절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

요약

이 프로토콜 인간의 치과 여 포에서 추출한 치아 줄기 세포의 변이 유전 공학에 설명 합니다. 적용된 비 바이러스 성 수정 전략 치료 줄기 세포 제품의 개선 위한 기초 될 수 있습니다.

초록

날짜 하려면, 서로 다른 발달 단계에서 여러 줄기 세포 유형 퇴행 성 질환의 치료에 대 한 초점에 있습니다. 그러나, 초기 대규모 세포 죽음 및 낮은 치료 효과 등의 특정 양상 그들의 광범위 한 임상 번역 손상. 유전 공학 이식 전에 줄기 세포의 줄기 세포 치료 효과 최적화 하는 유망한 방법으로 등장. 그러나, 안전 하 고 효율적인 유전자 전달 시스템은 여전히 부족 합니다. 따라서, 적당 한 방법의 개발 줄기 세포 기반 요법에서 현재의 과제를 해결 하는 접근 방식을 제공할 수 있습니다.

현재 프로토콜은 그들의 비 바이러스 성 유전자 조작 뿐만 아니라 추출 및 인간의 치과 여 포 줄기 세포 (hDFSCs)의 특성을 설명합니다. 출생 후 치과 여 포는 높은 확산 잠재력을 보유 하는 성인 multipotent 줄기 세포를 수확 한 유망 하 고 쉽게 접근할 수 있는 소스로 발표 했다. 설명된 격리 절차 영향 을된 지혜의 이빨에서 hDFSCs 수확 간단 하 고 신뢰할 수 있는 메서드를 제공 합니다. 또한이 프로토콜 구성 고립 된 세포의 줄기 세포 특성을 정의 하는 방법. HDFSCs의 유전 공학에 대 한 최적화 된 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 전략 세포 독성 효과 유발 하지 않고 사용 하면 매우 효율적인 예측에 관한 소개를 제공 됩니다. 이러한 작은 변환 레 귤 레이 터 제어 운명과 안정적인 게놈 통합의 위험 없이 줄기 세포의 행동 MicroRNAs 과도 셀 조작에 대 한 적합 한 후보자는. 따라서,이 프로토콜 최적화 그들의 치료 효능에 대 한 중요 한 될 수 있습니다 hDFSCs의 엔지니어링에 대 한 안전 하 고 효율적인 절차를 나타냅니다.

서론

인간의 치과 여 포 개발 치아^1,2를 둘러싼 느슨한 ectomesenchymally 파생 결합 조직 이다. Osteoclastogenesis 및 골 치아 분화 과정에 대 한 조정 하는 기능 옆에 있는이 조직 특히 periodontium^3,,45의 개발에 대 한 줄기와 조상 세포를 항만. 따라서, 치과 여 포는 인간 성인 줄기 세포^6,7을 수확 하 대체 소스로 간주 됩니다.

여러 연구 결과 인간의 치과 여 포 줄기 세포 (hDFSCs) osteoblasts, 인 대 섬유 아 세포, cementoblasts^8,,910 을 포함 한 치 주 혈통으로 차별화 할 수 있다 설명 했다 . 또한, 이러한 세포 mesen....

프로토콜

HDFSCs 부의 구강 및 악 안 면 성형 수술으로 스톡 대학 의료 센터에서 제공 하는 추출 된 사랑니의 치과 여 포에서 격리 됩니다. 동 및 서 면된 승인 모든 환자에서 얻은 했다. 이 연구는로 스톡 대학 (권한 No. 2017-0158)의 로컬 윤리 위원회에 의해 허가 했다.

1입니다. hDFSCs의 격리

참고: 세균 오염을 방지 하기 위해, 사랑니 해야 하지 추출 하기 전에 발생 될

1. 필요한 솔루션의 준비
   1. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 준비 / 페니실린-스-글루타민 (P-S-G) 솔루션: P-S-G 솔루션의 5 mL PBS의 495 mL 혼합. 4 ° c.에 50 mL의 aliquots를 저장
   2. HDFSC 문화 매체를 준비: 혼합 기저 매체의 445 mL 5 mL 항생제 에이전트와 소 태아 혈 청 (FBS) 50 mL와 함께. 4 ° c.에 게
   3. 콜라 종류 준비 솔루션 (30 mg/mL)을 재고: 콜라 유형 나 기저 매체의 10 mL에 1% 항생제 에이전트와 보충의 300 mg을 희석. 적극적으로 솔루션을 혼합. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션....

결과

여기, 우리 인간의 치과 여 포 조직에서 hDFSCs을 수확 하는 상세한 격리 명령을 제시. 일상적인 수술 동안 치과 여 포의 쉬운 접근으로 성체 줄기 세포의 추출에 대 한 유망한 근원 이다.

격리 된 hDFSCs MSCs¹³의 정의 대 한 설명 하는 모든 특성을 보였다. 사실, 셀 플라스틱 부착 했다 아래 문화 상태를 설명 하 고 표시 구와 같은 형태 (그림 1). 흐름 cytometric 분석 hDFSCs 등 CD29, CD44, CD73, CD90 CD105, CD45 CD117 했다 (그림 2)에 결 석 하는 동안 특정 표면 항 원의 패널을 표현 밝혔다. 또한, adipogenic, osteogenic 및 특.......

