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헬싱키의 선언에 따라 연구 되었다. 모든 참가자에 게 서 얻은 서 면된 동의 하 고 혈액과 림프 노드 샘플 펜실베니아 대학 (IRB #809316, IRB # 815056) 기관 검토 위원회의 승인으로 인수 했다. 모든 인간의 과목 성인 이었다입니다. 코드 혈액 샘플을 친절 하 게 노동과 학과의 산부인과 토마스 제퍼슨 대학에서의 납품에 의해 제공 되었다. 모든 샘플 드 확인 했다입니다.
1. 절연 CD4의 이미지 분석에 대 한+ T 세포
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107 냉동 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 또는 림프 노드 단 세포 (LNMCs) 수집 된 샘플에서 포함 된 1 mL 약 수 동 살 균 후드에서 RPMI 페니실린/스와 글루타민 보충의 9 mL에 해 동된 셀을 추가 합니다.
- Centrifugate에서 4 ° C, 300 x g 에서 10 분 동안 셀 상쾌한, 발음 및 10%를 포함 하는 보충된 RPMI의 5 mL에 셀 resuspend FBS (완전 한 매체). 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 하룻밤 셀을 품 어
- 다음 날, 정화 CD4 부정적인 immunomagnetic 제조업체의 지시에 따라 상용 키트를 사용 하 여 정렬 하 여+ T 세포.
- 갓 순화 CD4 수를 측정 하기 위해+ T 세포, trypan 블루 솔루션의 동등한 볼륨 세포 현 탁 액의 5 µ L를 혼합. 로드 셀 trypan과 hemocytometer 혼합물을 블루와 hemocytometer의 5 섹션 안에 라이브 셀.
- 휴대폰 번호의 평균을가지고 고 원래 세포 현 탁 액에 있는 셀의 수를 결정: 셀/1 mL의 수 = 2 × 104x 평균 수. 고립 된 세포의 총 수 너무 작은 경우 셀 계산 하지 않고 그대로 사용 합니다.
- 10 분에 대 한 300 x g 에서 세포를 원심 및 105에 분석 결과 버퍼 (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2mm 나2HPO4, 5 m D-포도 당, 5 m KCl, 1 mM MgCl2m m, 2 m m CaCl2및 1% 인간 혈 청 알 부 민)에 그들을 resuspend < /c13 > 셀/50 µ L 이하로 실험에 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 (1-2 h) 세포를 유지 하 고.
- 관련 기관 지침에 따라 모든 생물 학적 폐기물의 처분.
- 원하는 경우 컨트롤 셀 인구로 서, 탯 줄 혈액 PBMC에서에서 CD8 T 세포 활성화를 준비, 10 µ g/mL 및 1 µ g/mL에서 안티-CD3 및 안티 CD28 항 체의 혼합물으로 덮여 T25 문화 플라스 크에 완전 한 매체의 5 mL에 107 셀 장소 각각.
- 다음 날, 플라스 크에서 활성화 코드 혈액 세포를 제거 그들을 씻어 1 x 신선한 매체를 완료 하 고 재조합 일리노이-2의 셀 확장 (100 U/mL) 2 주 동안.
- 코드-혈액 CD8 정화+ T 세포의 부정적인 immunomagnetic 제조업체의 지시에 따라 상용 키트를 사용 하 여 정렬. 셀을 계산 하 고 LN 및 PB CD8 1.3-1.6 단계에 설명 된 대로 분석 결과 버퍼에 미디어를 교환+ T 세포.
2. 평면 지질 Bilayers의 준비에 대 한 구성 요소
- 5설명 되어 있는 대로 리의 3 종류 준비: (a) 0.4 m m DOPC (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 리, (b) 0.4 m m DOPC 리 33 mol % 개 NTA를 포함 (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5- 아미노-1-carboxypentyl) iminodiacetic 산) succinyl] (염화 소금)) 지질, 4 mol %Biotinyl-모자-PE를 포함 하는 (c) 0.4 m m DOPC 리 (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(모자 biotinyl) (나트륨 소금)).
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앞에서 설명한55% 카 세 인 솔루션을 준비 합니다.
