 격리 하는 방법 T 세포 중재 면역과 면역 질환의 연구에 유용한 기술 될 것 이다. 여기는 일리노이-7에 의해 추진 T_HGM 셀으로 마우스 순진한 CD4 + T 세포를 구분 하는 방법에 설명 합니다. 분화의 결과 세포내 cytokine cytometry, 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)와 함께 얼룩을 포함 하 여 다른 기술을 사용 하 여 cytokines 식의 분석에 의해 평가 되었다 고 효소 연결 된 immunosorbent 분석 (ELISA) 프로토콜을 사용 하는 T_HGM 차별화 설명 여기, 세포의 약 55 %IFNα 또는 IL-17의 최소한의 표현으로 GM-CSF를 표현. GM-CSF T_HGM 세포의 주된 표현 추가 GM-CSF, IFNα, 및 mRNA와 단백질 수준에서 IL-17의 발현의 분석에 의해 확인 되었다. 따라서,이 메서드는 순진한 CD4 + T 세포 T로 차별화 하는 데 사용할 수 있습니다_HGM에서 생체 외에서세포는 T_HGM 세포 생물학의 연구에 도움이 될 것입니다.

서론

CD4 + T 도우미 (T_H) 세포는 미생물 병원 체에 대 한 호스트 방어, 암 감시, 그리고 면역^1,2,3중요 한 역할을가지고 면역 시스템의 필수적인 구성 요소입니다. T 세포 수용 체 (TCR) 활성화, 순진한 CD4 + T 세포는 T_H1, T_H2로 분화 될 수 있다, T_H 17, 또는 규제 T (Treg) 세포 다른 cytokine milieus^2,4, 의 영향 ⁵. 최근, 주로 GM-CSF 생산, T_H 세포의 새로운 하위 집합 확인 되었고 T_HGM⁶라는. T_HGM 세포의 분화는 신호 변환기의 활성화 및 전사 5 (STAT5)의 활성을 통해 일리노이-7에 의해 구동 됩니다. 다른 T_H의 낮은 표현 하면서 GM-CSF의 큰 금액을 표현 하는 이러한 세포-세포 I....

프로토콜

이 프로토콜에서 사용 하는 모든 마우스 C57BL/6 유전 배경에 되었고 싱가포르 국립 대학에서 특정 병원 체 자유로운 조건에서 보관. 모든 실험 기관 동물 관리 및 사용의 싱가포르의 국가 대학 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜을 사용 하 여 수행 했다.

1. 시 약 및 재료 준비

1. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 포함 하는 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)과 1 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 500 mL를 준비 합니다.
   참고: 최적의 결과 대 한 전체 절차를 통해 얼음에 버퍼를 유지 합니다.
2. 완전 한 RPMI 미디어 포함 된 RPMI 1640, 10 %FBS, 및 1% 페니실린 스 50 mL를 준비 합니다. 50 µ M T_HGM 세포 분화에 대 한 β-mercaptoethanol을 포함 하는 완전 한 RPMI 미디어를 사용 합니다. 증기 두건에서 β-mercaptoethanol을 추가 합니다.
3. 안티-CD3e 집중 재고 3 μ g/mL PBS에 희석 하 여 안티-CD3e 항 체 혼합물의 7.5 mL를 준비 합니다. 각 항 체 혼합물의 추가 150 μ에 의해 코트 48-잘 접시 고 하룻밤 또는 적어도 1 시간 동안 37....

결과

2 8 주 오래 된 남성 C57BL/6 쥐에서 고립 된 naive CD4 + T 세포 세 부분으로 분할 되었다. 세포의 한 부분 설명 하는 프로토콜에 따라 T_HGM 세포로 분화 했다. 다른 부분 T_HGM의 차별화에서 IL-4 봉쇄의 영향을 테스트 안티-일리노이-4 항 체 (10 µ g/mL)의 T_HGM 조건 하에서 경작 되었다. 마지막 부분 (3 µ g/mL 안티-CD3e, 1 µ g/mL 안티-CD28, 10 ng/mL TGFβ, 30 ng/mL 일리노이-6, 10 µ g/mL 안티-IFNγ, 및 안티-일리노이-4 10 µ g/mL) T_H17 차별화 조건 하에서 경작 되었다. 차별화의 3 일 후 세포 수확 되었고 세포내 cytokine 얼룩, 정량, 그리고 ELISA cytokine 식 분석을 restimulated. 세포내 cytokine 얼룩 및 FACS 분석 결과를 보여주는 T_.......

