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방법 논문

조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

9.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58140

⸱

2018년 10월 3일

 ,  ,  , 
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2LGI Flow Cytometry Core Facility, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

이 논문에서

요약

우리는 유전자 조작된 조 혈 모 세포의 악성 잠재력을 평가 하기 위해 조 혈 모 세포 이식 (HSCT)의 사용을 설명 합니다. HSCT 소설 치료를 평가 하 형성 증후군 (MDS) 또는 백혈병 생쥐의 대형 코 호트 생성 뿐만 아니라 다양 한 악성 조 혈 모 세포에 vivo에서 평가 대 한 유용 합니다.

초록

형성 증후군 (MDS) 효과 조, 말 초 혈액 cytopenias, 발육 이상, 급성 백혈병에 변환에 대 한 성향에 의해 정의 되는 조 혈 줄기 세포 장애의 다양 한 그룹입니다. NUP98-HOXD13 (NHD13) 유전자 변형 마우스 주변 혈액 cytopenias, 발육 이상, 및 급성 백혈병 변환 인적 MDS 정리. 우리는 이전는 MDS 옮겨질 수 있었다 MDS와 유전자 조작된 마우스에서 야생-타입 받는 사람에 게 이식 MDS 골 nucleated 세포 (BMNC)에 의해 설명 했다. 더 명확 하 게 근원의 MDS 셀 이해, 특정 이식 하는 방법을 개발 했습니다, 그리고 immunophenotypically 조 혈 하위 집합을 정의 합니다. 이 문서에서 우리는 분리 하 고 조 혈 줄기와 조상 세포의 특정 인구를 이식 하는 과정을 설명 합니다. 따라 이식, 이식의 효율성 및 기증자 MDS 셀의 지 속성을 평가 하는 방법 설명 합니다.

서론

형성 증후군 (MDS) 대표 클론 혈액 장애 효과 조, 발육 이상의 morphologic 증거 및 급성 골수성 백혈병 (AML)1,2로 변환에 대 한 성향 특징의 다양 한 세트 ,,34. 효과 조 골 수에서 성숙 체포 및 hypercellular 골1,3에 불구 하 고 주변 혈액 cytopenias 결과 인식 됩니다. MDS의 발병 률 각종 2-12의 경우는 미국에서 매년 100, 000 명 당으로 추정 하 고 MDS의 발병 률 증가 나이, 노화 미국 인구3, 주어진 이해 하는 중요 한 조건 만들기 5. MDS의 대부분의 경우는 더 명확한 병 인, MDS의 경우 벤젠, 그리고 암 화학요법6같은 용 매를 포함 하 여 알려진된 차적인 에이전트에 노출 때문에 생각 된다.

MDS 환자 일반적으로 MDS 셀7에 돌연변이 인수 했습니다. 비록 상대적으로 드문, MDS 환자 수 유전자 NUP98, EVI1, RUNX1, MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman) 등을 포함 하는 균형된 염색체 translocations를 인수 했습니다. 우리 연구소는 염색체 translocations, NUP98 유전자8을 포함에 대 한 오랜 관심 있습니다. 유전자 변형 마우스 NUP98-HOXD13 (NHD13) transgene Vav1 발기인에 의해 규제 및 증강 요소 표시의 모든 MDS, 주변 혈액 cytopenias, 발육 이상, 및 AML9 변환 형태 론 적 증거를 포함 하 여 주요 기능을 표현 .

MDS는 60 년10에 대 한 인정을 받고 있다 고 클론 줄기 세포 장애로 간주 됩니다, engraft 인적 MDS 셀 immunodeficient 마우스에 노력 하지 크게 성공 했습니다, MDS 셀 engraft 저조한11, 때문에 12,,1314 및 쥐 임상 질병을 개발 하지 않습니다. 조 혈 모 세포는 MDS를 전송할 수 있습니다 식별 하는 노력에서 우리 NHD13 모델 그리고 모든 주변 혈액 cytopenias를 포함 하 여 인적 MDS의 기본적인 기능을 보여준 질병 엔터티로 MDS를 engraft 수 있는 우리가 나타났다 발육 이상, 그리고 AML15변환입니다. 이 보고서에서 우리는 MDS 시작 셀을 식별 하기 위해에서 이러한 실험, 뿐만 아니라 조 혈 줄기와 선구자 세포 (HSPC), 더 이상 충분치 접근의 기술적인 세부 사항 제시.