- 초순의 100 mL에 카 세 인 분말의 5 g을 녹이 고 수산화 나트륨 10 M의 350 µ L을 추가. 2 시간, 실 온에서 사용할 수 있는 규모에 따라 느린 속도로 일반 자력에 모든 것을 저 어 하 고 4 ° c.에서 하룻밤 7.3 및 ultracentrifuge에서 4 ° c.에 100000 x g 2 h에 대 한 솔루션에 pH를 조정 0.22 μ m 살 균 필터는 상쾌한 필터링 및 솔루션-80 ° c.에 aliquots에 저장
주의: 수산화 나트륨 용액 화학 화상을 일으킬 수 있습니다 하 고 눈과의 접촉에 따라 영구적인 실명을 일으킬 수 있습니다. 이 화학 제품 또는 그것의 솔루션을 다룰 때 고무 장갑, 안전 복과 눈 보호를 사용 합니다.
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앞에서 설명한 방법은8모노-bionylated 항 체 분자를 생산 하기 위해 biotin과 레이블 안티-CD3 항 체.
- 0.1 mg/mL에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 Biotin PEO4 NHS의 솔루션을 준비 합니다. 0.5 ml의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 100 mM 탄산수 소 나트륨을 포함 하는 항 체의 1 밀리 그램 Biotin PEO4 NHS 솔루션의 3.7 µ L를 추가 합니다.
- 실 온에서 2 h에 대 한 혼합물을 품 어. 알 렉 사 Fluor 488 NHS 에스테 르 DMSO에 10 mg/mL에서의 솔루션을 준비 합니다. 10 어 금 니 과잉에 Biotin PEO4 보 건국에 의해 표시 된 항 체에 알 렉 사 Fluor 488 NHS 에스테 르 솔루션을 추가 합니다.
- 정기적으로 자력에 느린 교 반으로 실 온에서 1 h에 대 한 혼합물을 품 어. 크기 배제 크로마토그래피를 사용 하 여 언바운드 염료를 구분 합니다.
- 280에서 항 체 용액의 광학 밀도 측정 하 여 항 체 농도 결정 nm (280). 577에서 레이블이 지정 된 항 체의 광학 밀도 측정 nm (577).
- 다음 수식을 사용 하 여 염료를 항 체 비율을 확인 합니다.
참고: 제조업체의 프로토콜에서 추가 세부 정보를 찾을.
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앞에서 설명한3,4,,910 초파리 식 시스템에서 재조합 형 수용 성 ICAM-1 단백질을 표현 한다.
- 복제, cDNA 인코딩으로 초파리 식으로 ICAM-1의 ectodomain pMT/V5-그는 그의 추가 재조합 단백질을 생산 하는 유도할 수 있는 metallothionein 모터와 벡터 C 터미널 끝에6 태그.
- 공동 transfect S2 셀 결과 ICAM-1 포함 플라스 미드와 G418 식 벡터. 안정적인 transfectants 슈나이더의 초파리 미디어 3 주 동안 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 및 0.5 mg/mL G418의 보충을 사용 하 여 선택 합니다. 혈 청 무료 곤충 매체에 셀을 확장 하 고 0.5 m m CuSO4 3 d와 단백질 발현을 유도.
- 문화 표면에 뜨는 배를 집중 하 고 앞에서 설명한11로 접선 흐름 집중 장치를 통해 PBS에 대 한 dialyze.
- Covalently 고정된 안티-ICAM-1 단일 클론 항 체와 Sepharose를 포함 하는 열을 표면에 뜨는 집중된 문화를 적용 하 고 50mm 글리신 버퍼, pH 3.0으로 바인딩된 ICAM-1을 elute. 즉시 2 M Tris 버퍼, pH 8.0 eluted ICAM-1 단백질을 무력화.
- PBS, pH 8.0에 대하여 eluted 물자 dialyze 고 열 포함 Ni NTA agarose를 dialyzed 자료를 추가 합니다. 녹는 ICAM-1 200 mM 이미, pH 8.0 elute PBS 버퍼, pH 8.0에 eluted 소재 dialyze
- 레이블을 Cy5 NHS 에스테 르 제조 업체의 지시에 따라 정화 ICAM-1.
참고: 최고의 마지막 염료 단백질 비율은 1:1입니다.
- 팹 생산 papain 소화에 의해 안티-CD107a 항 체에서 조각 하 고 팹 정화 이온 교환 크로마토그래피3위에서 설명한 대로 의해 조각. 레이블 제조업체의 지시에 따라 알 렉 사 Fluor 568 NHS 에스테 르는 팹 조각.
3. 지원 되는 유리 평면 지질 Bilayers의 대형
- 집중된 한 황산과 과산화 수소 30%의 60 mL 140 mL를 혼합 하 여 신선한 산 성 피 솔루션을 준비 합니다. 몸을 담글 하 여 그들 30 분 대기에 대 한 산 성 피 솔루션에 유리 coverslip 폴 리 프로필 렌가 위 형 집게와 흐름 슬라이드 유리 coverslips 세척.