토론

여기 우리는 생체 외에서 T_HGM 차별화의 마우스 순진한 CD4 + 세포, 메서드를 확인 하기 위해 차별화 된 세포의 분석에 의해 뒤에서 프로토콜을 설명 합니다. 노트, 비장 및 림프절 순진한 CD4 + T 세포 정화와 T_HGM 차별화에 대 한 사용할 수 있습니다. 세포내 cytokine 얼룩 cytometry 셀의 약 55% 보여주었다 결합에 의해 결정 하는 cytokine 식 T_HGM 상태 (그림 1A)에서 GM-CSF 표현 세포가를 유도 했다. T_H17 차별화 조건 셀에 비해, T_HGM 상태 하에서 분화 하는 셀에 포함 된 IL 17 표현 인구;의 배경 수준 그러나, il17 유전자 발현의 정량 (그림 2A)에 의해 감지 되지 않습니다.

흥.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI 1640	Biowest	L0500-500
FBS 열 비활성화	염소자리	FBS-HI-12A
페니실린-스트렙토마이신	Gibco	15140122
10x PBS	1st Base	BUF-2040-10	멸균수에서 1x PBS로 희석
EDTA	1st Base	BUF-1053-100ml-pH8.0
10x ACK 버퍼	Biolegend	420301	멸균수에 희석
strainer	SPL Life Sciences	93070
CD4 microbeads	Miltenyi Biotec	130-049-201
2-Mercaptoethanol	Sigma	M7522
LScolumn	Miltenyi Biotec	130-042-401
마그네틱 스탠드	Miltenyi Biotec	130-042-303
1 mL 주사기	Terumo	SS+01T
원심분리기	Eppendorf	Eppendorf 5810R
Sony SY3200 세포 분류기	Sony	Sony SY3200 세포 분류기
50 mL 코니컬 원심분리기	튜브, Greiner Bio-One	210261
15 mL 코니컬 원심분리기 튜브	Greiner Bio-One	188271
FACS 튜브	Corning	352054
24웰 세포 배양 플레이트	Greiner Bio-One	662160
안티 마우스 CD4 PerCP-eFluor 710	eBioscience	46-0041-82
PE 복합 안티 마우스 CD25 (IL-2Ra, p55)	eBioscience	12-0251-82
안티 휴먼/마우스 CD44 APC	eBioscience	17-0441-82
안티 마우스 CD62L FITC	eBioscience	11-0621-85
Neubauer 개선된 계수 챔버	Marienfeld	640010
Hyclone Trypan Blue Solution	GE healthcare Life Sciences	SV30084.01
현미경		Nikon Nikon Elipse TS100
정제  안티 마우스 CD3e  항체	Biolegend	100314
정제된 햄스터 안티-마우스 CD28	BD Biosciences	553295
정제된 쥐  안티 마우스 IFNγ	eBioscience	16-7312-85
정제 항마우스 IL-4 항체	Biolegend	504102
재조합 마우스 IL-7 단백질	R& D 시스템	407-ML
재조합 인간 TGF-베타	R& D 시스템	240-B-010
PMA	Merck Millipore	19-144
Ionomycin	Sigma	I0634
GolgiPlug 단백질 수송 억제제	BD Biosciences	51-2301KZ
세포 내 고정 및 투과화 완충액 세트	eBioscience	88-8824-00
안티 마우스 GM-CSF PE	eBioscience	12-7331-82
FITC 안티 마우스 IL-17A	Biolegend	506908
APC 안티 마우스 IFN-gamma	Biolegend	505810
GO Taq qPCR 마스터 믹스	Promega	A6002
마우스 GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!	invitrogen	88-7334-88
마우스 IL-17A unouted ELISA	invitrogen	88-7371-22

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