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프로토콜

이 문서에서 설명 하는 동물 절차 베 데스 다 동물 관리 및 사용 위원회, 국립 암 연구소에 의해 승인 했다 그리고 인간적 관심과 실험실 동물의 사용에는 공중 보건 서비스 정책에 포함 된 정책 준수는 동물 복지 행위, 그리고 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드.

1. 세포 준비

  1. 수확 골 nucleated 세포 (BMNC)
    1. 메 마른 재료만을 사용 합니다. 소독 증기 압력솥을 사용 하 여 다시 사용할 수 있는 악기. 바늘, 주사기, 그리고 단일 사용 무 균 용기에 플라스틱 도자기를 구입. 유형 a 2 생물 안전 캐비닛 클래스 II에서 모든 동물 및 세포 조작을 수행 합니다.
    2. HF2 3 mL를 포함 하는 하단 튜브 라운드 14 ml에서 BMNCs 준비 (행 크의 균형 소금 솔루션 2% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충).
    3. C57Bl6 기증자 쥐 (CD45 대립 유전자 CD45.2에 대 한 긍정적인), 일반적으로 2-6 개월, 나이 CO2 챔버를 사용 하 여 안락사
    4. 스프레이 병으로 몸 전체에 70% 에탄올을 분사 하 여 마우스 시체를 소독. 발목 아래로 골반에서 다리에서 피부를 벗 겨.
    5. 살 균 (직선, 샤 프/샤 프, 11.5 c m)가 위와 집게 (Graefe, 톱니, 0.8 m m 팁 폭)를 사용 하 여 시체에서 femora 및 경골을 제거 합니다. 명확 하 게 연결 된 근육을 잘라.
    6. 경골의 근 위 및 원심 끝은가 위로 잘라. 집게와 경골을 잡고, 경골 (발목)의 원심 끝에 tibial 골 수 구멍으로 HF2의 2.5 mL를 포함 하는 27-게이지 3 mL 주사기를 삽입 합니다. 하단 튜브 라운드 14 mL에 부드러운 압력을 사용 하 여 경골에서 골 수 세포를 플러시.
      1. 다른 경골에 대 한 반복 합니다.
    7. 가 위는 대 퇴 골의 근 위 및 원심 끝을 잘라. 플러시 20 게이지 바늘을 삽입 하 여 대 퇴 골 골 수 구멍에 대 퇴 골 골 수 구멍의 선단부 HF2의 2.5 mL를 포함 하 고 주사기에 부드러운 압력을 적용 3 mL 주사기에 부착.
      1. 다른 대 퇴 골, 두 경골에서 모든 골을 수집에 대 한 반복 하 고 동일한 14 ml femora 원형 하단 튜브.
    8. 위쪽 및 아래쪽 3 mL 주사기에 부착 된 동일한 20 게이지 바늘으로 여러 번 발음 하 여 골 수 질량을 분산.
  2. 항 체 BMNC의 얼룩
    1. 수 BMNC입니다. 1.1.8 단계에서 생성 된 BMNC 서 스 펜 션의 20 µ L를 3% 초 산 용액의 20 µ L를 추가 합니다. 그런 다음는 hemocytometer와는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 계산 합니다.