주의: 피 솔루션은 매우 강한 산화 제. 솔루션을 처리 하는 동안 항상 착용 안전 유리 또는 고글 또는 두꺼운 고무 장갑 함께 들고 방패를 기억 하십시오. 증기 두건에서 피 솔루션 에서만 작동 합니다. 폭발 수 있습니다으로 난방, 수송, 또는 언제 든 지 사용 하는 동안 그것을 동요 하는 하지 마십시오. 포함 하는 리드 구멍 유리 병에 고생 폐기물을 수집 합니다. 문의 적절 한 폐기물 활용에 대 한 제도적 인 안전 위원회.
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린스 세척된 coverslips 7 초순 순차적으로 신선한 물을 포함 하는 비 커에 그들을 전송 하 여 x. 설정 옆으로 물이 남아 있도록 젖은 coverslips 롤 건조 유리를 남겨두고 깨끗 한 유리 합니다.
- 또는, 진공 펌프에 연결 된 피 펫 팁을 사용 하 여 신중 하 게는 coverslips에서 나머지 물방울을 제거.
- 살 균 후드에서 희석 다양 한 지질 bilayers 만들기 위한 liposome 믹스를 생산 하기 위해 수행 합니다. 첫째, DOPC 리의 37 µ L 3 µ L Biotinyl-모자-PE 리의 결합. 둘째, DOPC 리의 14 µ L 고 개-NTA 리의 15 µ L를 혼합. 셋째, 결승전 liposome 혼합물을 조작 하는 두 번째의 29 µ L를 첫 번째 믹스 1 µ L를 추가 합니다.
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살 균 후드 작업 공간 가까이 의해 건조 coverslips로 설정 합니다. 결승전 liposome 혼합물의 aliquot 2 µ L (단계 3.3 참조) 접착 슬라이드 채널의 중심에 정확 하 게. 즉시 고 매우 정확 하 게 정렬 깨끗 하 고 건조 coverslip 슬라이드 및 슬라이드의 끈 적 한 면에 coverslip 부드럽게.
- 하나 이상의 슬라이드를 준비 하는 경우 한 슬라이드에 한 번에 이후 작동 liposome 혼합물 빠르게 증발. 슬라이드를 뒤집어 놓고 형 폴 리 프로필 렌가 위 집게의 외부 반지를 사용 하 여 슬라이드, 슬립 누설을 방해 하기 위해 슬라이드에 단단히 연결 되어 있는지 확인 하는 coverslip의 주변 접촉에 부드러운 압력을 적용 합니다.
참고: 깨고 나는 coverslip 크래킹을 피하기 위해 슬라이드의 채널에 대 한 누르지 마십시오.
- 다시 슬라이드를 설정 하 고 어셈블리의 외부 슬라이드에 bilayer 주위 영구 표시와 함께 그리기 4 점으로 coverslip 사이의 채널 슬라이드 드롭 처럼 보이는 형성된 된 bilayer의 위치를 표시 합니다.
- 채널에는 액체의 첫 번째 주입, 전에 엔트리 포트와 출구 포트 다른 채널의 한 포트를 지정 하 고 실험을 통해이 지정을 유지 합니다.
- 거품 형성을 방지 하려면 채널의 엔트리 포트에 직접 피펫으로 팁의 끝을 삽입 합니다. 천천히 따뜻한의 50 µ L를 채울 슬라이드의 채널 (적어도 룸 온도) 분석 결과 버퍼 (버퍼 구성에 대 한 1.5 단계 참조).
- 0.5 M nickel(II) 염화 물 솔루션을 준비 합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 물 욕조에 카 세 인 솔루션의 2 mL 약 수를 녹여 하 고 그것 200 µ M의 최종 농도에 니켈 염화 물 솔루션을 보완.
- 먼저 채널의 엔트리 포트에서 카 세 인 솔루션의 100 µ L를 주입 하 고 즉시 pipetting으로 슬라이드에 출구 포트에서 100 µ L을 제거 하 여 있는 bilayers 워시. 각 채널의 입력 포트에 카 세 인 솔루션의 100 µ L를 주입 하 고 실 온에서 45 분에 대 한 슬라이드 배양 하 여 동일한 솔루션 bilayers 차단.
