방법 논문

절연 및 심장의 Extravascular 면역 세포의 식별

DOI:

10.3791/58114

⸱

2018년 8월 23일

 ,  , 
1Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (UHN), 2Dept of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Dept of Immunology, University of Toronto, 4Peter Munk Cardiac Centre, 5Ted Rogers Centre for Heart Research

이 논문에서

요약

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이 프로토콜 격리, 식별 하 고 안정 된 상태 또는 염증 동안 쥐의 심근에 있는 면역 세포를 계량 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 제공 합니다. 프로토콜은 cytometry에 의해 더 분석 될 수 있는 단일 세포 현 탁 액의 세대에 대 한 효소 및 기계적 소화를 결합 합니다.

초록

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면역 체계가 건강 한 심장의 필수적인 구성 요소입니다. 심근은 정상 상태와 다른 형태의 염증 동안 기능 구획과 다른 면역 세포 하위 집합의 풍부한 인구에 게 가정. 최근까지 연구에서에서 면역 세포의 현미경의 사용을 요구 하거나 심한 염증 동안 충분 한 감도 제공 하지만 하지 못했습니다 자신 있게 제대로 개발된 소화 프로토콜 식별 작은-하지만 키-인구 정상 상태 동안 셀입니다. 여기, 우리는 간단한 방법 결합 효소 (콜라, hyaluronidase DNAse)와 기계적 소화 murine 마음 앞에 작은 차별화에 놓여있는지 분류 항 체의 혈관 내 관리의 논의 하지만 피할 수 없는 혈관 내 세포 오염 물질입니다. 이 방법은 생성 식별 형질, 정량화, cytometry에 의해 분석 하거나 더 형광 활성화 된 세포 분류와 마그네틱 비드 분리 정화 수 있는 분리 가능한 세포의 현 탁 액 transcriptional 분석 또는 생체 외에서 연구. 우리는 주요 대 식 세포와 수지상 세포 인구 중심의 차별화 하는 단계별 흐름 cytometric 분석의 예를 포함 합니다. 중간 크기의 실험 (10 마음)에 대 한 절차의 완료는 2-3 h를 요구 한다.

서론

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심근 긴장 또는 부상, 허 혈 성 등 (국 소 빈 혈 reperfusion 또는 심근 경색)의 다른 형태와 비-허 혈 성 고혈압 (심근 염), 아니라 회복 및 보호, 염증 세포의 모집 홍보 병원 성 속성입니다. 1891, 빠르면 Romberg 처음 발진 티 푸 스, 성 홍 열1감염 환자의 심근에 세포 침투의 존재를 설명. 그러나, 심장 면역 세포의 상세한 연구 고급 immunophenotyping 기술 개발이 필요합니다. 그 결과, 최근에 우리가 안정 상태 동안 필수적인 유지 관리 역할을 가진 면역 세포의 다양 한 인구는 심근 내에 있는 이해 하기 시작 했습니다.

조직학, 되었으며 여전히 염증 동안 심장 면역 세포의 특성을 가장 일반적인 방법입니다. 그러나, 조직학 나타내는 유용한 진단 도구, 심장 면역 세포의 연구에 사용 중요 한 제한이 있다. 심근에 있는 면역 세포 총 세포의 아주 작은 비율을 대표 하 고 비례적으로 엄청난 공간에 더 많거나 적은 고르게 배포 됩니다. 마찬가지로, 여러 형태의 심장 염증, 바이러스 성 심근 염 등 염증의 초점 패턴을 표시합니다. 이 의미는 심장의 면역 시스템의 정확한 분석 종종 조직학 샘플링, 바이어스를 줄이기 위해 비용을 증가 시키기의 더 높은 학위를 필요로 합니....

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프로토콜

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윤리 성명:이 프로토콜을 검토 하 고 대학 건강 네트워크 (토론토, 캐나다)에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 동물 관리에 캐나다 위원회 준수 하 고.

1. 버퍼 준비

  1. HBB 버퍼 (행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS), 2% 열 비활성화 소 혈 청, 0.2% 소 혈 청 알 부 민)을 준비 합니다. 열 10 mL 비활성화 둔감 한 혈 청 및 HBSS의 500 ml 소 혈 청 알 부 민 1 g 추가 합니다. 필터는 0.2 µ m 필터를 통해 소독 및 4 ° c.에 저장
  2. FACS 버퍼를 준비 (인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 2% 열 소 혈 청, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA, pH 8.0) 비활성화). 10 mL 열 비활성화 둔감 한 혈 청 및 PBS의 500 mL에 0.5 M EDTA의 1 mL를 추가 합니다. 필터는 0.2 µ m 필터를 통해 소독 및 4 ° c.에 저장
    참고: 솔루션을 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 1 개월.

