Method Article

절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

DOI:

10.3791/58089

⸱

November 16th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜 인간의 치과 여 포에서 추출한 치아 줄기 세포의 변이 유전 공학에 설명 합니다. 적용된 비 바이러스 성 수정 전략 치료 줄기 세포 제품의 개선 위한 기초 될 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

날짜 하려면, 서로 다른 발달 단계에서 여러 줄기 세포 유형 퇴행 성 질환의 치료에 대 한 초점에 있습니다. 그러나, 초기 대규모 세포 죽음 및 낮은 치료 효과 등의 특정 양상 그들의 광범위 한 임상 번역 손상. 유전 공학 이식 전에 줄기 세포의 줄기 세포 치료 효과 최적화 하는 유망한 방법으로 등장. 그러나, 안전 하 고 효율적인 유전자 전달 시스템은 여전히 부족 합니다. 따라서, 적당 한 방법의 개발 줄기 세포 기반 요법에서 현재의 과제를 해결 하는 접근 방식을 제공할 수 있습니다.

현재 프로토콜은 그들의 비 바이러스 성 유전자 조작 뿐만 아니라 추출 및 인간의 치과 여 포 줄기 세포 (hDFSCs)의 특성을 설명합니다. 출생 후 치과 여 포는 높은 확산 잠재력을 보유 하는 성인 multipotent 줄기 세포를 수확 한 유망 하 고 쉽게 접근할 수 있는 소스로 발표 했다. 설명된 격리 절차 영향 을된 지혜의 이빨에서 hDFSCs 수확 간단 하 고 신뢰할 수 있는 메서드를 제공 합니다. 또한이 프로토콜 구성 고립 된 세포의 줄기 세포 특성을 정의 하는 방법. HDFSCs의 유전 공학에 대 한 최적화 된 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 전략 세포 독성 효과 유발 하지 않고 사용 하면 매우 효율적인 예측에 관한 소개를 제공 됩니다. 이러한 작은 변환 레 귤 레이 터 제어 운명과 안정적인 게놈 통합의 위험 없이 줄기 세포의 행동 MicroRNAs 과도 셀 조작에 대 한 적합 한 후보자는. 따라서,이 프로토콜 최적화 그들의 치료 효능에 대 한 중요 한 될 수 있습니다 hDFSCs의 엔지니어링에 대 한 안전 하 고 효율적인 절차를 나타냅니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간의 치과 여 포 개발 치아1,2를 둘러싼 느슨한 ectomesenchymally 파생 결합 조직 이다. Osteoclastogenesis 및 골 치아 분화 과정에 대 한 조정 하는 기능 옆에 있는이 조직 특히 periodontium3,,45의 개발에 대 한 줄기와 조상 세포를 항만. 따라서, 치과 여 포는 인간 성인 줄기 세포6,7을 수확 하 대체 소스로 간주 됩니다.

여러 연구 결과 인간의 치과 여 포 줄기 세포 (hDFSCs) osteoblasts, 인 대 섬유 아 세포, cementoblasts8,,910 을 포함 한 치 주 혈통으로 차별화 할 수 있다 설명 했다 . 또한, 이러한 세포 mesenchymal stromal 세포 (MSCs)의 자기 갱신 용량, 플라스틱 준수, 표현의 특정 표면 마커를 포함 하 여 모든 특성에 맞게 표시 했다 (예:, CD73, CD90, CD105)으로 osteogenic 뿐만 adipogenic 및 chondrogenic 분화 잠재적인11,,1213. 다른 연구는 또한 hDFSCs2,,1415,16,,1718의 신경 감 별 법 잠재력을 계시 했다.

