여기, 우리가 격리, 확장, 및 개 난소 조직 으로부터 간 엽 줄기 세포의 분화 하는 방법을 설명합니다.
중간 엽 줄기 세포 (MSCs)에 대 한 관심은 절연, 확장, 및 문화의 그들의 용이성으로 인해 지난 10 년간 증가 했다. 최근에, 연구는 이러한 세포 넓은 차별화 용량을 증명 하고있다. MSCs에서 풍부 하 고 생물학 낭비로 ovariectomy 수술 후 자주 취소 됩니다는 사실 때문 난소 세포 기반 치료를 위한 유망한 후보자를 나타냅니다. 이 문서에서는 격리, 확장에 대 한 절차를 설명 합니다 및 MSCs의 세포 분류의 필요성 없이 개 난소에서 파생 된 기술. 이 프로토콜은 임상 시험에서이 매우 구별할 세포의 광범위 한 적용으로 인해 재생 의학에 대 한 중요 한 도구 나타내고 치료 사용.
줄기 세포에 초점 년간 과거, 강력한 재생 의학 치료 발견의 집단 목표에 의해 연료 되었습니다 연구 노력을 실질적으로 증가 했다 출판된 연구의 수입니다. 줄기 세포는 두 개의 기본 정의 마커: 자기 혁신과 차별화. 중간 엽 줄기 세포 정기 조직 회전율에 대 한 책임은 고1배아 줄기 세포 비해 분화의 보다 제한 된 용량을가지고. 최근에, 많은 연구 다양 한 MSCs의 그리고 논의 중인 주제는 배아 및 성체 줄기 세포 간의 차이점 모든2에 존재 하는 여부.
Ovarium 표면 상피는 커밋되지 않은 세포의 층, 상대적으로 덜 분화, 두 상피와 중간 엽 마커3, 유지 하는 다른 종류의 세포에 대 한 응답에서으로 분화 하는 능력을 표현 하는 환경 신호4. 줄기 세포는 난소에서의 정확한 위치는 잘 알려진; 그러나, 그것은 bipotential 창시자 tunica albuginea에서 생식 세포5일으키 제안 되었습니다. 이러한 셀 stromal 기원6 또는에 있는 또는 난소 표면7에 인접 면역학 연구 가설 있다. 이후 중간 엽 줄기 세포 세포 접착8에 중요 한 역할을 재생 하는 수많은 수용 체를 표현, 실험 가설을 급속 한 접착을 가진 세포의 인구를 선택 하면 명확 하 게 세포의 인구를 분리 하는 것을 테스트 하도록 설계 되었습니다. 실제로 엽으로 characterizable. 최근, 우리의 그룹 문화의 첫 번째 3 h 문화 접시의 플라스틱 표면에 접착의 급속 한 접착9전시 세포의 순화 된 인구를 얻기 위하여 그들의 용량에 따라 난소 조직에서 MSCs의 파생을 했다. 여기는 난소 조직 으로부터 간 엽 줄기 세포 분리를 위한 개발된 방법에 설명합니다.
이 실험은 4 개의 잡종 여성 개 개 살 균 프로그램에 선택 수술 후 기증의 난소와 함께 수행 되었다. 이 실험은 UNESP-FCAV (프로토콜 번호 026991/13)의 동물의 사용에 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 실험 준비
2. 난소에서 중간 엽 줄기 세포의 분리
3. 난소에서 중간 엽 줄기 세포의 확장
4. 난소에서 중간 엽 줄기 세포의 분화
참고: 차별화 분석 힐 외 에 설치 하는 지침에 따라 수행 했다 9.
여기 증거 MSCs ovariectomy 후 생물 학적 폐기물 이라고 여겨진다 개 난소 조직 으로부터 격리 될 수 있습니다 제공 합니다. 사실은 많은 세포 유형 난소에서 찾을 수 있습니다, 우리 구와 같은 형태와 단층에서 성장 하는 셀을 성공적으로 선택, 플라스틱에 그들의 급속 한 준수에 따라 MSCs를 선택 하는 프로토콜을 제안 했다.
