Paracrine 신호 세포 사이 공부 하는 인접 문화 방법

암 세포와 종양 진행 성에 서 종양 microenvironment 간의 생산적인 상호 상호 작용의 역할을 잘 설립 되었습니다 그리고 암 생물학¹연구의 주요 초점 되고있다. 상처 치유, 면역 반응, 신생, 줄기 세포 벽, 그리고 개발^2,,34,,56 양방향 신호에의 유사한 인스턴스는 중요 한 ^{, 7 , 8}.이 모든 생물 학적 과정에 공통 주제는 셀 셀 운명, 조직 생리학, 및 질병의 진행을 결정 하는 그들의 microenvironment에서 extracellular 신호를 다양 한 방법으로 응답. 따라서, 초점 같은 셀 셀 통신에 관련 된 메커니즘의 더 나은 이해를 개발 하는 쪽으로 점점 돌았다. 이러한 상호 작용의 대부분 paracrine 또는 juxtacrine 세포 사이 신호를 포함 한다. Paracrine 신호 juxtacrine 반면^9,10, 그것에 대 한 응답을 트리거하는 근처에 다른 셀에 해당 수용 체에 의해 인식 되는 한 특정 신호 요소의 분 비를 포함 한다 신호 두 셀 관련된^11,12의 세포질 구성 요소 간의 직접 접촉을 해야합니다.

이러한 신호 종양 microenvironment에서 뿐만 아니라 조직 항상성에 중요 한 구성 요소입니다. 암 세포 종양 기질, 암 관련 된 섬유 아 세포 (CAFs), adipocytes^13,,1415,16, 면역 세포 등의 세포에서 paracrine 및 juxtacrine 요인 으로부터 혜택을. Paracrine 신호 juxtacrine 신호 하는 것은 juxtaposed ligands 노치 신호, 또는 integrins 및 그들의 각각 사이 상호 작용 수용 체를 포함 하는 동안 성장 인자, cytokines, 발산, 등에 의해 중재 될 수 있습니다. 세포 외 기질 단백질입니다. 우리는 종양 진행 및 전이¹⁴난소 암 세포 및 CAFs 사이 상호 상호 작용의 중요성을 증명 하고있다. 마찬가지로, metastasizing 난소 암 세포 전이의 사이트 취재 mesothelial 세포와의 상호 작용을 규제 키 microRNAs 전이성 식민^17, 를 승진 시키는 암 세포에 녹음 방송 요인 ¹⁸.

Paracrine 신호에 대부분 연구 조건된 매체와 두 번째 셀 유형을 치료 하 한 셀 형식에서 수집 된의 사용을 포함 한다. 이 방법은 널리 이용 되는, 하는 동안 그것은 효과적으로 받는 셀의 microenvironment에 secreted 요소의 지역화 된 고 농도 레벨을 복제 하지 않습니다. 그것은 또한 재현 한 세포에 의해 생산 되는 secreted 요소의 연속 흐름의 활동에 실패 하 고 인접 셀을 받은. Paracrine 신호 secreted 요소 소스 셀 근처만 필요한 농도 고 무마 하 고 밖으로 희석 거리 증가 하는 경향이 짧은 거리에 효과적 이다. 이 지역화 된 높은 농도의 secreted 요소 수용 체 셀에 응답 필수적입니다. 또한, 응답 받는 사람 세포에 새로 분 비 요인과 저하, 바인딩, 및 받는 사람 세포와 소스 셀에서 확산에 국제화를 통해 그들의 지속적인 고갈의 균형에 의존 이기도합니다. 바른된 매체 높은 지역화 된 농도 microenvironment에 대 한 계정에 집중 될 수 있지만 그 정확 하 게 정확한 농도 복제할 수 없습니다. 또한, 그것은 생산의 자연 활동 및 관련된 요인의 고갈 모방 수 없습니다. 더 정확 하 게 복제 paracrine 신호 juxtacrine 신호 메커니즘에서에서 분리, 우리는 성장 하는 다공성 막의 어느 표면에 2 개의 세포 유형 포함 소설 인접 문화 방법의 고안 했다. 숨 구멍은 충분히 juxtacrine 상호 작용을 방지 하 고 아직 지역화 된 높은 농도에서 분 비 요인의 교류를 허용 하는 작은. 그런 식으로,이 시스템 생산의 활동 그리고 paracrine 요인의 소모를 유지합니다.

