살충제 내성 집 파리, 파리 자리 부채 에 Carboxylesterases의 기능 특성

Summary

여기, 우리 제시 집 플라이 carboxylesterase 단백질에서 생체 외에서 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템으로 생산 하 고 나중 기능 metabolizing permethrin에 그들의 역할을, 특성화를 프로토콜 pyrethroid 부여 셀 기반 MTT 분석 결과 및 체 외에서 대사 연구를 실시 하 여 저항.

Abstract

Carboxylesterase 중재 대사는 다양 한 곤충의 살충제 저항에 중요 한 역할을 생각입니다. 몇몇 carboxylesterase 유전자 살충제 저항을 부여에 있는 그들의 역할 탐구 될 남아 반면 내성 집 비행 긴장에서 최대 통제 발견 됐다. 여기, 우리는 carboxylesterases의 기능 특성에 대 한 프로토콜 설계 되었습니다. 3 예제 실험 제공 됩니다: (1) 식과 잠재 중재 곤충 Spodoptera frugiperda (Sf9) 셀 식 시스템을 통해 carboxylesterase 단백질의 격리 (2) 셀 기반 MTT (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드) 세포 독성 분석 결과 다른 permethrin 치료; 곤충 세포의 허용 오차를 측정 하 (3) 생체 외에서 대사 연구를 permethrin로 carboxylesterases의 대사 기능을 탐구 하 고. MdαE7 저항 하는 집에서 복제는 carboxylesterase 유전자 변형 ALHF 조종 하 고 Sf9 세포 감염에 대 한 재조합 잠재를 구성 하는 데 사용. 셀 viabilities 다른 permethrin 치료에 대 한 MTT 분석 결과와 측정 되었다. Permethrin 제어 그룹 (고양이 재조합 잠재 감염 세포와 GFP 재조합 잠재 감염 세포)의 그들과 비교 된 실험 그룹 (MdαE7-재조합 잠재 감염 세포)의 향상 된 셀 허용 치료는 살충제, 화학 손상에서 세포를 보호 함으로써 metabolizing에서 MdαE7의 기능을 제안 했다. 게다가, carboxylesterase 단백질 곤충 Sf9 세포에 표현 되었고 고립 생체 외에서 대사 연구를 실시. 우리의 결과 중요 한 생체 외에서 대사 효율을 MdαE7의 향해 permethrin, 직접 살충제를 metabolizing에서 carboxylesterases의 개입을 나타내는 표시를 따라서 집에서 살충제 저항을 부여 있습니다.

Introduction

살충제 저항은 현재 하우스 비행 제어 전세계^1,2의 주요 문제 이다. 살충제 저항 메커니즘을 결정 하는 노력이 문제의 더 나은 이해를 용이 하 게 하 고 따라서 새로운 전략을 효과적으로 방지 하거나 저항 개발³의 확산을 최소화를 제공 합니다. Carboxylesterases, 주요 해독 효소 중 하나로 격리 및 다양 한 곤충^4,,56에 살충제를 metabolizing에서 그들의 역할에 대 한 관심을 많이 받고 있다. 우리의 이전 연구는 집 파리에 여러 carboxylesterases를 발견 했다와 그들의 식 레벨만 constitutively 최대 저항 하는 ALHF 긴장에 규제 있었지만 또한 높은 유발된 수준 permethrin 치료^{7에 대 한에서 일 수 있다} . 그러나, 살충제를 metabolizing에서이 carboxylesterase 유전자의 기능 characterizations 탐험 남아 있다.

