Biopanning에서 t 7 살 균 소의 양이 많은 PCR

요약

재현, 정확 하 고 시간이 효율적인 정량 PCR (정량) 방법 살 균 소 T7 열거 하는 여기에 설명 되어 있습니다. 프로토콜에는 살 균 소 게놈 DNA 준비, PCR 반응 준비, 정량 자전거 조건, 및 정량 데이터 분석 명확 하 게 설명합니다.

초록

이 프로토콜 T7 페이지 페이지 선택 실험 (즉, "biopanning")에서 열거 하 양이 많은 PCR (정량)의 사용을 설명 합니다. 정량은 DNA, 계량에 형광 기반의 접근 그리고 여기, 살 균 소 게놈 살 균 소 입자에 대 한 프록시로 계량에 적응. 이 프로토콜에서 추가적인 DNA 정화 없이 높은 온도 난방을 사용 하 여 손쉬운 살 균 소 DNA 준비 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 열 처리 페이지의 작은 볼륨 및 정량 반응의 작은 볼륨에만 필요합니다. 정량은 높은 처리량 및 빠르고, 처리 하 고 다른 페이지 열거 방법에 2-4 헤 비교에에서 반응의 96 잘 접시에서 데이터를 가져올 수, 정량 시간 효율적입니다. 여기, 정량은 낭 성 섬유 증 같은 점액 모델 생체 외에서 biopanning에서 식별 T7 페이지를 열거 하는 데 사용 됩니다. 정량 방법 척도 biopanning의 다른 종류를 포함 하 여 다른 실험에서 T7 페이지를 확장할 수 있습니다 (예., 단백질 바인딩, vivo에서 움직일 수 살 균 소 심사) 및 기타 소스 (예: 시스템 또는 체액). 요약 하자면,이 프로토콜 DNA 캡슐화 바이러스 척도를 수정할 수 있습니다.

서론

살 균 소 (살 균 소) 디스플레이 기술, 1985 년, 조지 스미스에 의해 개발은 대상 또는 세포 막, 질병 항 원, 세포 세포 또는 특정 수용 체에 대 한 펩 티 드 또는 단백질 ligands를 식별 하는 강력한, 높은 처리량 접근 장기 고 지난 2 년간^1,2조직. 여기, polypeptides 또는 단일 체인 항 체의 임의의 라이브러리 페이지 (일반적으로 M13 또는 T7)의 외 투 단백질에 표시 되 고 특정 ligands 고정된 단백질에 생체 외에서 또는 vivo에서 이동에서 확인할 수 있습니다. 반복 선택 과정을 통해 생물 시스템입니다. 다음, ligands 질병^3,4의 진단 및 치료에 대 한 이미징 또는 치료 에이전트와 결합 될 수 있습니다. 그것은 정확 하 게 biopanning의 여러 단계 중 페이지를 열거 하는 중요 한: (1) 계량 기판에 바인딩할 페이지 (2) 하 고 선택의 각 라운드 농축 인지 확인 하려면 페이지를 계량 (살 균 소 농축 나타냅니다 biopanned 살 균 소 선호도 대상에 대 한)입니다. 정량화, 더블 레이어 패 ....

프로토콜

1. 뇌관 디자인 및 T7 살 균 소 게놈 DNA에 대 한 분석

1. T7 살 균 소 게놈 DNA의 확대를 위한 뇌관 디자인.
   참고: F (앞으로)와 R (반전) 뇌관 ( 재료의 표참조) T7 DNA 순서를 증폭 라이브러리 변수 영역 (그림 1) 상류에 위치.
2. 용융 온도 (Tm), 백분율 GC 내용 (GC %), 뇌관 이합체, 머리 핀 형성 및 PCR 적합성 (그림 1)를 포함 한 뇌관의 매개 변수를 평가 하는 적절 한 뇌관 분석기를 선택 하십시오.
3. 뇌관 oligonucleotides (oligos), 주문 그리고 도착 시 DNase과 RNase 무료 울트라 순수 물 1.5 mL 원심 분리기 튜브, 100 µ M 재고 농도 확인 하 고 몇 달 동안-20 ° C에서 저장에 동결 건조 된 oligos resuspend.
4. 100 µ M 뇌관의 여러 aliquots (각 1.5 mL 튜브에 약 50 µ L)을 확인 합니다.
   참고:이 단계는 자주 freeze-thaw 주기를 방지 하기 위해 사용 됩니다.