프로토콜은 인디애나 대학의 제도적 규제 위원회의 지침을 따릅니다.

1. 세포 준비

1. 절연 및 인간의 기본 mesothelial 세포의 문화
   1. 격리 인간의 기본 mesothelial 세포 (HPMCs) 인간의 omentum^17,18 위에서 설명한 고에 그들을 성장에서 성장 매체 [Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 포함 된 완료 페니실린-스, 1% 비 본질적인 아미노산, 및 1% 비타민] 37 ° C, 5% CO₂.
      참고:는 HPMCs는 100% 합류 (그림 1A)에 일반적으로 성장 된다.
2. 난소 암 세포의 성장 조건
   1. 37 ° C, 5% CO₂에서 완전 한 성장 매체에 HeyA8 난소 암 세포 성장.
      참고: 사용 HeyA8 세포 성장된 약 80% 합류 (그림 1B).

2. 세포 배양

1. 인접 문화 설정
   1. 사용 Transwell 0.4 μ m (10⁸ 모/cm²) 공과 4.67 cm² 성장 지역으로 10 μ m 두께 조직 문화 처리 폴 리 카보 네이트 막으로 6 잘 플레이트에 대 한 삽입합니다. 필요한 경우, 성장 영역에 따라 시드 셀의 수를 확장 하 여 다른 삽입 크기에 대 한 최적화. 따뜻한 완벽 한 성장 매체, 트립 신, 그리고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 37 ° c 사용 하기 전에.
2. 삽입을 준비 하 고
   1. 삽입의 막의 낮은 표면에 HeyA8 셀 씨앗 소독 집게를 사용 하 여 포장에서 삽입을 제거 하 고 살 균 15 cm 문화 접시에 거꾸로 배치.
   2. 그것이 거꾸로 삽입을 수용 하거나 어떤 적절 한 살 균 컨테이너와 대체 깊이 15 cm 접시를 사용 합니다. 실험에 따라 15cm 접시에 삽입의 필요한 수를 놓습니다.
   3. 레이블 컨트롤 세 개 및 3 개의 실험 조건 따라 삽입의 가장자리에 표시와 함께.
3. 암 세포 준비
   1. 25 c m² 플라스 크 (2 ~ 10⁶ 셀 x) 합류 점 80%에 성장 하는 HeyA8 세포 trypsinize, 40-60 s에 대 한 트립 신 (0.25%)의 1 mL를 추가 하 고 완전 한 성장 매체의 6 mL와 트립 신을 중화.
   2. 실내 온도 (RT) 3 분 동안에 500 x g 에서 세포를 원심, 상쾌한, 삭제 하 고 완전 한 성장 매체의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend. Trypan blue 염료 제외 메서드를 사용 하 여 라이브 셀을 계산 합니다.
4. 암 세포를 뿌리기
   1. 완전 한 성장 매체에 라이브 HeyA8 셀의 100000 셀/mL를 일시 중단 합니다. 신중 하 게 (지금 직면 하 고, 반전은 이후) 삽입의 하단에 완전 한 성장 매체의 800 μ에 80000 HeyA8 셀 씨.
   2. 셀 삽입 (그림 1C)에 남아 있도록 돔 모양 형성 세포 씨앗 막의 센터에서 시작 하 고 천천히 pipetting 동안 동심원에서 바깥쪽으로 이동. 매체의 어떤 유출 방지 하기 위해 가장자리에서 3 m m 이상가 하지 마십시오.
      참고: 시드 셀의 수는 세포의 성장 속도 실험의 기간에 따라 달라 집니다. HeyA8 셀이 인접 문화에 대 한 시드 수 최적화 했다 고 셀 3 일간의 끝에 80-90% 합칠을 될 것입니다.
5. 암 셀 첨부 파일
   1. 15 cm 접시를 커버 하 고 신중 하 게 CO₂ 배양 기에 삽입을 포함 하는 접시를 이동 합니다. 그것은 매체 및이 단계에서 삽입에 셀의 드롭 방해 중요입니다. 암 세포는 삽입을 연결할 수 있도록 4 h 37 ° C에서 세포를 둡니다.
6. Mesothelial 세포 준비