골 수에서 MSCs의 파생의 첫 번째 보고서는 문화11;의 첫 번째 48 h 동안 MSCs의 플라스틱 접착 용량에 따라 그러나,이 방법은 이종 인구 phenotypically 및 분리 기능, 적어도 골12에 대 한 잠재력을가지고 보고 되었습니다. 제안 된 문화 메서드는 또한 플라스틱 접착 용량으로 셀을 선택 하 고 있는 바람직한 셀 정렬의 필요성 없이 많은 세포 유형, 조직에서 중간 엽 세포를 분리. 사실은 세포 접착8에 중요 한 역할을 재생 하는 수많은 수용 체를 표현 하는 중간 엽 줄기 세포, 급속 한 접착을 가진 셀의 인구 선택 했다, 그것은에서 더 균질 인구 귀 착될 것입니다 그 가설 이었다는 첫 번째 통로, 신뢰할 수 있는 MSC 프로필입니다. 대표 결과 짧은 기간 플라스틱 접착 시험 고급 구절에 대 한 대기의 필요성 없이 첫 대목에서 MSCs의 형태학 상으로 균질 인구를 분리 하는 데 사용할 수 있습니다 또는 정렬 셀 증거를 제공 합니다.
이 프로토콜에서 중요 한 단계는 문화의 시작 후 3 h 미디어를 변경 하는. 대표적인 결과 섹션 에서처럼 개 난소에서 얻은 줄기 세포 조건에 3 MSCs의 특성에 대 한 설립: 그들은 섬유와 같은 형태를 전시, MSC 마커의 존재에 대 한 긍정적인 했다 고 했다 osteogenic, adipogenic 및 chondrogenic 혈통으로 계보 같은 엽으로 차별화 하는 수 있습니다. 이 실험에서 고립 세포 endodermal 선구자, ectodermal 계보, 및 원시 생식 세포 계보에도 성공적으로 분화 되었다. 셀 초기 도금 후 약 5-7 일 합류를 도달 한다. 고급 나이 가진 동물에서 세포 수 있습니다 젊은 동물의 그들 보다는 더 느리게 성장 하 고, 그의 적은 셀 플라스틱을 준수 수 있습니다. 이러한 경우에는 미디어에서 FBS의 농도 15%로 늘릴 수 있습니다.
따라서, 더 빠른 준수 용량 셀에 따라 MSCs에 대 한 선택, 유선형, 저렴 하 고 효과적인 절차를 나타냅니다. 치료 관점에서이 세포 감 별 법의 그들의 넓은 범위 때문에 특히 재생 의학에 대 한 유망한 도구 나타내는 강조 하기 위해 가장 중요 하다.
The authors have nothing to disclose.
DPBS | Thermo Fisher | 14190144 | |
Collagenase I | Thermo Fisher | 17100017 | |
Tissue flask | Corning | CLS3056 | |
DMEM low glucose | Thermo Fisher | 11054020 | |
FBS | Thermo Fisher | 12484-010 | |
TrypLE express | Thermo Fisher | 12604021 | |
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007001 | |
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007101 | |
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007201 | |
STEMdiff Definitive Endoderm Kit | StemCell | 5110 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | |
CD45 | AbD Serotec | MCA 2035S | |
CD34 | AbD Serotec | MCA 2411GA | |
CD90 | AbD Serotec | MCA 1036G | |
CD44 | AbD Serotec | MCA 1041 | |
Nestin | Milipore | MAB353 | |
β-Tubulin | Milipore | MAB1637 | |
DDX4 | Invitrogen | PA5 -23378 | |
IgG- FITC | AbD Serotec | STAR80F | |
IgG- FITC | AbD Serotec | STAR120F |