그들의 유망한 속성 및 쉬운 접근, hDFSCs 최근 조직 공학19,,2021관련 되었다. 첫 번째 연구는 치 주 뼈 생성에 DFSCs의 잠재력에 집중 하 고 치아 뿌리19,22,23,,2425,26, 27,,2829,30. HDFSCs의 neurogenic 기능의 지식, 신경 퇴행 성 질환에 대 한 잠재적인 치료로 그들의 응용 프로그램은 이후 조사31,,3233. HDFSCs 또한에 중요성을 얻고 있다 고 다른 조직 (예: 각 막 상피)34,35의 재생. HDFSC의 치료 잠재력은 그들의 paracrine 활동에 뿐만 아니라 그들의 직접적인 감 별 법 잠재력에만 근거 하지 않는다. 최근, hDFSCs 보였다 매트릭스 metalloproteinases (MMPs), 인슐린과 같은 성장 인자 (IGF), 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF) hepatocyte 성장 등 생리 활성 요인의 분 비 인수 (HGF), 신생, immunomodulation, 개장 하는 엑스트라 세포 매트릭스 및 회복 과정36에 대 한 중요 한 역할입니다.

그러나, 줄기 세포 치료의 광범위 한 임상 번역은 여전히 대규모 초기 세포 죽음 및 낮은 도움이 줄기 세포 효과37,38등 여러 문제에 의해 손상 된다. 유전 공학 이러한 과제를 해결 하기 위해 유망 전략을 제공 하 고 따라서 매우 줄기 세포38,,3940의 치료 효능을 강화할 수 있다. 변이 세포 조작, microRNAs (미르)는 적합 한 후보자, 이러한 작은 변환 레 귤 레이 터 제어 운명과 안정적인 게놈 통합41,42, 의 위험 없이 줄기 세포의 행동으로 43. 날짜, 여러 가지 유익한 미르 확인 된 줄기 세포 증식, 생존, 유도, paracrine 활동 뿐만 아니라 여러 계보44로 그들의 차별화 홍보. 예를 들어, 미르 133a 설계 MSCs 수정 되지 않은 MSCs45에 비해 향상 된 심장 기능의 결과로 infarcted 쥐 마음에 증가 생존 및 engraftment를 보여주었다. 마찬가지로, 미르-146a overexpressing MSCs 분 비 허 혈 성 조직46에서 향상 된 치료 효율 주도 차례에 VEGF의 더 높은 금액을 표시 했다.

이 원고는 선택적 추출 및 hDFSCs의 유전 공학에 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 목적을 위해 우리 인간의 치과 여 포의 수확과 효소 소화 뿐만 아니라 hDFSCs의 후속 격리를 설명합니다. 고립 된 세포의 성격을 나타내기 위하여 MSC 속성의 확인에 대 한 중요 한 지침13세포 치료 대 한 국제 사회의 지침에 따라 포함 되었습니다. 또한, 우리는 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 전략과 transfection 효율 및 세포 독성 평가 적용 하 여 미르 수정 hDFSCs의 생성에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDFSCs 부의 구강 및 악 안 면 성형 수술으로 스톡 대학 의료 센터에서 제공 하는 추출 된 사랑니의 치과 여 포에서 격리 됩니다. 동 및 서 면된 승인 모든 환자에서 얻은 했다. 이 연구는로 스톡 대학 (권한 No. 2017-0158)의 로컬 윤리 위원회에 의해 허가 했다.