   1. 약 4 h 후 trypsinize HPMCs 1-2 분에 대 한 트립 신 (0.25%)의 2 개 mL와 75 c m² 플라스 크 (4 ~ 10⁶ 셀 x) 합류 점 100%에 성장 하 고 완전 한 성장 매체의 12 mL와 트립 신을 중화.
   2. 500 x g RT에 3 분에 세포를 원심, 완전 한 성장 매체의 10 mL에 셀 펠 릿 resuspend 고 trypan blue 염료 제외 메서드를 사용 하 여 라이브 셀.
7. Mesothelial 세포 시드
   1. 완전 한 성장 매체에 라이브 HPMCs의 300, 000 셀/mL를 일시 중단 합니다. 6 잘 플레이트의 각 음에 신선한 완전 한 성장 매체의 2.5 mL를 추가 합니다. 조심 스럽게 biosafety 후드에 밖으로 삽입을 포함 하는 15 cm 접시 가져. 소독 집게를 사용 하 여 삽입을 플립 하 고 완전 한 성장 매체 (그림 1C)에 낮은 표면에 부착 된 HeyA8 세포와 직 립, 그렇게 6 잘 플레이트의 우물에 두십시오.
   2. 씨앗 450000 HPMCs HPMC 컨트롤에 대 한 HeyA8 셀 없이 삽입 (그림 1C) 우물의 아래 직면 하 고 표면에 연결 하는 HeyA8 세포와 삽입의 안쪽에 성장 매체의 1.5 mL 중에 일시 중지. HeyA8 컨트롤에 세포 없이 성장 매체의 1.5 mL를 추가 합니다.
8. 성장 하는 인접 문화
   1. 인접 문화 72 h에 대 한 37 ° C, 5% CO₂ 에서 CO₂ 인큐베이터에서 성장 하자. 필요한 경우, 매체를 다음과 같이 보충 수 있습니다.
      1. 삽입의 내부에 대 한 750 µ L을 제거 하 고 신선한 완전 한 성장 매체의 750 µ L를 추가 합니다.
      2. 삽입 (6 잘 플레이트)의 외부에 대 한 1 mL을 제거 하 고 신선한 완전 한 성장 매체의 1 mL를 추가 합니다. 1 mL 변경 한 번에 매체의 편의 위해 선택 되었다. 원하는, 1.25 mL은 제거 하 고 대신 대체 수 있습니다.
9. 셀을 수집
   1. 인접 문화의 72 h 후 세포를 수집 합니다. HeyA8 셀과 HPMCs Trypsinize의 교차 오염을 방지 하기 위해이 단계에서 특별 한 주의 셀, 그들, 원심 고 교차 오염을 방지 하기 위해 멤브레인에 세포를 lysing 대신 펠 릿을 lyse.
10. Trypsinizing 셀
    1. 1 x PBS와 삽입의 양쪽 모두를 씻어.
    2. 새로운 우물을 삽입 전송 하 고 트립 신을 추가 합니다. 삽입의 안쪽에 트립 신 0.5 mL을 추가 하 고 trypsinize는 삽입의 낮은 표면에 부착 된 암 세포를 6 잘 플레이트 trypsin의 2 개 mL를 추가. 37 ° c.에 2 분 동안 접시를 품 어
11. 중화는 트립 신
    1. 중화 하는 트립 신, 아래로, 플라스틱 그리고 다음 셀을 받아 고 레이블된 컬렉션 튜브에 그들을 전송 삽입의 내부에 완전 한 성장 매체의 1 mL를 추가 합니다. 완전 한 무력화에 대 한 완전 한 성장 매체의 추가적인 2 mL를 추가 합니다. 하지 막 세포의 교차 오염을 방지 하기 위해 pipetting 동안 피어스를 주의 한다.
    2. 삽입의 하단에 있는 세포를 수집, 그 2 mL trypsin 플라스틱 추가 단계 12.2 아래쪽 표면에서 2-3 배 셀 6-잘 접시의 바닥에가. 성장 매체의 6 mL 접시의 하단에 트립 신을 무력화 하 고 레이블된 컬렉션 튜브 플레이트의 내용을 전송.
12. 수집 하 고 세포를 lysing
    1. 500 x g 3 분에 세포를 원심 하 고 미디어를 발음. Resuspend 및 RNA 추출에 대 한 페 놀 및 guanidine-안산-기반 세포 시 약의 0.7 mL와 함께 셀 펠 릿을 lyse. 어떤 적당 한 키트를 사용 하 여 RNA를 분리.