    2. BMNC에서 4 ° c.에서 5 분 동안 450 x g 부드러운 원심 분리 하 여 펠 렛 HF2와 펠 릿 107 셀 당 90 µ L를 사용 하 여 resuspend을 셀 서 스 펜 션에 biotinylated 반대로 혈통 항 체 칵테일의 10 µ L를 추가 합니다.
    3. 4 ° C에서 20 분 동안 잠복기 후 얼룩진된 셀 3 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)을 씻는 다.
    4. 107 셀 당 HF2의 100 µ L 함께 BMNC resuspend 2 µ L allophycocyanin (APC)의 활용 방지 비오 틴 항 체는 세포 현 탁 액, 20 분 동안 4 ° C에 외피 다음에 추가 합니다.
    5. 3 mL의 PBS로 얼룩진된 BMNC를 헹 구 고 HF2 0.2 µ g/mL 흐름 cytometry 셀 정렬 propidium 요오드 화물 (PI)의 보충과 BMNC resuspend.
  3. Flow cytometry 세포 BMNC의 분류
    1. 교류 cytometry 셀 정렬 보정. 모든 광 전 증폭 관 관 (Pmt), 분산형, 및 흠 없는 세포를 사용 하 여 형광 매개 변수를 최적화 하 고 각 검출기의 선형 범위 내에서 설정.
    2. 흠 없는, PI-스테인드, 준비 하 고 APC 라는 혈통 단계 1.2에서에서 병렬로 칵테일 셀. 스펙트럼 보상에 대 한 분석.
    3. 더블 릿 셀의 FSC-H 대 SSC-H, 640-SSC-H 640-SSC-A 대 대 640-SSC-S 640-SSC-W. 순차 게이팅 하 여 차별
    4. 561 및 방출 614/20 밴드 패스 필터와 수집에 PI 흥분된을 사용 하 여 미달 셀을 제외 합니다. 자극 혈통 APC 671/30 밴드 패스 필터와 640 nm 및 수집 방출에서 셀을 표시 합니다.
    5. 전압 높이 형광 값을 기록 하 고 목록 모드 데이터 파일을 정렬 인구 시각화에서 적어도 100000 이벤트를 수집 합니다.
    6. 다음에 대 한 10000 셀의 3 개의 샘플을 얻은 후 스펙트럼 보상 계산: 셀, 셀을 표시 하는 PI 및 APC 세포 분류와 활용 된 반대로 혈통 항 체 칵테일 레이블 없음.
    7. 10 %FBS 미디어의 0.5 mL를 포함 하는 5 mL 튜브에 밝은 형광 (LP2)와 계보 부정적인 (LN), 희미 한 형광 강도 (LP1)와 LP 인구 혈통 긍정적인 (LP)을 정렬 하려면 3 개의 영역을 설정 합니다.
    8. 한 방울을 사용 하 여 정렬 셀 포함 하 고 중단 모드를 정화.
    9. 순도 및 정렬된 셀의 정렬 된 각 샘플에 1000 총 셀 게시물 정렬 분석을 수행 합니다.
    10. 4 ° C에서 5 분 동안 450 x g에서 원심 분리에 의해 정렬 된 세포를 수집 하 고 HF2의 0.5 mL와 펠 릿 셀 resuspend.
    11. 정렬된 셀 hemocytometer Trypan 블루와 번호를 확인 합니다. 이 식 위한 HF2와 휴대폰 번호를 조정 합니다.
      참고: BMNC 인구의 넓은 스펙트럼 1.2.2 위의 단계에서 추가 조합의 형광 색소 활용 된 항 체를 사용 하 여 이식에 대 한 격리 수 있습니다.

