우리는 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 및 NMR 기반 지질 바인딩 전통과 confocal 라이브 셀 현미경 이미징를 포함 하는 necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 방법 보고.
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방법 논문
Necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 특성
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Necroptosis는 단백질 키 니 아 제 3 (RIPK3), phosphorylates 및 혼합된 계보 니 같은 도메인 pseudokinase, MLKL, 파열 또는 permeabilize 원형질 막 활성화는 상호 작용 하는 수용 체의 활성화에 의해 트리거되는 프로그램된 한 세포 죽음 통로 . Necroptosis 면역, 감염 및 심장 혈관 질환, 뇌졸중, neurodegeneration, 그리고 암 등 여러 병 리와 관련 된 염증 통로 이다. 여기, 우리는 necroptosis에 플라즈마 막 파열의 사형 집행으로 MLKL 특성을 사용할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 우리 전통과 공초점 형광 현미경 검사 법, 함께 라이브 셀 이미징 사용 하 여 셀에 함께 계시는 플라즈마는 cytosol에서 MLKL의 재배포 전자 현미경을 사용 하 여 고정된 셀에 necroptosis의 과정을 시각화 원형질 막에 큰 구멍의 유도 전에 막. 핵 자기 공명 (NMR) 분석 생체 외에서 지질을 사용 하 여 necroptosis MLKL 중재의 putative 변조기를 식별 하는 선물이. 이 방법에 따라, 우리 됨으로 양적 지질 바인딩 환경과 phosphatidyl-이노 시 톨 인산 염 (PIPs) MLKL의 원형질 막 지정 하 고 necroptosis에 permeabilization에 필요한 중요 한 바인더.
서론
Necroptosis의 유전자 구성 요소를 식별 생리학과 질병1,2,3,,45necroptosis의 의미를 테스트 동물 모델의 사용을 촉진 했다. 녹아웃 쥐에 RIPK3 또는 MLKL의 제안 하는 necroptosis는 생활3,6에 대 한 필수적인 개발 및 성인 항상성에서 최소한의 의미를 했다. 또한, 특정 종 동물7,8necroptosis의 비 본질적인 역할을 지 원하는 RIPK3 또는 MLK....
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프로토콜
1. 복제 및 셀 라인 생성
- PCR 증폭 NBB 지역 해당 아미노산 잔류물 1-140 (NBB140), 인간 MLKL cDNA에서에 대 한 프레임 표준 제한 효소 기반 복제 oligomerization 도메인 2 x FK506 의무적인 단백질 (2xFKBP 또는 2xFV)와 금성 형광에 하 단백질에 Doxycycline (Dox)-NBB140를 유도할 수 있는 retroviral 벡터 pRetroX-TRE3G-2xFV-금성 (표 1, 그림 1A-B).
- 기본 mlkl또는 ripk3-/- mlkl-/- -/- 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) 과도 transfection SV40 큰 항 원과 녹색 실험실에서 사용할 수 있는 각 생쥐에서 얻은 불멸 플라스 미드를 표현합니다. ~ 1-2에서 불멸 하 게 셀을 선택, 주 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린과 스, 1mm 나트륨 pyruvate, 표준 조직에서 37 ° C, 5% CO2 에서 불필요 한 아미노산 보충 DMEM에 유지 하 고 문화 인큐베이터입니다.
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결과
라이브 셀에서 레 귤 레이트 된 necroptosis 실행 시각화 하는 최소한의 잘린된 MLKL 구문, NBB140의 유도할 수 있는 표현을 통해 가능 했습니다-2xFV-금성. 이 구조 원형질 막 permeabilization 유도 하는 기능을 유지 하 고 FKBP 카세트 (2xFV)의 oligomerization Dim 유도 통해 활성화 됩니다. 우리는 관찰 하 고 라이브 셀 현미경 이미징, 모니터링 운동 (5 분 마다) 셀 스며들 지 않는 녹색 형광 DNA 바인딩 염료 (그림 6A)의 이해에 의해 necroptosis 계량. 유도할 수 있는이 시스템은 매우 강력 하 고, 그리고 mlkl-/- MEFs의 완전 한 necroptosis ~ 1 h NBB140을 표현 하는 Dox preincubated 셀의 oli.......
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토론
우리는 우리가 MLKL 플라즈마 막 파열24의 putative 사형 집행으로 연루 결합 기술에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. MLKL이 중재 necroptosis 규제 규제 네트워크 해독, 뿐만 아니라 이러한 기술은 사용할 수 있습니다 하지 독립적으로 다른 적당 한 생물 학적 시스템의 특성. 실질적으로 말하자면, 이러한 기술은 매체-낮은 처리량 검색 도구입니다.
우리는 정기적으로 라이브 셀 이미징 NBB140의 사용-2xFV-금성-necroptosis, 그리고 mechanistically necroptosis mutagenesis 통해 및 작은 분자 화학을 사용 하 여 MLKL의 규정을 해 부를 다른 MLKL 구조에 의해 유도 된 중재 조사 합니다. 특히, 우리와 다른 그룹을 인간의 증명 및 인간에서 necroptosis 및 마우스 셀 라인 NBB의 최소한의 영역을 포함 하는 MLKL의 마우스 구조 중재 수 있습니다.......
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death 정량화 및 생세포 현미경 검사 | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15 N 염화암모늄 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (암모늄 염) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (암모늄 염) (18:1) | Avanti 극성 지질 | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR 또는 ZOOM | Essen BioScience, Inc. | 생세포 현미경 이미징 | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | 전자 현미경 | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | 이미징 분석 |
| FEI MAPS | , Thermo Fisher Scientific | , https://www.fei.com/software/maps/ | EM 분석 |
| TopSpin v3.2 | Bruker, BioSpin | http://www.bruker.com | NMR 데이터 수집 |
| , CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR 데이터 분석 | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | 컨포칼 현미경 |
참고문헌
- Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nat....
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재인쇄 및 허가