3. 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응

참고: 다음 단계 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 인접 문화 결과로 유전자 식 변화 연구를 설명 합니다.

1. 정량에 대 한 RNA 샘플에서 cDNA를 준비 합니다. 해당 버퍼와 무작위 뇌관 어떤 적당 한 역전사를 사용 하 여 모든 mRNA의 반전 녹음 방송을 위해 ( 재료의 표참조).
2. Fibronectin (FN1) 및 E-cadherin (CDH1)의 mRNA 식 수준에 변화를 평가 하 고 변형 성장 인자 베타 1 (TGFβ1) glyceraldehyde 3 인산 염 효소 (GAPDH)는 내부 제어와 정량에 의해. 표준화 된 상용 유전자 표정 분석 실험 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 뇌관 디자인 가능 하다.
3. HPMC 컨트롤과 인접 문화에서 성장 하는 HPMCs와 HPMCs HeyA8 컨트롤과 인접 문화에서 성장 하는 HeyA8 셀을 비교 합니다.

Metastasizing 난소 암 세포 mesothelial 세포 전이 복 막 구멍19내 사이트에서 발생합니다. 생산적 paracrine juxtacrine 상호 작용 유도 성공적인 전이17,18,20,21 난소 암 세포의 적응 응답에 mesothelial 세포의 도움으로 . 인접 문화 방법의 효과 테스트 하려면 테스트 HeyA8 난소 암 세포와 HPMCs 사이 paracrine 상호 작용. 그것은 이전 HPMCs와 HeyA8 세포의 coculture HPMCs21fibronectin의 증가 식에 결과 보고 되었습니다. Fibronectin 식의이 유도 HeyA8 셀21에 의해 TGFβ의 증가 분에 의해 중재 됩니다. 따라서, 이러한 두 셀에서 mRNA 수준의 fibronectin과 TGFβ에 HeyA8 세포와 HPMCs의 인접 문화의 효과 테스트. 예상 했던 대로, HeyA8 세포와 인접 문화 (그림 2A) 낮은 표면에 부착 된 HeyA8 셀 없이 삽입에 시드 했다 컨트롤에 비해 HPMCs에 fibronectin의 증가 식에 결과. 마찬가지로, 셀 전 (그림 2B)에 TGFβ의 증가 식에 결과 HeyA8와 HPMCs의 인접 문화. Fibronectin과 TGFβ의 표현 또한 크게 HPMCs 했다 (그림 2C 및 2D) 삽입의 상부 표면에 시드되지 않습니다 컨트롤에 비해 HPMCs와 인접 문화 시 HeyA8 세포에서 증가 했다.