1입니다. hDFSCs의 격리

참고: 세균 오염을 방지 하기 위해, 사랑니 해야 하지 추출 하기 전에 발생 될

  1. 필요한 솔루션의 준비
    1. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 준비 / 페니실린-스-글루타민 (P-S-G) 솔루션: P-S-G 솔루션의 5 mL PBS의 495 mL 혼합. 4 ° c.에 50 mL의 aliquots를 저장
    2. HDFSC 문화 매체를 준비: 혼합 기저 매체의 445 mL 5 mL 항생제 에이전트와 소 태아 혈 청 (FBS) 50 mL와 함께. 4 ° c.에 게
    3. 콜라 종류 준비 솔루션 (30 mg/mL)을 재고: 콜라 유형 나 기저 매체의 10 mL에 1% 항생제 에이전트와 보충의 300 mg을 희석. 적극적으로 솔루션을 혼합. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다. 콜라의 500 µ L의 스토어 aliquots 유형 I-20 ° c.에 재고 솔루션
    4. Dispase II 재고 솔루션 (40 mg/mL) 준비: 1% 항생제 에이전트 보충 기저 매체의 10 mL에 Dispase II의 40 mg을 희석. 적극적으로 솔루션을 혼합. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다. -20 ° c.에 Dispase II 재고 솔루션의 500 µ L의 aliquots를 저장
  2. 외과 절차
    1. 충분 한 양의 주사 (최대: 2 mL) 로컬 마 취의.
    2. 만들고 3 면 mucoperiosteal 플랩 발생 합니다. 언어 플랩 높이 필요 하지 않습니다.
    3. Periosteal 엘리베이터가 언어 측면을 보호 합니다.
    4. 부드럽게 밀 볼 및 원심 뼈와 함께 라운드 하드 금속 버.
    5. Periosteal 엘리베이터와 뿌리의 조직을 풉니다. 조심 스럽게 후부 (제 3-모 랄) 집게와 완전 한 치아 (세균)와 왕관을 철수 하 여 여 포 (및 뿌리) 제거.
    6. Debride 하 고 철저 하 게 NaCl 용액으로 소켓을 관개.
    7. Mucoperiosteal 플랩을 vicryl 봉합 ( 재료의 표참조) 바꿉니다.
    8. 구강에서 치아 뿌리를 제거 하 고 PBS/P-S-G 솔루션 50 mL의 약 수에 그들을 배치.
      참고: 샘플 추가 처리까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  3. 치아 뿌리의 효소 소화
    1. 미리 따뜻한 hDFSC 문화 매체와 실내 온도 (RT) PBS/P-S-G 솔루션.
    2. 나 및 Dispase II 재고 솔루션 각 콜라 종류의 한 약 수를 녹여. 각 콜라의 500 µ L 타입 I과 기저 중간 포함 1% 항생제 에이전트의 4 ml Dispase II 재고 솔루션을 추가 하 여 3 mg/mL 콜라 종류의 소화 솔루션 어 4 mg/mL Dispase II 준비.
    3. 멸 균 페 트리 접시에 추출 된 뿌리를 놓고 추출 된 조직 씻어 PBS/P-S-G 솔루션의 10 mL를 추가 합니다. 이 세척 단계를 두 번 반복 합니다.
    4. 약 1 m m x 1 m m PBS/P-S-G 솔루션의 10 mL를 포함 하는 페 트리 접시 내 살 균 메스의 조각에 추출 된 뿌리를 말하다.
    5. 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브로 페 트리 접시에서 다진된 조직 및 PBS/P-S-G 솔루션을 전송. PBS/P-S-G 솔루션의 10 mL를 페 트리 접시를 세척 하 고 동일한 관으로 솔루션을 전송.
    6. 원뿔 원심 분리기 튜브 RT에서 353 x g 에서 10 분 원심 하 고 삭제는 상쾌한.
    7. 수송과 조직에 소화 솔루션의 5 mL를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 솔루션 및 조직. 떨고 인큐베이터에 2 h 37 ° C, 5% CO2 혼합물을 품 어.
    8. 원심 분리기에서 실시간 삭제는 상쾌한 10 분 353 x g 세포/조직 정지를 소화 하 고 다시 hDFSC 문화 매체의 6 mL에서 얻은 펠 릿을 일시 중단.
    9. 25 cm2 종자 세포 현 탁 액 문화 플라스 크 셀 하 고 37 ° C, 5% CO2 와 20% O2에 셀을 품 어.
      참고: 조직을 완전히 소화 되지 않습니다 경우 나머지 조직 셀 뿐만 아니라 문화 플라스 크에 전송.
    10. 중간 신중 하 게 24 시간 후 바꿀 셀 시드. 나중에 매체 confluency까지 3 일 마다 변경 합니다.
      참고: HDFSCs는 플라스틱 부착 24 h 셀 시드 후 고 단순히 매체를 변경 하 여 비 부착 한 세포 및 혈액 구성 요소에서 분리 될 수 있다.
  4. 셀 수확
    1. 미리 따뜻하게 hDFSC 문화 매체, PBS/P-S-G 솔루션 및 실시간 트립 신/Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션
    2. 문화 플라스 크에서 상쾌한 삭제 하 고 PBS/P-S-G 솔루션의 5 mL confluent 셀을 씻어.
    3. 문화 플라스 크를 1 mL의 트립 신/EDTA 솔루션을 추가 하 고 37 ° c.에 3 분 동안 품 어 문화 플라스 크를 hDFSC 문화 매체의 3 mL를 추가 하 여 소화 프로세스를 중지 합니다.
    4. 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 실시간 삭제는 상쾌한에 353 x g 에서 10 분 동안 현 탁 액을 원심 hDFSC 문화 매체의 적절 한 금액에 펠 릿을 다시 일시 중단.
    5. 셀: 부드럽게 Trypan 블루 솔루션의 10 µ L 10 µ L 세포 현 탁 액의 혼합. 세 실로 10 µ L을 적용 하 고 hDFSC 셀 금액 계산.