토론

성인 줄기 세포는 현재 여러 퇴행 성 질환의 치료에 대 한 집중에 있습니다. 특히, 뼈 골 수 (BM)-줄기 세포, 조 혈 줄기 세포 (HSCs)를 포함 하 여 파생 된 MSCs, 집중 임상 조사⁴⁷그리고. 그러나, BM 수확 기부 사이트에 통증을 일으키는 침략 절차 이며⁴⁸부작용 이어질 수 있습니다. 최근, 출생 후 치과 조직 줄기 세포에 대 한 소스를 쉽게 접근할 수 있는 고로 떠오르고 있다. 이 치과 줄기 세포는 모든 MSC 특성에 맞게 표시 되었고 BM 파생 된 줄기 세포⁴⁹높은 확산 능력을 보여주었다. 여기, 우리는 추출, 특성화 및 hDFSCs의 엔지니어링에 대 한 상세한 프로토콜을 제시.

이 조직 일반적으로 추출 하 고 의료 폐기물¹⁹로 처분 설명된 격리 절차의 영향 을된 지혜의 이빨, 인간의 치과.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마우스 anti human CD105 항체: Alexa Fluor 488	Bio-Rad	MCA1557A488	Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 negative control 항체: Alexa Fluor 488	Bio-Rad	MCA928A488	monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 항체	BD Biosciences	559883	Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ 동형 제어 항체	BD Biosciences	555751	Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 항체	BD Biosciences	550257	Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ 동형 제어 항체	BD Biosciences	555749	클론 MOPC-21, 단클론
PE-Cy7 마우스 Anti-Human CD117 항체	BD Biosciences	339217	클론 104D2, 단클론
PE-Cy7 마우스 IgG1, κ 이소타입 제어 항체	BD Biosciences	557872	클론 MOPC-21, 단클론
PerCP-Cy5.5 마우스 Anti-Human CD44 항체	BD Biosciences	560531	클론 G44-26, 단클론
PerCP-Cy5.5 마우스 IgG2b, κ 이소타입 제어 항체	BD Biosciences	558304	Clone 27-35, 단클론
PerCP-Cy5.5 마우스 Anti-Human CD90  항체	BD Biosciences	561557	Clone 5E10, 단클론
PerCP-Cy5.5 마우스 IgG1, κ 동종 제어 항체	BD Biosciences	55095	클론 MOPC-21, 단일 클론
V500 마우스 Anti-Human CD45 항체	BD Biosciences	560777	클론 HI30, 단일 클론
V500 마우스 IgG1, κ 이소타입 제어 항체	BD Biosciences	560787	Clone X40, monoclonal
FcR 차단 시약, human	Miltenyi Biotec	130-059-901
UltraPure EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575-020	0.5M, pH 8.0
Steritop	Merck Millipore		SCGPT05RE 0.22 µ m, 방사선 멸균, 폴리에테르설폰
BSA	시그마-알드리치	A7906
PFA	머크 밀리포어	1040051000
인간 중간엽 줄기세포 기능 식별 키트	R& D Systems	SC006
RNase 오염 제거 솔루션; RNaseZap RNase 오염 제거 솔루션	: Thermo Fisher Scientific	AM9780
Cy3 표지 전구체 miR; Cy3 염료 표지 Pre-miR 음성 대조군 #1	Thermo Fisher Scientific		AM17120 5 nmol
Pre-miR miRNA 전구체 음성 대조군 #1	Thermo Fisher Scientific		AM17110 5 nmol
양이온성 지질 기반 형질주입 시약; Lipofectamine 2000 형질주입 시약	Thermo Fisher Scientific	11668019
환원 혈청 배지; Opti-MEM I 감소 혈청 매체	Thermo Fisher Scientific	31985070
당나귀 항 염소 IgG (H + L) 교차 흡착 2 차 항체, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055	다클론
당나귀 항 마우스 IgG (H + L) 고도의 교차 흡착 2 차 항체, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21202	다클론
장착 매체; DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	조직학 장착 매체
ELYRA PS.1 LSM 780 컨포칼 현미경	Zeiss
BD FACS LSRII 유세포 분석기	BD Biosciences
BD FACSDiva 소프트웨어 6.1.2	BD Biosciences
ZEN2011 소프트웨어	Zeiss
Trypsin/EDTA 용액(0.05%/ 0.02%)	바이오크롬	L2143	, w/o: Ca2+, Mg2+
아민 반응성 염료; 라이브/데드&트레이드; 고정성 근적외선 데드 셀 염색 키트	Thermo Fisher Scientific	L10119
PBS (1x)	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH: 7.4; w/o: Ca 및 Mg
P-S-G (100x)	Thermo Fisher Scientific	10378016
기초 배지; Dulbecco's Modified Eagle 배지/영양 혼합물 F-12	Thermo Fisher Scientific	11039021
항생제, ZellShield	Biochrom	W 13-0050
FBS	Thermo Fisher Scientific	10500064
콜라겐분해효소 유형 I	Thermo Fisher Scientific	17100017
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
필터, Sterifix 주사기 필터 0.2 µ m	브라운	4099206
50  mL 코니컬 원심분리기 튜브	Sarstedt	62,547,254
15 mL 코니컬 원심분리기 튜브	Sarstedt	62,554,502
세포 배양 플라스크 75 cm2	Sarstedt	833,910,002
세포 배양 플라스크, 25 cm2	Sarstedt	833,911,002
동결 매체, Biofreeze	Biochrom	F 2270
Cryotubes	Thermo Fisher Scientific	377267	1.8 mL
트리판 블루 솔루션	Sigma-Aldrich	T8154	0.4 %
계수 챔버	Paul Marienfeld
국소 마취제, 자일로시틴(리도카인 염산염) 2%와 에피네프린(아드레날린) 0.001%	Mibe
NaCl 용액	브라운		0.9 %
Vicryl 포화, Vicryl rapide	Ethicon		3 - 0