고전적인 조건된 중간 접근의 효과 비교, 우리는 HPMC 조절 매체와 HeyA8 세포 치료 실험 수행. Fibronectin 식 감소 및 TGFβ HeyA8 셀 HPMC 조절 매체와 치료에 중요 한 변화 이었다. (그림 3A 그리고 3B). 우리는 또한 인접 문화에서 중화 항 체와 secreted TGFβ 차단의 잠재력을 테스트 했습니다. TGFβ 중화 항 체 치료 결과 HPMCs (그림 3C)와 인접 문화에서 HeyA8 셀에 TGFβ의 유도에 상당한 감소. 그러나, TGFβ 중화 항 체 약간 증가 제어 HeyA8 셀에 TGFβ 식 아마 보상 응답 (그림 3C).

또한, 우리는 또한 전자 cadherin 상피 마커의 식 수준에 인접 문화의 효과 테스트. HeyA8 셀과 인접 문화 HPMCs (그림 2E)에서 E-cadherin 식, 약간 증가 하는 동안 전자 cadherin 표시 감소 컨트롤 (그림 2F)에 비해 HPMCs의 근접에서 성장 하는 HeyA8 세포에서 관찰 되었다. 함께 찍은, 이러한 결과 입증 paracrine 난소 암 세포와 정상 세포 두 세포 유형 동안에 유전자 발현에 영향을 주는 전이의 사이트에서 신호를 공부 하 고 인접 문화 시스템의 효과 전이성 식민의 과정입니다.

그림 1: 인접 문화 시스템의 조립. (A)이 패널 쇼 인간의 기본 mesothelial 세포 (HPMCs). (B)이이 패널 HeyA8 난소 암 세포를 보여줍니다. 스케일 바 = 200 µ m (A-B). (C) HeyA8 세포는 transwell의 낮은 표면에 시드 했다 0.4 µ m 숨 구멍으로 삽입 합니다. 셀 연결 된, 일단 삽입 성장 매체를 포함 하는 6-잘 접시의 우물에 배치 했다. 그렇게 그들은 상부 표면에 부착 된 막에 의해 HeyA8 세포에서 분리 되었다 mesothelial 세포 삽입에 시드 다음 했다. 0.4 µ m 모 공 막의 교환 허용에서 요인 분 비 하지만 셀 사이 어떤 직접 접촉 저해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: mRNA 표현에 인접 문화의 효과. 처음 두 패널 표시 (A) fibronectin 및 인간의 기본 mesothelial 세포 (HPMCs)에서 (B) TGFβ1 식 정량 제어 HPMCs에 비해 HeyA8 셀에 proximally 경작. 다음 두 개의 패널 표시 (C) fibronectin 및 HeyA8 세포에서 (D) TGFβ1 식 정량 HPMCs에 proximally 경작, 세포 제어 Heya8에 비해. 마지막 두 패널 표시 E cadherin 식 정량 (E) HPMCs HeyA8 세포와 (F) HeyA8 셀 HPMCs. N proximally 경작에 proximally 교양 3, = * p < 0.01. 오차 막대는 3 개의 반복의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 인간의 기본 mesothelial 세포 (HPMC)의 효과-HeyA8 세포의 mRNA 표현에 중간 처리 조절. 최고 2 개의 패널 HeyA8 셀 fibronectin (A)와 (B) TGFβ1 식에 대 한 정량 보여줍니다. (C)이 마지막 패널 HPMCs. N 인접 문화에 HeyA8 TGFβ1 식에 중화 항 체 (TGFβ1 Ab)와 TGFβ1 분 비를 억제 하는 효과 보여줍니다 3, = * p < 0.01. p < 0.05입니다. 오차 막대는 3 개의 반복의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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