2. 순환 하는 백혈구의 라벨

  1. Aseptically 200 µ L/마우스의 최종 주입 볼륨에 대 한 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS)에 희석 ....

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결과

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날짜 하려면, 좋은 방법 cardiomyocytes 같은 다른 심장 세포 구성 요소에서 면역 세포를 분리 설계 되었습니다. 따라서, cytometry에 의해 심장 단일 세포 현 탁 액의 분석 단일 세포 및 작은 크기 제외 제어그림 1(A) 면역 세포 인구를 식별 하는 CD45와 미리 게이팅 필요 합니다. 또는, 생존 얼룩이 죽은 세포를 제외 하려면 수행할 수 있습니다. 소형 제외 및 생존 염료 얼룩이 죽은 세포 (그림 1B 와 1 D) 제외 거의 동일한 방법을 나타냅니다. 그것은 좋습니다 소화 절차 후 곧 얼룩이 지는 항 체와 함께 진행 하 고 항상 4 ° C에 세포 현 탁 액을 유지 하는 세포의 생존 수 있습니다 부패로. 이 절차는 일반적으로 실행 가능한 면역 세포의 약 8.......

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토론

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심근 염증, 또는 심근 염, 가장 심혈 관 질환의 기능입니다. 그러나, 심근 질병이 아닌 상태에서 자체 면역 구성 요소 없는 아니다. 정상 상태 동안 많은 면역 세포에는 심근 있으며 유지 보수 및 보호의 필수적인 역할. 셀의 이러한 다양 한 인구 특성 것 없었을이 프로토콜에서 제시 하는 것과 같은 방법 없이 불가능 하다.

심근의 기계 및 효소 소화의 조합 분석, 흐름 cytometry 또는 immunomagnetic 구슬 격리 등의 다른 방법으로 조합에 사용할 수 있는 단일 세포 현 탁 액의 격리를 허용 합니다. 현재 방법에 관한 몇 가지 고려 사항 계정으로 촬영 해야 합니다. 첫째, 모든 우리의 분석; 심근 내 인구를 참조 이들은 자신의 작업 전문된 조직으로는 심 방 우리의 분석에서 배제 합니다. 둘째, 효소 사용 양의 소화 효소를 사용 하 여 다른 소스에서 설정에 도움을 활동 단위로 표현 됩니다. 그러나, 효소의 최종 농도와 소화의 시간 경험 주의자 최적화가 좋습니다, 크게 .......

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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이 작품은 캐나다 연구소의 건강 연구 (148808 148792)에 의해 지원 되었다, SE는 심 혼 및 치기 기초, 온타리오 주정부 사무실, 십 센트의 3 월, 피터 Munk 심장 연구에 대 한 테드 로저스 센터에서 직원 수상에 의해 지원 되었다 심장 센터입니다. XCC는 CIHR 밴팅 화목을 보유 하고있다. 라 심 혼 & 치기/리처드 Lewar 재학 수상 보유 하고있다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인산염 완충 식염수Wisent311-010-CL1x PBS
21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide NeedleBD305167
Hank' s 균형 잡힌 소금 용액Wisent 311-511-CL1x HBSS
소 혈청 알부민Sigma-AldrichA4503-50G
소 혈청시그마B9433
0.5 M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산BioShopEDT111
진공 필터, 0.2 µ m Filtropur V50Sarstedt83.1823.001
28 G 1/2 1cc 인슐린 주사기BD329424
60mL 주사기BD309653
Dulbecco's Modified Eagle MediumWisent319-005-CL1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate
Collagenase ISigmaC0130Clostridium histolyticum
히알루로니다아제 I-S시그마H3506
DNase-I시그마D4513소 췌장에서 추출한
세포 여과기, 40 &마이크로; m NylonFalcon352340
암모늄-염화물-칼륨(ACK) 용해 완충액Lonza10-546E
Alexa Fluor 700 안티-마우스/인간 CD11bBiolegend1012221:250 희석
APC/Cy7 안티-마우스 Ly-6cBiolegend1280251:250 희석
APC 안티-마우스 CD103Biolegend1214141:250 희석
브릴리언트 바이올렛 605 안티 마우스 CD11cBiolegend1173341:250 희석
PE 안티 마우스 Ly-6GBiolegend1276071:250 희석
퍼시픽 블루 안티 마우스 I-AbBiolegend1164221:250 희석
FITC 안티 마우스 CD64 (FcgRI)Biolegend1393151:250 희석
PE/Cy7 안티 마우스 CD45Biolegend1031131:250 희석
PerCP/Cy5.5 안티 마우스 CD45Biolegend1031321:40 희석
TruStain fcX (안티 마우스 CD16/32)Biolegend1013201:100 희석
True-Stain Monocyte BlockerBiolegend4261011:20 희석
FlowJo V10TreeStar Inchttps://www.flowjo.com/solutions/flowjo
마우스: BATF3-/-잭슨 연구소JAX: 013755
from

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. Pathology and natural history of human myocarditis. Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).
  2. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived res....

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