2입니다. hDFSCs의 특성

  1. Immunophenotyping
    1. 셀의 흐름 cytometric 분석에 대 한 준비
      1. 필요한 솔루션의 준비
        1. PBS/EDTA (2mm) 준비: 996 mL PBS의 EDTA (0.5 M)의 4 mL와 혼합.
        2. 얼룩 버퍼 준비: BSA의 5 g 995 mL PBS/EDTA (2 mM)의 혼합. 0.22 μ m 필터 단위를 사용 하 여 솔루션을 필터링 하 고 사용까지 4 ° C에서 저장 합니다.
        3. 준비 paraformaldehyde (PFA) 재고 솔루션 (4%): 4 g PFA PBS의 100 ml에서를 희석 하 고 열 80 ° c 솔루션 솔루션을 혼합 하 고 pH 값 7.3 조정. 약 수 사용까지 해당 금액 (1.5 mL)에-20 ° C에서 저장소 PFA 솔루션을 얻을.
          주의: PFA 연기 독성 때문에, 통풍이 증기 두건에서 PFA 솔루션을 준비 합니다.
      2. 셀 (1.4)를 수확, 후 1.5 mL microcentrifuge 튜브 14 5 x 104 의 세포 샘플을 전송 합니다. 300 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 현 탁 액을 원심 폐기는 상쾌한.
        참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다. 달리 명시 하지 않는 한 셀 및 얼음에 시 약을 계속.
      3. 다시 셀 얼룩 버퍼 (4 ° C)의 특정 금액을 일시 중단 하 고 FcR 시 (4 ° C)을 차단 하는 표 1에 표시 된 대로 추가 합니다.
      4. 표 1에 표시 된 대로 각 샘플의 안쪽에 다음 항 체를 추가: Allophycocyanin (APC) 마우스 안티 인간 CD29; APC 마우스 IgG1 κ isotype 제어; Peridinin-엽록소 단백질 (PerCP)-Cyanine5.5 마우스 안티 인간 CD44; PerCP-Cyanine5.5 마우스 IgG2b κ isotype 제어; V500 마우스 안티 인간 CD45; V500 마우스 IgG1 κ isotype 제어; Phycoerythrin (PE) 마우스 안티 인간 CD73; PE 마우스 IgG1 κ isotype 제어; PerCP-Cyanine5.5 마우스 안티 인간 CD90; PerCP-Cyanine5.5 마우스 IgG1 κ isotype 제어; 반대로 인간의 CD105 마우스: 알 렉 사 Fluor (AF) 488; IgG1 부정적인 제어 마우스: AF488; PE-Cyanine7 마우스 안티 인간 CD117; PE-Cyanine7 마우스 IgG1, κ isotype 제어 합니다. 각 샘플에 항 체를 추가한 후 항 체 아래로 회전 하 고 부드럽게 혼합. 4 ° c.에서 10 분에 대 한 솔루션을 품 어
      5. 1 mL의 PBS (4 ° C)를 추가 하 고 샘플을 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 폐기는 상쾌한.
      6. 다시 100 µ L의 PBS (4 ° C)에 있는 셀을 일시 중단 하 고 PFA (4%)의 33 µ L를 추가 합니다. 솔루션을 믹스와 흐름 cytometric 분석까지 얼음에 또는 4 ° C에서 저장 합니다.
    2. 셀의 흐름 cytometric 측정
      참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다. 측정까지 얼음에 셀을 계속.
      1. 표현의 표면 항 원 검사, 튜브 흐름 cytometric 측정을 위한 적합 한 샘플을 전송.
      2. 적어도 2 × 104 이벤트 흐름 cytometer를 사용 하 여 측정 합니다. 그림2에서와 같이 분석.
  2. HDFSCs multipotent 차별화 가능성
    1. 상업적으로 이용 가능한 인간 중간 엽 줄기 세포 기능 식별 키트를 사용 하 여 adipogenic, osteogenic 및 hDFSCs의 chondrogenic 감 별 법 잠재력을 확인 하. 적용 지방산 의무적인 단백질 4 (FABP4)의 얼룩에 대 한 당나귀 안티 염소 AF488 이차 항 체와 aggrecan osteocalcin의 얼룩에 대 한 당나귀 반대로 마우스 AF488 이차 항 체에 뿐만 아니라. 핵의 얼룩, 설치 매체와 함께 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 사용 합니다.
      참고: 현미경 분석에 대 한 부정적인 컨트롤로 기본 항 체 없이 샘플을 준비 합니다.
    2. 레이저 공초점 현미경을 스캐닝 하 여 단백질의 표현 분석. 현미경 설정: 기름 침수;와 40 x 목표 (AF488)에 대 한 여기 레이저 488 nm 및 405 nm (DAPI)에 대 한.