Protocol

1. 식 및 곤충 세포 잠재 중재 식 시스템 대상 단백질의 격리

1. 으로 집에서 파리에서 대상 단백질의 무뚝뚝한 끝난 PCR 제품을 복제.
   1. 녹색 형광 단백질 (GFP)의 PCR 뇌관과 집 플라이 MdαE7 유전자 그들의 순서 및 선택한 벡터 (표 1)의 특별 한 요구에 따라 디자인.
   2. 내, 교정 DNA 중 합 효소 및 단계 1.1.1에서에서 프라이 머를 사용 하 여 수행 (30 µ L의 반응 버퍼, 10mm dNTPs, DNA 중 합 효소의 1.5 µ L, 하우스 비행 템플릿 DNA, 앞으로 뇌관의 7.5 µ L의 6 µ L의 3 µ L 150 µ L PCR 반응 최종 볼륨 150 µ L 물으로 역 뇌관의 7.5 µ L). 30에 대 한 98 ° C에 PCR 반응 열 10 98 ° C의 35 주기 다음 s s, 53 ° C 30에 대 한 s, 및 60 72 ° C s, 그리고 2 분 동안 72 ° C에서 최종 확장).
      1. PCR 제품의 150 µ L로 1 %agarose 젤을 실행 합니다.
   3. 소비 세는 agarose에서 대상 DNA 조각을 선명 하 고 깨끗 한 메스로 젤: MdαE7 및 858 1317 혈압 혈압 GFP에 대 한. 상업적으로 사용 가능한 젤 추출 ....

Results

다른 permethrin 치료 (MTT assay)으로 세포 생존 능력

Permethrin의 세포 독성 MdαE7 재조합 잠재 감염 Sf9 셀 (실험 그룹)과 고양이 재조합 잠재 감염 (잠재 감염 키트에 의해 제공) 셀 (제어 그룹)에서 시험 되었다. 향상 된 셀 공차 세포를 강하게 표현 하는 MdαE7에 permethrin 살충제와 화학 손상에서 따라서 보호 셀이이 carboxylesterase의 대사 역할을 지원 합니다. 우리의 연구에서 다른 permethrin 농도 대 한 세포 생존 능력 (50, 100, 200 및 400 µ M) 이기 혼자 치료 하는 세포와 비교 하 여 계산 되었다. 우리의 결과 나타났다는 세포를 표현 하는 MdαE7의 생존 (86.00%에서 101.92%에 배열 되는) 상당히 높은 (그림 4B

Discussion

최근 수십 년간, 분리 식 시스템 널리 표현 하 고 많은 양의 단백질, 생화학 및 기능 확인 및 체 외에서효소의 특성화 되므로 격리 사용 되었습니다. 날짜 하려면, 대장균, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiae및 Spodoptera frugiperda 를 포함 하 여 여러 다른 모델 시스템은 재조합 형 단백질 표정, 그리고의 선택에 대 한 적응 되었습니다는 생체 외에서 시스템 관심된 단백질^22,23,,2425의 대규모 세대를 위해 결정적 이다. 우리의 연구에서 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템 집 비행 거리 carboxylesterases를 생성 하는 곤충 세포에 유사.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Q5 고충실도 DNA 중합효소	New England Biolabs inc.	M0491L
QIAquick 겔 추출 키트	QIAGEN	28704
pENTR/D-TOPO 클로닝 키트, ONE Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen by life technology	K240020	S.O.C 배지 및 범용 M13 염기서열 프라이머가 이 키트에 포함되었습니다.
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen by life technology	K210002
Gateway LR Clonase II BaculoDirectTM Kit	Invitrogen by life technology	11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit	Invitrogen by life technology	12562-019	Cellfectin transfection 시약 및 ganciclovir가 이 키트에 포함되었습니다.
pENTR-CAT 플라스미드	Invitrogen by life technology		BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit에 포함, 농도: 0.5 ug/uL
열 비활성화 소 태아 혈청,	Life Technologies 인증 Gibco	10082-139
Sf9 세포 Sf-900 III SFM	Gibco by Life	12659017
곤충 세포-PE LB 곤충 세포 단백질 추출 & A	G Biosciences	786-411
Sf-900 III SFM (1×) Life Technologies의 Serum Free Medium Complete	Gibco	12658-019
Grace's Insect Medium, Unsupplemented	Gibco by Life	11595030
Permethrin (isomers) 분석 표준	SUPELCO by Solutions WithinTM	442748
Methanol (analytical graded)	Sigma-Aldrich	67-56-1
Acetonitrile (분석 등급)	Sigma-Aldrich	75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm 주사기 필터 0.45 μ m GHP 멤브레인(HPLC 인증)	Pall Life Sciences	21890388
Alliance Waters 2695 HPLC 시스템	Waters
T100 Thermal Cycle	Bio-Rad Laboratories Inc.
Nanodrop 2000/2000c 분광 광도계	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Cytation 5 세포 이미징 다중 모드 리더	BioTek