- Aliquots Cy5-ICAM-1-그의6 와 streptavidin 단백질의 해빙 각 2 µ g/m l의 최종 농도에 분석 결과 버퍼에 단백질을 결합 한다. 20000 x g 및 모든 집계 제거 하 4 ° C에서 30 분 동안 솔루션 원심
- Pipetting으로 슬라이드 채널의 출구 포트에서 차단 솔루션의 나머지 부분을 제거 합니다. ICAM-1와 streptavidin 엔트리 포트에 포함 된 솔루션의 100 µ L를 주사.
- 실 온에서 45 분에 대 한 슬라이드를 품 어. 출구 포트에서 단백질 해결책의 어떤 과잉을 제거 합니다. 씻어 bilayer 2 채널의 입력 포트에 분석 결과 버퍼의 100 µ L를 먼저 주입 하 고 출구 포트에서 100 µ L를 즉시 제거 하 여 x.
- 2 µ g/mL의 최종 농도에 분석 결과 버퍼와 알 렉 사-형 석-488-셔 서 반대로 CD3 항 체 희석. 슬라이드의 엔트리 포트에 항 체 솔루션의 100 µ L를 주사 하 고 실 온에서 45 분 동안 품 어. 출구 포트에서 단백질 해결책의 어떤 과잉을 제거 합니다. Bilayer 2 세척 단계 3.11에서와 같이 분석 결과 버퍼의 100 µ L x.
4. 평면 Bilayer와 T 세포 상호 작용의 이미징
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무대와 confocal 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경의 목표 온도 37 ° c.에 equilibrated 때까지 예 열 열띤된 무대에는 bilayer(s)와 함께 슬라이드를 설정 합니다. 잉크 자국에 따라 적절 한 위치에 무대를 이동 하 고 사 셔 서 ICAM-1 분자의 형광을 채용 하는 bilayer에 초점.
- Confocal 현미경에 대 한 61 X 목표 또는 100 X 목표를 사용 하 여 적절 한 필터 설정으로 TIRF 현미경에 대 한.
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과 립에 대 한 이미징 TIRF 현미경 분리, 알 렉 사 Fluor-568-표시 된 안티-CD107a를 추가 엔트리 포트에 세포를 주입 하기 전에 4 µ g/mL의 최종 농도에 세포 현 탁 액에 항 체 Fab 조각.
- 준비 된 CD4 resuspend+ T 세포 선 또는 PB 또는 코드에서 격리 혈액 및 슬라이드 채널을 포함 하는 bilayer의 엔트리 포트에 세포 현 탁 액의 50 µ L를 주입.
- 주사 후 필드의 원하는 숫자와 30 분 동안 2 분 마다 x 각 필드 1의 이미지를 기록을 선택 합니다.
- 밝은 분야, 반사 빛, 및 형광 채널 (알 렉 사 488와 Cy5)는 이미지 공초점 현미경의 이용. TIRF 모드를 사용 하 여 알 렉 사-형 석-488와 알 렉 사-형 석-568 형광와 Cy5 형광, 뿐만 아니라 밝은 필드 이미징, TIRF 현미경에 widefield.
5. 이미지 분석
- 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 인수 이미지 분석. 전송 된 가벼운 이미지와 제외 클러스터와 눈에 띄게 손상 또는 apoptotic 세포 분석에서 셀 형태를 관찰 합니다. 생산적 bilayer 표면 (즉, 인터페이스에 알 렉 사-형 석-488 형광 (안티-CD3 항 체)를 축적 하는 세포)와 상호 작용 하는 셀에만 분석에 포함 됩니다.
- 셀 bilayer 상호 작용의 개시 후 20 분에 셀 접착 영역의 크기를 결정 합니다.
참고: 접착 지역 방해 반사 현미경 (IRM) 이미지에 셀 bilayer 인터페이스에서 개발 된 어두운 영역이입니다.
- 셀 bilayer 인터페이스에서 차별 Cy-ICAM-1 분자 Cy5-ICAM-1 형광의 어떤 축적과 링 접합의 형성을 관찰 합니다. 누적된 ICAM-1 분자 두 개 이상의 연속 이미지에 접착 링 접합 형성, 세포는 주변 supramolecular 활성화 클러스터 (pSMAC)12개발로 같은 셀을 지정 합니다.
- 셀에 가까운 근접에서 연락처 영역 밖에 배경 형광에 T 세포 bilayer 인터페이스에 알 렉 사-형 석-568 형광 강도 측정 하 여과 립 자료를 평가 합니다. Degranulating 셀 셀 배경의 알 렉 사-형 석-568 신호-를-적어도 1.3의 비율을 지정 합니다.