2. 받는 사람 마우스 준비 및 조 혈 모 세포 이식 (HSCT)

  1. 이식 받는 사람의 준비
    1. 동물 축산 congenic 받는 사람 마우스 (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 동물 시설에서 들을 유지.
    2. 위장 트랙의 예방 오염에 대 한 치명적인 복용량 (9 Gy) 방사선 조사, 이전 7 일 동안 100 mg/L ciprofloxacin 받는 사람에 게의 포함 하는 메 마른 물 제공 하 고 조사에 따라 14 일 동안 유지 합니다.
    3. Cs 소스에서 치명적인 복용량 (9 Gy) 방사선 조사를 다음과 같이 제공 합니다. 훈련, 인증 된 Cs 연산자를 사용 합니다. Cs 소스 악기 70 cGy/분 몸 전체 감마 방사선을 전달 하기 위해 설정 합니다. 맞춤형 홀더에서 10 마우스를 놓고 홀더 irradiator 챔버에 삽입 합니다. 13 분에 9 Gy 총 몸 방사선 조사를 제공 하 고 그들의 감 금 소에는 마우스를 반환 합니다.
  2. 조 혈 줄기 세포 이식
    1. 혼합 야생 타입 (WT) congenic 받는 사람 마우스 (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) 마우스와 함께 2 ~ 5 x 10 당 2 × 105 셀의 셀 복용량에서 BMNC BMNC 준비 정화 테스트의4 셀 흐름 cytometry 위의 설명된에서 1.3으로 정렬. 셀 같은 주사기에 혼합.
      참고: WT BMNC 받는 사람 마우스에 방사선을 살려주는 효과 제공 하 고 테스트 셀 조를 지원 하지 않는 경우 받는 사람 마우스의 생존에 대 한 허용. WT BMNC CD45.1 대립 유전자 표현 이런이 종류의 실험에 사용 하 고 따라서 구분할 수 있습니다 CD45.1과 CD45.2 사이 감 별 하는 항 체를 사용 하 여 테스트 셀에서. WT BM 셀 "도우미 셀", "방사선을 살려주는 세포", 또는 "경쟁 세포" 라고 하.
    2. 주사를 촉진을 위한 살 균 HF2를 사용 하 여 받는 사람 당 200 µ L 셀 혼합 볼륨을 조정 합니다.
    3. 치명적 방사능된 받는 사람 마우스를 통해 정 맥 꼬리 정 맥 주입에 1 mL 주사기와 방사선의 24 시간 안에 28 게이지 바늘을 사용 하 여 셀 혼합물을 이식. 열 꼬리 정 맥 팽창 리드 열 램프 아래 마우스 꼬리를 놓습니다.
      참고: 연구의 끝에 모든 받는 사람 마우스를 안락사 하 고 검 시, 조직학, cytometry에 의해 질병의 진행을 평가 합니다.

3. engraftment 분석 결과 Flow Cytometry 사용 하 여

  1. 기증자 세포 engraftment를 평가 하려면 6 주, 12 주, 그리고 이식 후 16 주 사용 받는 사람 마우스에서 말 초 혈액 (PB)을 수집 합니다.
  2. 약 1 분 동안 열 램프와 새에서 받는 사람을 따뜻한 고 마우스는 restrainer 합니다.
  3. 메스 (블레이드 10, #3 메스 핸들)와 꼬리 정 맥을 절단 하 고 EDTA 항 응고 제에로 포함 하는 microcapillary 튜브를 사용 하 여 받는 사람 마다 PB의 100 µ L를 수집 합니다.
  4. 수집 된 PB을 살 균 microcentrifuge 튜브에서 50 µ L를 배치 하 여 두 개의 동일한 aliquots에 나눕니다. (NCI Histopathology 코어에서 수행) 자동화 완료 혈액 검사 (CBC)에 대 한 한 약 수를 사용 하 고 두 번째 약 수를 사용 하 여 항 체 얼룩이 지기에 대 한 cytometry 흐름.
  5. Cytometry에 의해 기증자 engraftment를 검색, 수집된 PB의 50 µ L을 소형 RBC 세포의 용 해 버퍼 (8.29 g/L NH4Cl, KHCO3, 나2EDTA, pH 7.2 0.037 g/L의 1 g/L)의 1 mL을 추가 하 여 적혈구 (RBC) lyse. 소용돌이 혼합 하 여 샘플을 실 온에서 10 분을 품 어.
  6. 원심에서 4600 x g lysed PB 1.5 분 신중 하 게는 상쾌한 발음 하 고 삭제.
  7. 부분적으로 부드럽게 도청 또는 "터치" 튜브의 아래쪽 셀 펠 렛을 방해. 1.3 mL PBS의 펠 릿에 위치한 1.5 분에 4600 x g에서 원심 분리기와 신중 하 게 aspirate 삭제는 상쾌한 추가 합니다.
  8. 감청 또는 flicking, 셀 펠 릿 고 HF2 5% 쥐 혈 청 셀 펠 릿 보충의 200 µ L을 추가 됩니다.
  9. 추가 안티-CD45.2 항 체 (1 µ L) allophycocyanin (APC) 세포 현 탁 액을 함께 활용 합니다. 적어도 30 분, 그리고 짧게 소용돌이 혼합물에 4 ° C에서 품 어.
  10. 얼룩, 후 위에서 설명한 대로 두 번 셀을 세척 하 고 HF2 PI의 1 µ g/mL와 보충의 400 µ L 함께 resuspend.
  11. 사용 하 여 4 색 교류 cytometer engraftment를 감지 합니다. 추가 추가 항 체 특정 세포 유형, B 또는 T 세포 등을 감지 하 여 말 초 혈액 내의 셀 형식에 대 한 추가 정보를 가져올.
  12. 데이터의 추가 분석에 대 한 있도록 스프레드 시트를 사용 하 여 직렬 engraftment 데이터를 기록 합니다.