3입니다. hDFSCs의 transfection

  1. 셀 (1.4) 수확 후 24-잘 셀 문화 접시 transfection 이전 24 시간에 hDFSCs 씨.
    참고: 잘 당 약 4 x 104 셀은 셀 밀도 시작. 세포는 transfection 요일에 ~ 80% 합류가 되어야만 합니다.
    참고: 종자 하나 추가 셀 샘플 제어 흐름 cytometric 분석에 대 한.
  2. Transfection 복합물의 준비
    참고: 오염을 방지 하기 위해 RNases에서, 직접 transfection 단지 RNase 오염 제거 솔루션을 사용 하 여 준비 하기 전에 작업 영역을 청소. RNase 소재 및 솔루션을 사용 합니다.
    참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다.
    1. 준비 하는 미르 재고 솔루션 (50 µ M): 다시 Cy3 표시 전조 미르 (5 nmol) 100 µ L nuclease 무료 물에서 중단. 약 수를 취득 해당 금액 (5 µ L) 미르 재고 솔루션 저장소-20 ° C에서 어둠 속에서 사용까지.
    2. 미르 (50 µ M 미르 재고 솔루션의 0.8 µ L) 감소 된 혈 청 매체의 66.7 µ L에서의 40 pmol 희석. 부드럽게 솔루션 혼합
    3. 감소 된 혈 청 매체의 66.7 µ L에서 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 시 약의 0.67 µ L를 희석. 솔루션을 부드럽게 혼합 하 고 실시간에 5 분 동안 품 어
    4. 부 화, 후 미리 희석된 미르를 미리 희석된 transfection 시 약을 추가 합니다. 솔루션을 부드럽게 혼합 하 고 실시간에 15 분 동안 품 어
  3. 직접 셀에 문화 매체에 dropwise 준비 transfection 단지를 추가 합니다. 24 잘 셀 문화 접시와 락으로 부드럽게 혼합.
  4. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 24 h에 대 한 20% O2 에 셀을 품 어.

4입니다. Transfection 분석

참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다.