2. t 7 살 균 소 게놈 ....

결과

정량 Pcr 뇌관 디자인 다른 뇌관 디자인 도구를 사용할 수 있습니다. 일반적으로, 뇌관 디자인 프로그램은 그들의 자신의 내장 알고리즘을 계산 하 고 뇌관, 예를 들어, GC %, Tm, 뇌관 이합체 또는 머리 핀 형성 등 의 중요 매개 변수 일반적으로, 주요 기준은 다른 유사 뇌관 설계 도구, 및 뇌관 그들의 지침에 따라 설계할 수 있습니다. 뇌관 폭발 뇌관의 특이성을 확인을 사용할 수 있습니다. 1 개의 뇌관 쌍 게놈 DNA를 그림 1에 나와 t 7의 변수 영역의 상류를 대상. 살 균 소 샘플에서 biopanning, 절대 알 수 없는 농도 결정 하기 위해 정량화 접근-표준 곡선 정량화-살 균 소 게놈 DNA 복사본을 열거 하 선정 되었다. T7 살 균 소 DNA를 참조 (참조 자료) 알려진된 농도에서 0.1 µ g / µ L 직렬 1.0 x 10에서 희석은⁰ ~.......

토론

우리 살 균 소 게놈 DNA⁵, 계량을 정량 방법을 개발 하 고 우리가 여기 설명 T7 페이지 CF 같은 점액 장벽에 대 한 선정을 열거 하는 정량 방법을 적응. 간행물의 양적 실시간 PCR 실험 (MIQE) 지침에 대 한 최소 정보 개발 T7 페이지¹⁵의 열거에 대 한 정량 방법의 유효성을 검사 하 적응 했다. 우리는 biopanning 실험에서 페이지 척도를 개발 하는 프로토콜은 시간 효율적, 안정적이 고 경제적인 방법입니다. 정량 샘플 준비를 위해 우리의 프로토콜만 살 균 소 솔루션의 높은 온도 치료 (100 ° C, 15 분)을 사용 하 고 살 균 소 DNA 추출 및 정화 단계 기존의 전략^11,17,^{에 비해 요구 하지 않았다 18}. 또한, 살 균 소 입자, 더 정확 하 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
재료 및 시약
Primers for T7 genomic DNA	IDT		F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT
T7 Select packaging control DNA	EMD Millipore	69679-1UG
MicroAmp 광학 96웰 반응 플레이트	ThermoFisher Scientific	N8010560
qPCR 마스터 믹스--Power up SYBR Green 마스터 믹스	Applied biosystems	A25742
MicroAmp 광학 접착 필름 키트	ThermoFisher Scientific	4313663
T7Select 415-1 클로닝 키트	EMD Millipore	70015	사용자 프로토콜 : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP
DNase I 솔루션	ThermoFisher Scientific	90083
24웰 트랜스웰 플레이트	Corning	3472
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O	Invitrogen	10977015
Phosphate Buffered Saline (1x)	Corning	21040CV
strong>Name	Company	카탈로그 번호	>Comments
Equipments
ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block	ThermoFisher Scientific	4453535
Heraeus Pico 21 마이크로 원심분리기	ThermoFisher Scientific	75002415
Fisherbrand Digital Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-370
HERMO SCIENTIFIC 멀티 블록 히터	ThermoFisher Scientific	모델:2001
Sorvall Legend X1 원심분리기	ThermoFisher Scientific	75004220
M-20 마이크로플레이트 스윙 버킷 로터	ThermoFisher Scientific	75003624
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Software
QuantStudio Real-time PCR 소프트웨어	ThermoFisher Scientific		v1.2
Real-time qPCR primer design	IDT
OligoAnalyzer 3.1	IDT

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