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결과

우리는 몇 가지 실험의 결과 대 한 대표적인 수치를 보여줍니다. 그림 1 실험 정렬 대표 cytometry를 보여준다. 정상적인 조 혈 차별화, 동안 세포가 특정 조 혈 혈통에 최선을 다하고 그들은 혈통 정의 세포 표면 마커를 확보 고 자기 갱신에 대 한 가능성을 잃게. 따라서, 야생-타입 마우스, 줄기 세포 자체-갱신은 혈통 부정적인 BMNC에 국한. 이 실험에서 우리 혈통-부정, 낮은 혈통 긍정적인, 그리고 높은 혈통 양성 세포로 NHD13 골 수에서 BMNC 정렬. 이러한 정렬 셀 다음 자기 갱신 용량을 확인 받는 사람 WT에 이식 했다.

그림 2 는 별도 실험에서 결과 혈통에 부정적인 세포 또는 MDS와 NHD13 기증자에서 정렬 되지 않은 셀 치명적...

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토론

MDS는 클론 조 혈 줄기 세포 장애, MDS "줄기", 또는 시작 셀 특징 되었습니다 아직 없습니다. 우리는 이전 MDS transplantable WT 쥐 HSCT, macrocytic 빈혈증, leukopenia, 호 중구 감소 증, 그리고 발육 이상15의 morphologic 증거 특징에 의해 NHD13 쥐에서 골 수를 사용 하 여 될 수 있는 시연 했다. 또한, 경쟁력 있는 repopulation 분석 NHD13 MDS 골 수에서 세포의 성장 우위를 확인. 함께 찍은, 이러한 결과 MDS 줄기 또는 시작 셀의 존재 의미. 추가 실험은 진행 중인 지금,는 immunophenotypic 정제 목적으로 시작 하는 MDS의 특성15 더 정의 된 줄기와 조상 세포 마커 (CD150, CD48, c-Kit 및 Sca 1)를 사용 하 여16 계보와 결합 마커 얼룩이 프로토콜에서 설명 하는 방법입니다.

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공개 사항

공개 하는 것이 없다.

감사의 글

이 작품은 국립 암 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 건강의 국가 학회 (ZIA SC 010378와 BC 010983 번호 부여).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
14 mL 라운드 바닥 튜브Falcon352057
Hank's balanced salt solutionLonza10-527F
Anti-CD45.2 항체Southern Biotech1800-15LOT# A077-T044O
3 mL 주사기Monoject8881513934
27-G 바늘BD305109
20-G 바늘BD
305176 Lineage CocktailMiltenyi130-090-858LOT# 5170418221
Anti-Biotin 항체Miltenyi130-113-288LOT#
5171109046 1 mL 주사기Excelint26027인슐린 주사기
가열 램프Thermo Fisher ScientificE70001901
FACS 기계CytecFACScan2 레이저, 5개의 색 검출기
FACS 선별 기기Beckman CoulterMOFLO ASTRIOS5개의 레이저, 23개의 매개변수, 6개의 집단 동시 분류
프로피듐 요오드화물Thermo Fisher ScientificP3566
감마 조사기최고의 테라트로닉스감마셀 40
혈액 채취관RAM scientific76011
수상자 마우스Charles RiverB6-LY5.1/Cr, CD45.1
NUP98-HOXD13 마우스n/aC57Bl/6, CD45.2Colony maintained at NIH
5 mL round bottom tubeFalcon352058

참고문헌

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