  1. 세포 transfection 후 수확
    참고: 모든 셀 솔루션 같은 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 하나의 샘플을 수집 합니다.
    1. transfection, 후 24 h 각각 원심 분리기 튜브 샘플의 상쾌한을 수집 합니다.
    2. 셀 1 mL의 PBS로 세척, 각각 원심 분리기 관으로 PBS를 전송 및 추가 500 µ L 트립 신/EDTA (RT) 셀에. 37 ° c.에 3 분에 대 한 솔루션을 품 어
    3. 문화 매체 (RT)의 1 mL을 추가 하 여 셀을 각각 원심 분리기 관으로 전송 솔루션 trypsinization를 중지 합니다. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기 세포
      참고: 이 시간에서 달리 명시 하지 않는 한 셀 및 얼음에 시 약 유지.
  2. 셀의 흐름 cytometric 분석에 대 한 준비
    1. 폐기는 상쾌한. 다시 셀 얼룩 버퍼 (4 ° C) 및 전송 셀 솔루션 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 100 µ L 일시 중단 합니다.
    2. 라이브와 죽은 세포를 구별 하기 위해 샘플에 아민 반응성 염료의 0.5 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 솔루션 및 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어
    3. 셀을 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기 1 mL의 PBS (4 ° C)를 추가 폐기는 상쾌한.
    4. 다시 100 µ L의 PBS (4 ° C)에 있는 셀을 일시 중단 하 고 PFA (4%)의 33 µ L를 추가 합니다. 솔루션을 믹스와 흐름 cytometric 분석까지 얼음에 또는 4 ° C에서 저장 합니다.
  3. 셀의 흐름 cytometric 측정
    참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다. 측정까지 얼음에 셀을 계속.
    1. 흐름 cytometric 측정을 위한 적합 한 튜브 샘플을 전송 합니다.
    2. 세포 생존 능력 및 미르 통풍 관 효율 교류 cytometer를 사용 하 여 검사 합니다. 적어도 2 × 104 이벤트를 측정 합니다. 그림 4에 묘사 된 제어 전략을 사용 합니다.
      참고: 부정적인 통제로 untransfected 세포를 사용 하 여 Cy3 긍정적인 셀 게이팅 정렬 하 고 계산 transfection에 기인한 세포 죽음.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리 인간의 치과 여 포 조직에서 hDFSCs을 수확 하는 상세한 격리 명령을 제시. 일상적인 수술 동안 치과 여 포의 쉬운 접근으로 성체 줄기 세포의 추출에 대 한 유망한 근원 이다.

격리 된 hDFSCs MSCs13의 정의 대 한 설명 하는 모든 특성을 보였다. 사실, 셀 플라스틱 부착 했다 아래 문화 상태를 설명 하 고 표시 구와 같은 형태 (그림 1). 흐름 cytometric 분석 hDFSCs 등 CD29, CD44, CD73, CD90 CD105, CD45 CD117 했다 (그림 2)에 결 석 하는 동안 특정 표면 항 원의 패널을 표현 밝혔다. 또한, adipogenic, osteogenic 및 특...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

성인 줄기 세포는 현재 여러 퇴행 성 질환의 치료에 대 한 집중에 있습니다. 특히, 뼈 골 수 (BM)-줄기 세포, 조 혈 줄기 세포 (HSCs)를 포함 하 여 파생 된 MSCs, 집중 임상 조사47그리고. 그러나, BM 수확 기부 사이트에 통증을 일으키는 침략 절차 이며48부작용 이어질 수 있습니다. 최근, 출생 후 치과 조직 줄기 세포에 대 한 소스를 쉽게 접근할 수 있는 고로 떠오르고 있다. 이 치과 줄기 세포는 모든 MSC 특성에 맞게 표시 되었고 BM 파생 된 줄기 세포49높은 확산 능력을 보여주었다. 여기, 우리는 추출, 특성화 및 hDFSCs의 엔지니어링에 대 한 상세한 프로토콜을 제시.

이 조직 일반적으로 추출 하 고 의료 폐기물19로 처분 설명된 격리 절차의 영향 을된 지혜의 이빨, 인간의 치과...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품의 젖은 기초 (2016-11)로 스톡 대학 의료 센터 (889018)와 FORUN 프로그램에 의해 지원 되었다. 또한, 오후 R.D. BMBF (VIP + 00240)에 의해 지원 됩니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
마우스 anti human CD105 항체: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA1557A488Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 negative control 항체: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA928A488monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 항체BD Biosciences559883Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ 동형 제어 항체BD Biosciences555751Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 항체BD Biosciences550257Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ 동형 제어 항체BD Biosciences555749클론 MOPC-21, 단클론
PE-Cy7 마우스 Anti-Human CD117 항체BD Biosciences339217클론 104D2, 단클론
PE-Cy7 마우스 IgG1, κ 이소타입 제어 항체BD Biosciences557872클론 MOPC-21, 단클론
PerCP-Cy5.5 마우스 Anti-Human CD44 항체BD Biosciences560531클론 G44-26, 단클론
PerCP-Cy5.5 마우스 IgG2b, κ 이소타입 제어 항체BD Biosciences558304Clone 27-35, 단클론
PerCP-Cy5.5 마우스 Anti-Human CD90  항체BD Biosciences561557Clone 5E10, 단클론
PerCP-Cy5.5 마우스 IgG1, κ 동종 제어 항체BD Biosciences55095클론 MOPC-21, 단일 클론
V500 마우스 Anti-Human CD45 항체BD Biosciences560777클론 HI30, 단일 클론
V500 마우스 IgG1, κ 이소타입 제어 항체BD Biosciences560787Clone X40, monoclonal
FcR 차단 시약, humanMiltenyi Biotec130-059-901
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific15575-0200.5M, pH 8.0
SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE 0.22 µ m, 방사선 멸균, 폴리에테르설폰
BSA시그마-알드리치A7906
PFA머크 밀리포어1040051000
인간 중간엽 줄기세포 기능 식별 키트R& D SystemsSC006
RNase 오염 제거 솔루션; RNaseZap RNase 오염 제거 솔루션: Thermo Fisher ScientificAM9780
Cy3 표지 전구체 miR; Cy3 염료 표지 Pre-miR 음성 대조군 #1Thermo Fisher ScientificAM17120 5 nmol
Pre-miR miRNA 전구체 음성 대조군 #1Thermo Fisher ScientificAM17110 5 nmol
양이온성 지질 기반 형질주입 시약; Lipofectamine 2000 형질주입 시약Thermo Fisher Scientific11668019
환원 혈청 배지; Opti-MEM I 감소 혈청 매체Thermo Fisher Scientific31985070
당나귀 항 염소 IgG (H + L) 교차 흡착 2 차 항체, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11055다클론
당나귀 항 마우스 IgG (H + L) 고도의 교차 흡착 2 차 항체, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21202다클론
장착 매체; DAPISigma-AldrichF6057-20ML조직학 장착 매체
ELYRA PS.1 LSM 780 컨포칼 현미경Zeiss
BD FACS LSRII 유세포 분석기BD Biosciences
BD FACSDiva 소프트웨어 6.1.2BD Biosciences
ZEN2011 소프트웨어Zeiss
Trypsin/EDTA 용액(0.05%/ 0.02%)바이오크롬L2143, w/o: Ca2+, Mg2+
아민 반응성 염료; 라이브/데드&트레이드; 고정성 근적외선 데드 셀 염색 키트Thermo Fisher ScientificL10119
PBS (1x)Thermo Fisher Scientific10010023pH: 7.4; w/o: Ca 및 Mg
P-S-G (100x)Thermo Fisher Scientific10378016
기초 배지; Dulbecco's Modified Eagle 배지/영양 혼합물 F-12Thermo Fisher Scientific11039021
항생제, ZellShieldBiochromW 13-0050
FBSThermo Fisher Scientific10500064
콜라겐분해효소 유형 IThermo Fisher Scientific17100017
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
필터, Sterifix 주사기 필터 0.2 µ m브라운4099206
50  mL 코니컬 원심분리기 튜브Sarstedt62,547,254
15 mL 코니컬 원심분리기 튜브Sarstedt62,554,502
세포 배양 플라스크 75 cm2Sarstedt833,910,002
세포 배양 플라스크, 25 cm2Sarstedt833,911,002
동결 매체, BiofreezeBiochromF 2270
CryotubesThermo Fisher Scientific3772671.8 mL
트리판 블루 솔루션Sigma-AldrichT81540.4 %
계수 챔버Paul Marienfeld
국소 마취제, 자일로시틴(리도카인 염산염) 2%와 에피네프린(아드레날린) 0.001%Mibe
NaCl 용액브라운0.9 %
Vicryl 포화, Vicryl rapideEthicon3 - 0
를 사용한 Fluoroshield PBS의

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